尿石症是尿路最常见的疾病之一，其中最常见的是肾结石和输尿管结石。其特点是发病率和复发率高。草酸钙结石是最常见的类型，占所有结石的90%以上^[1-2]。其与多种泌尿系统并发症相关^[3]，也常与高血压、慢性肾病和终末期肾病的风险相关^[4]。寻找安全有效的药物对于预防和治疗尿结石和降低尿结石的复发率具有重要的研究意义^[5]。

自拟排石汤方由金钱草、石韦、甘草、萹蓄、枳壳、木香、延胡索、淡竹叶、瞿麦9味中药组成，具有利尿通淋、活血化瘀、止痛、促排等作用。本研究通过乙二醇+氯化铵诱导大鼠草酸钙肾结石模型，进而阐明排石汤通过改善肾脏功能、抑制炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)释放，下调转化生长因子-β1(TGF-β1)/丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路表达的机制，考察其肾脏保护和抗炎作用的分子机制，寻找作用靶点及细胞信号通路。

1 材料与方法 1.1 实验动物

雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0006。实验动物使用许可证号：SYXK(津)2020-0008。

1.2 药物与试剂

排石汤由金钱草、石韦、甘草、萹蓄、枳壳、木香、延胡索、淡竹叶、瞿麦9味中药组成，购自天津医科大学第二医院，经由乙醇/氯仿提取后使用；TNF-α酶联免疫测定(ELISA)试剂盒(江苏晶美生物科技股份有限公司，货号：JM-01587R1)；IL-6 ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技股份有限公司，货号：JM-01597R1)；IL-1β ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技股份有限公司，货号：JM-01454R1)；TGF-β1一抗(英国Abcam公司，货号：ab229856)；p38 MAPK一抗(英国Abcam公司，货号：ab170099)；枸橼酸钾(PC，北京索莱宝生物科技有限公司，货号：C1010)；氯化铵(AC，上海生工生物工程有限公司，货号：A100621)；乙二醇(EG，上海生工生物工程有限公司，货号：A600199)。

1.3 动物模型制备与给药

40只SD大鼠在恒温25 ℃环境下适应性饲养1周。随机分为5组，每组8只，分别为正常组、模型组、枸橼酸钾组、排石汤低剂量组和排石汤高剂量组。正常组大鼠短暂喂食，其余组大鼠以1%乙二醇和2%氯化铵溶液(2 mL/只)灌胃造模方法造模，实验周期为28 d。本研究已通过实验动物伦理委员会批准，所有实验操作均严格遵守动物福利伦理指导原则进行。

药物干预与建模同时进行，枸橼酸钾组：在成石剂基础上按照10 mL/kg给予25%枸橼酸钾溶液灌胃。排石汤低剂量组以1.2 g/mL(生药剂量)的混悬液按照10 mL/kg给予灌胃；排石汤高剂量组以2.4 g/mL的混悬液按照10 mL/kg给予灌胃。正常组和模型组按照10 mL/kg给予0.9%氯化钠给予灌胃。

1.4 标本处理及采集

实验结束前1 d收集大鼠24 h空腹尿液，测定24 h尿量。取大鼠主动脉血，在4 ℃下以3 000 r/min离心5 min，离心半径10 cm，取血清用全自动生化检测仪测定血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)值；使用ELISA法测定炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β含量，并严格按照试剂盒说明书进行检测。收集血清，大鼠处死后取两侧肾称定质量，计算肾脏系数(双肾质量/体质量)。左肾以4%多聚甲醛固定，用于病理学观察，右肾置入-85 ℃冰箱冷冻保存。

1.5 肾脏病理形态学改变观察

经4%多聚甲醛固定的肾组织，不同浓度乙醇脱水，然后将肾组织进行封蜡处理，后制成5 μm切片。肾脏组织切片进行苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜400倍视野下进行肾脏组织病理学观察，采用Image-Pro Plus 6.0软件对图像分析。

1.6 免疫组化法测定肾组织TGF-β1蛋白表达

TGF-β1的表达石蜡切片脱蜡水化，抗原热修复，3% H₂O₂灭活30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，加抗TGF-β1抗体在4 ℃下孵育过夜。再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，苏木精复染。光学显微镜下观察，每张切片在放大400倍视野下，随机取6个不重叠视野拍照，以棕褐色着色点为阳性信号，采用Image-Pro Plus 6.0软件对图像分析。

1.7 Western blot法测定p38 MAPK

取100 mg肾组织剪碎，加入裂解液，提取总蛋白。在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，离心半径10 cm，取上清液。SDS-PAGE蛋白电泳，后转至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗p38 MAPK(1:1 000)和p-p38 MAPK(1:1 000)，4 ℃孵育过夜。漂洗3次，与二抗室温下孵育2 h后加ECL试剂显色。使用Quantum One分析并灰度计算p38 MAPK相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达量。

1.8 统计学方法

实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。多组间均数采用单因素方差分析(One-way，ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 排石汤对肾结石模型大鼠肾脏一般功能的影响

模型组大鼠24 h尿量显著低于正常组，而枸橼酸钾组及排石汤高、低剂量组24 h尿量均高于模型组(P＜0.01)，差异具有统计学意义(P＜0.01)。但枸橼酸钾组与排石汤低剂量组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。同时，与正常组比较，模型组肾脏系数明显增高(P＜0.01)，而枸橼酸钾组及排石汤高、低剂量组与模型组比较，肾脏系数显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表 1。

2.2 排石汤对肾结石模型大鼠血生化指标的影响

与正常组比较，模型组BUN、Scr水平明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示造模成功。同时，枸橼酸组和排石汤低、高剂量组BUN、Scr水平明显低于模型组(P＜0.01)。见表 2。

2.3 排石汤对肾结石模型大鼠肾脏病理的影响

HE染色草酸钙结晶显微镜下多为淡黄色结晶。正常组大鼠无结晶形成，细胞排列整齐、结构清晰，无明显病理改变。模型组大鼠肾脏可见多处草酸钙结晶沉积(黑色箭头所示)，部分区域肾组织损伤明显。枸橼酸钾组和排石汤低剂量组大鼠肾组织含钙结晶数量明显减少，肾小管的萎缩与扩张改善。排石汤高剂量组大鼠肾组织少见草酸钙结晶，肾损伤明显改善。见图 1。

2.4 排石汤对肾结石模型大鼠炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β的影响

各组炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β比较，差异均有统计学意义。与正常组比较，模型组TNF-α、IL-6及IL-1β均明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，枸橼酸钾组和排石汤低剂量组TNF-α、IL-6及IL-1β均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，两组之间TNF-α比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，但IL-6及IL-1β有统计学差异(P＜0.05)。排石汤高剂量组TNF-α、IL-6及IL-1β下降效果最为明显(P＜0.01)。见表 3。

2.5 排石汤对肾结石模型大鼠TGF-β1蛋白表达的影响

正常组TGF-β1表达较少(0.147±0.018)，模型组(0.534±0.020)、枸橼酸钾组(0.446±0.025)、排石汤低剂量组(0.387±0.016)和排石汤高剂量组(0.309±0.017)TGF-β1表达明显增加(P＜0.01)。与模型组比较，枸橼酸钾组和排石汤低、高剂量组表达水平明显降低(P＜0.01)。枸橼酸钾组与排石汤低剂量组，排石汤低剂量组与排石汤高剂量组之间差异也具有统计学意义(P＜0.05)。见表 4、图 2。

2.6 排石汤对肾结石模型大鼠p38 MAPK蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组p38 MAPK表达明显增高(P＜0.01)。与模型组比较，枸橼酸钾组，排石汤高、低两个剂量组均显著降低(P＜0.01)。同时橼酸钾组，排石汤高、低两个剂量组3个组别之间，也存在统计学差异(P＜0.01)。见图 3、表 5。

3 讨论

中医认为肾结石归属于“淋”“石淋”“尿血”的范畴，其病理机制为湿热蕴蒸持续时间长引起气血失调、瘀血阻滞^[6]，其治法当以通淋排石、清热利湿、补益脾肾为主^[7]。排石汤由金钱草、石韦、甘草、萹蓄、枳壳、木香、延胡索、淡竹叶、瞿麦等9味中药组成，方中金钱草具有清热、利尿、排石等功效，可用于泌尿系统感染、泌尿系结石、胆石症；石韦有利尿通淋、凉血止血的功效，用于热淋、血淋、石淋、小便不通、淋沥涩痛；延胡索活血、行气、止痛，具有显著的镇痛作用，并有一定的镇静与安定作用；枳壳理气宽胸，行滞消积。木香行气止痛。淡竹叶、萹蓄、瞿麦均具有清热泻火、利尿通淋之功效，其中淡竹叶还具有一定抗炎抑菌作用。

枸橼酸钾作为研究对照品，具有能够增加尿液pH值，促进尿结石排泄的作用。同时研究表明，枸橼酸钾能够降低尿草酸浓度，枸橼酸和尿中钙离子结合形成枸橼酸钙，降低尿中钙离子浓度和草酸钙饱和度，从而抑制了草酸钙结晶形成，抑制肾草酸钙结石形成^[8]。

草酸钙结石是肾结石基质最主要的结晶成分，草酸钙晶体诱导肾上皮细胞炎症损伤，促使肾上皮细胞发生黏附，同时促进草酸钙结晶的聚集。因此肾上皮细胞氧化应激及炎症损伤是结石形成的关键机制^[9]。本研究结果显示，排石汤方能有效降低肾结石大鼠模型血清中BUN和Scr的水平，且经过不同浓度的排石汤方治疗，肾结晶明显减少，肾损伤明显改善。排石汤方可以有效减少草酸钙结石大鼠的肾脏损伤，保护大鼠肾脏生理功能^[10]。p38 MAPK信号通路可被多种内源性和外源性刺激激活，包括炎症反应、氧化应激和活性氧物质(ROS)，该信号通路也主要介导细胞损伤、炎症反应和氧化应激。肾结石大鼠模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高，导致p38 MAPK信号通路被显著激活并产生TGF-β1，而后TGF-β1激活烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化酶，诱导ROS生成，ROS在细胞的分化、增殖以及凋亡中起着重要作用^[11-12]；同时ROS作为上游刺激因子，又可激活p38 MAPK等信号通路，并产生转化TGF-β1。两者共同作用导致肾上皮细胞自身凋亡、坏死。最终加重氧化应激损伤及炎症反应。本次研究结果表明，排石汤方有效降低肾结石大鼠模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，显著抑制TGF-β1蛋白表达和p38 MAPK信号通路的激活，从上下游抑制草酸钙结石的形成，改善肾损伤。

综上所述，排石汤可改善乙二醇+氯化铵诱导的肾损伤，降低炎性因子水平，抑制TGF-β1蛋白表达和p38 MAPK信号通路。为排石汤更广泛用于肾结石治疗提供必要的理论依据。本研究中草酸钙结石的减少，是否由其抑制草酸钙结石形成和其排石作用双重影响有待进一步研究。