2024, Vol. 41文章信息
- 杨家麟, 张超, 刘爱峰, 等.
- YANG Jialin, ZHANG Chao, LIU Aifeng, et al.
- 基于动物实验和网络药理学探讨复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的作用机制
- Mechanism of Fufang Shangtong Capsule in the treatment of femoral shaft fracture based on animal experiment and network pharmacology
- 天津中医药, 2024, 41(11): 1459-1467
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2024, 41(11): 1459-1467
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2024.11.17
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文章历史
- 收稿日期: 2024-07-28
2. 国家中医针灸临床医学研究中心, 天津 300381;
3. 天津中医药大学, 天津 301617
股骨干骨折是常见的创伤骨折类型之一，占全身骨折6%，主要是由高能量的伤害导致，如交通事故、高处坠落等，好发于青壮年群体[1-2]。目前在临床实践中对于股骨干骨折一般采用手术复位及髓内钉内固定进行治疗，但术后可能面临延迟愈合、不愈合、感染、深静脉血栓等并发症[3-4]。骨折恢复过程中的生活质量明显下降[5]。
中医认为骨折的病位在筋骨，与肝肾的关系非常密切。肾主藏精，主骨生髓，肝主藏血，精血充盛则髓满骨壮。筋骨生长、骨折愈合都需要全身气血的充养。复方伤痛胶囊在复元活血汤的基础上加减其他药物而成，由柴胡、桃仁、红花、熟大黄、当归、天花粉、延胡索、甘草组成，具有活血祛瘀、行气止痛的功效[6]。目前已有研究[7-8]发现复方伤痛胶囊对促进骨折愈合有较好的效果，但对其作用机制研究较少，因此有必要对其治疗骨折的作用机制进行进一步研究。本研究基于动物实验与网络药理学技术探讨复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的作用机制和药效关键成分，并进行生物富集分析，研究结果可为日后的开发与使用提供一定的依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物48只10周龄SPF级SD大鼠，体质量(250±10)g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0008，所有实验大鼠均用标准啮齿类动物饲料喂养，动物实验经易生源基因科技(天津)有限公司实验动物管理委员会批准(伦理批号：YSY-DWLL-2022120)。
1.2 主要试剂与仪器微计算机断层扫描(Micro-CT，PerkinElmer，Quantum FX)，RAT白细胞介素-6(IL-6)试剂盒、RAT肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(上海科兴，F3066-A、F3056-A)，含血管内皮生长因子(VEGF)探针原位杂交试剂盒(BOSTER，MK1142)，万能试验机[TA(BOSE)，Electroforce 3330]，酶标检测仪(北京普朗科技有限公司，DNM-9602)。
1.3 实验药物实验所用药品为复方伤痛胶囊，规格为0.3 g/粒，批号109019，甘肃省西峰制药有限责任公司。
1.4 造模及给药两组大鼠根据文献方法[9]构建左下肢股骨干骨折模型，SD大鼠用30 g/L的戊巴比妥钠以40 mg/kg的标准，采用腹腔注射的方式进行麻醉。以仰卧位将麻醉好的大鼠固定在大鼠操作板上，大鼠的四肢用橡皮筋进行简单固定，剔除左侧下肢鼠毛，并用碘伏局部消毒，用手术剪在大鼠左下肢剪开长约3 cm的纵行切口，逐层钝性分离皮肤及肌肉，暴露股骨干中段，用迷你电磨机沿着股骨干中段横截面锯断股骨，确保骨折断端平整。将直径为1 mm的克氏针从骨折断端插入，逆行插进骨折近端，并于大转子顶端出针，在骨折断端复位良好的基础上，将克氏针从近端经过骨折断端到左股骨髁间窝处。体外部分多余的克氏针剪断，针尾部分折弯并埋于皮下。分层缝合大鼠肌肉与表层皮肤，切口用碘伏进行消毒。术后3 d所有大鼠要每日肌内注射庆大霉素4万单位，预防感染。
将48只SD大鼠随机分为治疗组与对照组各24只，从造模后第1天开始灌胃给药，连续灌胃6周，治疗组每日灌胃复方伤痛胶囊颗粒0.243 g/kg，给药剂量3 mL；对照组给予等量生理盐水灌胃，每日灌服生理盐水3 mL。
1.5 指标检测于造模后第1周、第2周、第4周及第6周，每组各处死6只大鼠进行指标检测。造模后第2周、第4周、第6周，每组各取3只大鼠完整股骨样本，放在Micro-CT小动物成像仪的扫描台中，扫描完成后进行三维重构并记录骨形态计量学参数；造模后第4周、第6周，每组各取3只大鼠完整股骨样本，用万能试验机进行三点弯曲实验，检测大鼠股骨干最大载荷；造模后第1周、第2周、第4周及第6周，每组各取5只大鼠的血清，严格按IL-6、TNF-α的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒要求，测定其血清IL-6、血清TNF-α水平；造模后第1周、第2周、第4周和第6周，每组各取3只大鼠股骨样本中的骨痂组织，采用原位杂交法对VEGF mRNA进行检测。
1.6 药物活性成分筛选和药物靶点预测利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选复方伤痛胶囊各组成药物“柴胡”“桃仁”“红花”“熟大黄”“当归”“天花粉”“延胡索”“甘草”的活性成分(筛选条件：口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18)，并检索出各活性成分的作用靶点。将各成分的作用靶点取并集后去重，作为药物的成分靶点。利用UniProt数据库，把成分靶点校正其为规范的基因名称。
1.7 药物作用靶点筛选和“药物-成分-作用靶点”网络构建在线人类孟德尔遗传(OMIM)数据库和GeneCards数据库中以“femoral shaft fracture”为关键词检索疾病靶点，并与药物靶点取交集，利用在线绘图工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将结果可视化，得到复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的作用靶点。应用Cytoscape3.10.0软件构建复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折作用靶点的可视化网络图。
1.8 蛋白相互作用网络(PPI)构建将复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的作用靶点输入String数据库，得到蛋白互作网络图，并导入Cytoscape3.10.0软件，对其进行网络分析，构建PPI网络。
1.9 生物信息学分析使用Metascape数据库对复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的作用靶点进行生物信息学分析。对其进行基因本体(GO)分析和京都基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。通过条形图及气泡图绘制工具(http://www.bioinformatics.com.cn)绘图，展示富集结果。
1.10 统计学方法采用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行分析，定量数据采用均数±标准差(x±s)表示，若两组间定量数据符合正态分布，则采用双独立样本t检验进行分析，若两组的定量数据不符合正态分布则采用非参数检验中秩和检验进行分析。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 Micro-CT结果在大鼠造模后的第2周、第4周及第6周，对大鼠股骨干骨折断端使用Micro-CT进行扫描，并构建股骨干骨折三维重建模型，见图 1。
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| 图 1 大鼠左侧股骨干三维重建模型比较 Fig. 1 Comparison of three-dimensional reconstruction models of left femoral shaft in rats |
采用Micro-CT扫描两组大鼠的左侧股骨干，并进行三维重建，测定两组大鼠的骨表面积和体积比值(BS/BV)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数(Tb. N)、骨小梁厚度(Tb. Th)，评估骨折断端骨形成量。两组大鼠造模后BS/BV进行对比分析，第2周时，两组BS/BV数据中治疗组的BS/BV明显高于对照组(P < 0.05)，而在随后的两个时间段，差异性不明显(P > 0.05)，见表 1。两组大鼠BV/TV数据对比结果与BS/BV相似，第2周治疗组的BV/TV参数明显升高，对比对照组差异具有统计学意义(P < 0.01)，见表 2。第4周和第6周，治疗组的BV/TV参数虽略高于对照组，但两组差异不显著(P > 0.05)；与对照组相比，治疗组的Tb. N明显增多，且呈现持续上升状态，第2、4、6周治疗组的Tb. N较对照组均有所增多，两组大鼠Tb. N差异具有统计学意义(P < 0.05)，见表 3。将两组的Tb. Th参数进行比较发现，第2周、第4周，两组的Tb. Th差异不明显(P > 0.05)，第6周时，治疗组的Tb.Th明显高于对照组(P < 0.05)。见表 4。
第4周，治疗组的股骨干最大载荷量明显高于对照组，两组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)；第6周，治疗组的股骨干最大载荷稍有降低，但仍高于对照组，两组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)。见表 5。
第1、2周，治疗组大鼠血清IL-6含量低于对照组，统计学差异具有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)；第4、6周，治疗组与对照组两组大鼠的IL-6表达保持稳定，治疗组与对照组比较差异具有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。见表 6。
第1周，与对照组比较，治疗组TNF-α表达降低，差异具有统计学意义(P < 0.01)；第2周，治疗组TNF-α表达明显降低，而对照组则稍有降低，两组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)。见表 7。
第1周及第2周，治疗组较对照组的阳性细胞值占比更高，两组比较差异具有统计学意义(P < 0.05)。见表 8。
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通过TCMSP数据库搜索复方伤痛胶囊各药物的活性成分和成分靶点，共得到223个活性成分，3 985个药物靶点，剔除重复后共得到209个活性成分和288个药物靶点。见表 9。
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通过GeneCards检索收集股骨干骨折疾病相关的靶点共1 388个，选取Relevance score≥1分的靶点，筛选后剩余靶点824个；OMIM数据库所得靶点33个，汇总去重后共得到股骨干骨折疾病靶点共852个。将药物靶点与疾病靶点取交集，得到60个复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的作用靶点。见表 10，图 2。
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| 图 2 复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折作用靶点的韦恩图 Fig. 2 Venn diagram of the targets of Fufang Shangtong Capsule in the treatment of femoral shaft fracture |
将筛选得到的复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折活性成分和作用靶点的信息导入Cytoscape3.10.0软件，构建“药物-成分-作用靶点”网络，见图 3。网络图中8个红色的“V”字形节点分别代表复方伤痛胶囊的各个组成药物；150个蓝色的六边形节点分别代表各个药物的活性成分，6个灰色的六边形节点代表多个药物共同包含的活性成分；60个绿色矩形节点代表治疗股骨干骨折的作用靶点；776条边代表药物与活性成分、活性成分与作用靶点之间的相互联系。
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| 图 3 复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的“药物-成分-作用靶点”网络图 Fig. 3 "Drug-Ingredient-Target" network of Fufang Shangtong Capsule in the treatment of femoral shaft fracture |
将作用靶点导入String数据库，得到PPI网络关系数据，然后使用Cytoscape3.10.0软件绘制PPI网络图，见图 4。网络图中节点由小变大，颜色由黄变红，代表度值由低变高。度值越高，表示该靶点越重要。度值由高到低排名前5位的蛋白分别是白蛋白(ALB)、蛋白激酶Bα(AKT1)、IL-6、TP53和VEGFA，它们可能是复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的重要作用靶点。
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| 图 4 复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折作用靶点之间的蛋白质互作网络 Fig. 4 Protein-Protein Interaction network of the targets of Fufang Shangtong Capsule in the treatment of femoral shaft fracture |
GO富集分析共得到452个GO条目。应用条形图绘制工具对生物进程、细胞组分及分子功能基因富集数排名前10的条目绘制条形图，见图 5。在生物进程层面上，复方伤痛胶囊对细胞对激素的反应、细胞对肽的反应和细胞对有机氮化合物的反应等影响较大；在细胞组分层面上，复方伤痛胶囊对转录调控复合物、膜筏和膜微区等影响较大；在分子功能层面上，复方伤痛胶囊对DNA结合转录因子的结合、转录因子结合和转录协同调节因子结合等影响较大。
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| 图 5 复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折作用靶点的GO富集分析 Fig. 5 GO enrichment analysis of the targets of Fufang Shangtong Capsule in the treatment of femoral shaft fracture |
KEGG富集分析得到163条通路，其中与股骨干骨折相关的通路有23条，按照涉及的P value从小到大排序，绘制前20条通路的气泡图，见图 6。结果显示，复方伤痛胶囊主要通过调控磷酸酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、VEGF信号通路和分泌型糖蛋白(Wnt)信号通路等途径发挥治疗股骨干骨折的作用。
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| 图 6 复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折作用靶点的KEGG通路富集分析 Fig. 6 KEGG pathway enrichment analysis of the targets of Fufang Shangtong Capsule in the treatment of femoral shaft fracture |
Micro-CT的三维重建结果可以直观地显示大鼠股骨干骨折后不同时间点的愈合情况，由三维重建结果可见复方伤痛胶囊治疗组骨痂组织水平多于对照组，骨折线率先消失，提示治疗组大鼠的骨折断端愈合优于对照组，骨形态计量学参数所反映的结果也与之类似。三点弯曲试验是常用的骨骼力学性能检测方法之一，通过三点弯曲试验所检测的股骨干最大载荷量能反映骨折愈合强度的大小[10-11]。实验结果表明复方伤痛胶囊能提升骨折愈合的强度。
TNF-α和IL-6是常见的致炎因子，有研究[12]表明骨折后血清炎症因子水平对骨折愈合有一定的影响。TNF-α是TNF信号通路中的重要物质，其可通过抑制成骨细胞分化、促进破骨细胞生成等来影响骨折的愈合[13]。TNF-α还可刺激IL-6的产生，进一步加重骨折的炎性损伤[14]。动物实验的结果表明，复方伤痛胶囊可降低TNF-α和IL-6在股骨干骨折大鼠体内的水平，提示其治疗骨折的机制可能与减轻骨折后的炎性反应有关。血管生成与骨重塑的过程密切相关，其受到包括VEGF在内的多种生物因子的影响[15]。VEGF具有促进血管内皮细胞分裂及血管生成的作用，同时还可刺激成骨细胞的生成，VEGF血清水平的提高可促进骨折愈合[16-17]。有研究[18]表明，VEGF高水平表达可以加快大鼠骨折愈合的进程。在本实验中发现，治疗组的大鼠骨痂组织中VEGF mRNA阳性细胞占比在骨折1周后持续上升，且升高水平较对照组明显，表明复方伤痛胶囊促进骨折愈合的机制可能与提升VEGF的表达水平有关。
“药物-成分-作用靶点”网络分析结果显示，槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分可能是复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的主要成分。有研究[19-21]表明，多种黄酮类化合物对骨折愈合有积极作用。槲皮素是一种广泛存在于自然植物中的黄酮类化合物，具有抗炎、促进骨形成、抑制骨吸收等生物作用[22]。有动物实验[23]显示槲皮素可为骨折后的骨质增长提供良好的生物环境，通过多种调控因子来促进成骨细胞的分化，从而促进骨折愈合。木犀草素是一种天然的四羟基黄酮类化合物，其可通过调节分泌型糖蛋白/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路来诱导成骨细胞分化、抑制破骨细胞生成以促进大鼠的骨折愈合[24]。山柰酚通过调节一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)在成骨细胞内的含量和促进Wnt1蛋白的表达来促进骨的生成[25]。
根据PPI分析，发现ALB、AKT1、IL-6、TP53和VEGFA等靶点可能是复方伤痛胶囊治疗股骨干骨折的关键靶点。ALB是人体内维持血浆胶体渗透压、保持机体营养和保护器官组织功能正常运作的重要物质，对骨折的恢复有一定的促进作用[26]。多项研究[27-28]显示ALB在体内表达水平过低会导致骨折延迟愈合。AKT1是PI3K/Akt信号通路上的重要蛋白，可影响细胞的增殖、生长和存活，AKT1促进骨折愈合的机制可能与增强骨折端的血管形成和促进成骨细胞的分化有关[29]。TP53是一种与癌症相关的基因，与细胞分裂和增殖密切相关，有研究[30]表明骨量的丢失与TP53基因的表达有关。IL-6对骨折愈合的影响主要源于其致炎作用，有研究[31]表明降低IL-6的表达水平与骨折愈合时间的缩短有关。VEGFA是目前对VEGF家族中了解较为广泛的一种，VEGFA对骨折愈合过程中骨膜血管的生成和血管通透性的提高起到重要作用，从而加快骨折后的骨重塑[32]。在前文的动物实验中发现复方伤痛胶囊可调控股骨干骨折大鼠体内IL-6和VEGF的表达，这与网络药理学研究结果是一致的。
对60个作用靶点进行KEGG富集分析发现，它们可能通过调控PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路和Wnt信号通路等起到治疗股骨干骨折的作用。PI3K/Akt信号通路参与调节细胞的增殖、分化和凋亡，可通过影响成骨细胞与破骨细胞之间的分化平衡来调节骨代谢[33-34]。有文献[35]报道激活PI3K/Akt信号通路可以促进骨痂的形成和加速骨质的沉积，从而起到促进骨折愈合的作用。在HIF-1信号通路中，HIF-1α作为该信号通路中的重要生物因子，可通过调节成骨细胞与破骨细胞的功能、刺激骨折断端的血管生成来促进骨折愈合[36]。MAPK包括有p38、JNK、ERK5和ERK在内的4个亚族，相关亚族的表达与成骨分化基因的转录呈正相关趋势，激活MAPK信号通路可诱导成骨细胞分化和钙的沉积从而加速骨重塑的过程[37-38]。经典的Wnt通路通过依赖β-连环蛋白(β-catenin)来发挥生物学功能，即Wnt/β-catenin信号通路[39]。Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞分化的基因有诱导作用[40]。多项研究[41-42]结果显示Wnt/β-catenin信号通路可通过促进机体的成骨作用、抑制骨吸收等方式发挥促进骨折愈合的作用。
本研究通过动物实验初步探究复方伤痛胶囊对股骨干骨折愈合的潜在作用机制，基于网络药理学技术对其治疗股骨干骨折的活性成分、作用靶点、生物通路等进行了系统研究和分析。但本研究动物实验部分未能展现不同药物剂量和浓度对股骨干骨折治疗作用的影响，网络药理学部分只对潜在的核心靶点和作用通路进行了预测分析，所得结论仍然需要更多的实验科学进行深入验证。
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2. National Clinical Research Center of Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China;
3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China