2024, Vol. 41文章信息
- 韩玉, 王耀光.
- HAN Yu, WANG Yaogaung.
- 加味防己黄芪汤干预lncRNA NKILA介导的HK-2细胞肾间质纤维化模型抑制上皮细胞-间充质转化作用的机制研究
- To investigate the mechanism by which modified Jiawei Fangji Huangqi Decoction intervenes in the lncRNA NKILA-mediated RIF model of HK-2 cells to inhibit EMT
- 天津中医药, 2024, 41(12): 1576-1585
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2024, 41(12): 1576-1585
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2024.12.16
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文章历史
- 收稿日期: 2024-10-18
2. 天津中医药大学第一附属医院, 天津 300381
肾间质纤维化是指胶原蛋白及相关蛋白在肾皮质间质异常沉积，是各类肾脏疾病的常见组织学异常，同时也代表了几乎所有慢性和进行性肾病的共同最终途径[1-2]。上皮细胞-间充质转化（EMT）是肾间质纤维化的重要起始环节，以往研究表明EMT在肾组织损伤修复中具有重要作用。在EMT的初始阶段，受损的上皮细胞或实质细胞触发纤维化反应，随后导致免疫细胞的募集和激活，免疫细胞可分泌细胞因子，促进纤维化过程[3]。而随着基因测序技术的不断发展，研究发现在免疫细胞激活的过程中会伴随着大量长链非编码RNA（lncRNA）的表达量变化。越来越多的证据表明，lncRNA参与广泛的生物过程，包括基因调控、染色质结构和细胞分化，并且能够参与免疫细胞募集、分化和功能的调节，以及细胞因子和趋化因子信号传导，参与细胞增殖和迁移以及细胞凋亡的调节[4-5]。
本研究中所选取的lncRNA NKILA是活化B细胞的核因子κ轻链增强子（NF-κB）相关性的lncRNA[6]。在以往的研究中表明，NF-κB是在肾间质纤维化过程中经典的促进纤维化形成的细胞因子，同时具有明显的促进炎症进展的功能，且在不同器官的纤维化进程中均展现出相似的致纤维化能力[7-9]。而lncRNA NKILA具有同NF-κB相互作用的结构域，现阶段的研究表明lncRNA NKILA能够表现出同NF-κB相似的致纤维化能力，同时具有激活先天性和获得性免疫反应的功能，能够参与调节肾脏细胞的炎症反应及凋亡过程[10]。
本课题组前期已经证实了，加味防己黄芪汤能够改善单侧输尿管结扎（UUO）大鼠肾功能等生化指标、肾间质纤维化病理损伤、抑制肾间质纤维化过程中EMT表型蛋白E-cad、α-SMA蛋白的表达以及炎症因子NF-κB、IκBa的蛋白表达，同时能够干预JAK2/STAT3信号通路，对于肾间质纤维化的进程起到延缓作用，并且在通过不同剂量浓度的结果对比中发现，高剂量的加味防己黄芪汤抑制UUO大鼠肾间质纤维化的效果更为显著[11]。因此，本研究通过高剂量加味防己黄芪汤含药血清干预由lncRNA NKILA过表达构建的HK-2细胞肾间质纤维化模型，并设置AG490干预组进行对照，通过检测EMT表型指标FN、Col1、Vim、α-SMA、E-cad的表达量变化，以及JAK2/STAT3信号通路相关指标的变化，在细胞层面进一步探索加味防己黄芪汤含药血清对HK-2细胞纤维化过程中的EMT作用机制的干预作用。
1 实验材料 1.1 实验细胞人肾皮质近曲小管上皮细胞株（HK-2细胞，Procell CL-0109），购买于武汉普诺赛生命科技有限公司，STR鉴定正确。
1.2 主要试剂及耗材兔GAPDH单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，10494-1-AP）、兔alpha-SMA单克隆抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，AF1032）、兔E-cadherin单克隆抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，AF0131）、兔Vimentin单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，10366-1-AP）、山羊抗兔IgG（H+L）HRP（江苏亲科生物研究中心有限公司, S0001）、Anti-Fibronectin（Abcam，ab45688）、兔Collagen I单克隆抗体（沈阳万类生物科技有限公司，WL0088）、兔Jak2单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，17670-1-AP）、兔STAT3单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，10253-2-AP）、Anti-P-JAK2 Rabbit pAb（沈阳万类生物科技有限公司，WL02997）、兔Anti-P-STAT3单克隆抗体（沈阳万类生物科技有限公司，WLP2412）、CCK-8（兰杰柯科技有限公司，BS350B）。
1.3 主要实验仪器伯乐小型电泳仪（美国BIO-RAD公司，164-5050）、多功能酶标仪（美国Thermo公司，Varioskan LUX）、冷冻高速离心机（美国Thermo Fisher公司，75002445）、梯度PCR仪（美国ABI ProFlex公司，4484073）、荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司，LightCycler96）、凝胶成像仪（德国耶拿公司，ChemStudio）、正置光学显微镜（日本OLYMPUS公司，OLYMPUS CK31）等。
2 实验方法 2.1 细胞培养方法HK-2细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，加入1%的青霉素链霉素双抗，于37 ℃，5% CO2条件下进行培养，隔天换液，细胞融合至70%~80%时，0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例传代。取对数生长期HK-2细胞进行后续实验。
2.2 慢病毒构建及转染提供人源lncRNA NKILA的序列全长信息，由上海吉凯基因技术公司针对序列信息，设计并合成过表达lncRNA NKILA靶点，构建慢病毒载体。
过表达载体为GV513，元件顺序Ubi-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，见图 1。过表达病毒目的基因片段获取信息见表 1。
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| 图 1 过表达载体为GV513，元件顺序Ubi-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin Fig. 1 Overexpression vector GV513, element sequence Ubi MCS CBh gcGFP IRES puromycin |
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所有动物实验均遵循天津市医学实验动物保护中心的指导原则，动物实验方案经易生源基因科技（天津）有限公司的动物伦理委员会批准[方案号YSY-DWLL-2021069，实验动物许可证SYXK（津）2021-0003]。
加味防己黄芪汤高剂量水煎剂，制备方法：生黄芪30 g，防己10 g，生白术10 g，地龙10 g，赤芍10 g，以上药材由天津中医药大学第一附属医院提供，并对药物进行煎煮浓缩。按照《药理实验方法学》体表面积换算方法，体表面积系数为0.018，将每付药液浓度浓缩至高剂量1.26 g/mL，4 ℃保存。
含药血清制备：10只SPF级雄性SD大鼠，每次灌胃前测量大鼠体质量，按照10 mL/kg剂量进行高剂量加味防己黄芪汤灌胃，每日清晨灌胃2 mL，连续7 d。并于第6天晚禁食不禁水，第7天给药2 h后，采用戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，进行腹主动脉采血。血液样本室温静置1 h，3 000 r/min离心15 min，离心半径为144 mm，留取血清，56 ℃水浴箱灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌，无菌分装后-80 ℃冰箱保存备用。
2.4 CCK-8法筛选含药血清给药浓度取对数生长期的HK-2细胞，调整细胞密度为4×104/mL的细胞密度接种于96孔板中（每孔100 μL），培养板周边孔接种等量无菌磷酸盐缓冲液（PBS），37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后加入不同浓度的高剂量含药血清浓度（0%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%）诱导细胞24 h，每个浓度设置5个复孔，并设置无细胞对照孔。药物作用结束后，10 μL/孔避光加入CCK-8试剂，继续放入37℃、5% CO2培养箱内孵育2 h，酶联免疫检测仪上测定各孔OD值（单波长450 nm），根据细胞活力筛选出最合适的含药血清最适干预浓度。
2.5 实验分组方法HK-2细胞复苏后传代至第3~5代开始实验，取对数生长期HK-2细胞，以2×104/mL密度接种于6孔板上（每孔1 mL），待细胞生长至30%~40%密度时，更换不含胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中饥饿处理12 h，按以下分组进行干预。
1）过表达阴性对照慢病毒转染组（oe-NC组）：使用过表达阴性对照病毒（LVCON335）进行转染，慢病毒24 h后收集细胞。2）过表达lncRNA NKILA慢病毒转染组（oe-NKILA组）：使用过表达慢病毒Lv-NKILA（76304）进行转染，慢病毒24 h后收集细胞。3）过表达lncRNA NKILA慢病毒转染+AG490干预组（oe-NKILA+AG490组）：使用过表达慢病毒Lv-NKILA（76304）进行转染，同时加入50 μmol/L AG490，共刺激24 h后收集细胞。4）过表达lncRNA NKILA慢病毒转染+高剂量防己黄芪汤含药血清组（oe-NKILA+TCM-H）：使用过表达慢病毒Lv-NKILA（76304）进行转染，同时加入高剂量防己黄芪汤含药血清进行干预，共刺激24 h后收集细胞。
3 检测指标及方法 3.1 蛋白免疫印迹（Western Blot）检测 3.1.1 一抗稀释比例GAPDH 1∶2 000、Vim 1∶500、α-SMA 1∶500、FN 1∶1 000、Col1 1∶500、JAK2 1∶500、STAT3 1∶1 000、p-JAK2 1∶500、p-STAT3 1∶1 000，使用一抗稀释液稀释，置于4 ℃冰箱备用。
3.1.2RIPA裂解细胞提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取10 μL蛋白样品、4 μL彩色预染蛋白标准品在8% SDS-PAGE胶中上样，设定100 V电压进行电泳，溴酚蓝至凝胶底部停止电泳。湿式电转膜法转移至PVDF膜上，400 mA恒定电流转膜30 min。5%脱脂奶粉，封闭液室温下封闭60 min，1×TBST洗膜3次，每次5 min。一抗孵育，4 ℃过夜，1×TBST洗膜3遍，Goat Anti-Rabbit IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，再次1×TBST洗膜3遍，特超敏ECL化学发光试剂盒显影，凝胶成像仪检测。GAPDH为内参蛋白，Image J软件分析条带，以目的蛋白与内参蛋白比值为相对表达量。
3.2 免疫荧光检测E-cad蛋白表达量变化E-cad蛋白一抗稀释比例为1∶50，使用PBS稀释。HK-2细胞按照2×104/孔的密度接种于细胞爬片上。分组及模型构建同前。造模完成后，弃去原有培养液，使用PBS缓冲液清洗细胞后，吸净残留液体，用4%多聚甲醛室温固定细胞30 min后，使用PBS缓冲液洗涤3遍，每次5 min。0.5% Triton100室温下浸润细胞10 min进行细胞透膜处理，使用5%山羊血清封闭液室温下封闭30 min。滴加一抗孵育，室温下孵育30 min后，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤细胞3次后。避光加入CoraLite594-conjugate Goat Anti-Rabbit IgG（1∶200，PBS稀释），37 ℃避光孵育1 h。避光环境下，捞出细胞爬片，并放置于黏附载玻片上，并滴加含DAPI的防荧光淬灭剂孵育套染细胞核2 min，盖玻片封片，荧光显微镜下观察并采集图像。
3.3 实时荧光定量PCR（qPCR）检测RIPA裂解细胞利用柱式法提取总RNA，利用分光光度仪测定RNA浓度。HiFiScript cDNA Synthesis Kit进行逆转录，配置20 μL体系进行cDNA逆转录，使用UltraSYBR Mixturet进行扩增，设置20 μL反应体系聚合酶链反应（PCR）检测。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），反应体系：95 ℃预变形10 min，热启动40个循环（95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延展1 min）。PCR通过计算基因的相对表达量（2-ΔΔCt）分析结果：以GAPDH为内参基因，计算方法为：ΔΔCt＝ΔCt实验组（目的基因Ct值-内参基因Ct值）-ΔCt对照组（目的基因Ct值-内参基因Ct值）。引物由上海生工生物工程公司设计合成，引物序列见表 2。
利用SPSS 25.0统计分析软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组数据比较前先进行正态性及方差齐性检验。组间差异比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），符合正态分布且方差齐时采用SNK检验，方差不齐时采用Dunnett’s检验；不符合正态分布时使用非参数检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
5 结果 5.1 含药血清浓度筛选结果CCK-8法筛选出含药血清浓度（0%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%）给药24 h后对HK-2细胞活力的影响，结果显示在12.5%浓度开始，细胞活力出现明显的下降（P＜0.01）。在10%浓度之前各梯度浓度之间细胞活力无明显差别，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示含药血清最适给药浓度为10%，故本实验后续采用10%浓度高剂量防己黄芪汤含药血清进行实验，见图 2。
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| 注：同10%浓度比较，**P＜0.01。 图 2 CCK-8筛选含药血清给药浓度结果 Fig. 2 CCK8 screening drug-containing serum administration concentration results |
与oe-NC组比较oe-NKILA组FN、Col1、Vim、α-SMA蛋白表达量，明显呈上调趋势，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与oe-NKILA组比较，oe-NKILA+AG490组、oe-NKILA+TCM-H组表型蛋白均有明显的下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。组间比较，oe-NKILA+AG490组虽然表型指标蛋白变化量下调的趋势较oe-NKILA+TCM-H组更低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 3。
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| 注：A-B，EMT指标Western Blot检测结果；C，EMT指标qPCR统计结果。n=3。与oe-NC组比较，**P＜0.01；与oe-NKILA组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 3 EMT表型指标检测结果 Fig. 3 EMT phenotype index test results |
免疫荧光结果显示，oe-NC组E-cad蛋白沿细胞膜均匀分布，荧光强度均匀；oe-NKILA组中，荧光强度明显减弱，差异具有统计学意义（P＜0.01）；oe-NKILA+AG490组、oe-NKILA+TCM-H组，E-cad蛋白荧光强度较oe-NKILA组增强，差异具有统计学意义（P＜0.01）。组间比较，oe-NKILA+AG490组荧光信号强度虽较oe-NKILA+TCM-H组表达较高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 4。
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| 注：n=3。与oe-NC组比较，**P＜0.01；与oe-NKILA组比较，##P＜0.01。 图 4 E-cad蛋白细胞免疫荧光检测结果 Fig. 4 Immunofluorescence detection of E-cad protein |
qPCR结果显示，与oe-NC组比较，oe-NKILA组表型指标FN、Col1、Vim、α-SMA的mRNA表达量，均呈上调趋势，E-cad的mRNA表达量呈现明显下调趋势，差异具有统计学意义（P＜0.05）。同oe-NKILA组比较，oe-NKILA+AG490组、oe-NKILA+TCM-H组FN、Col1、Vim、α-SMA的mRNA表达量均明显呈下调趋势，E-cad的mRNA表达量明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。oe-NKILA+AG490组同oe-NKILA+TCM-H组，组间比较各表型指标的mRNA表达量变化未见明显差异，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。
检测各组NKILA的表达量变化结果显示，与oe-NC组比较，oe-NKILA组NKILA表达量显著上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与oe-NKILA组比较，oe-NKILA+AG490组的NKILA表达量显著下调（P＜0.01），oe-NKILA+TCM-H组的NKILA表达量，明显下调（P＜0.05）。oe-NKILA+AG490组与oe-NKILA+TCM-H组NKILA的mRNA表达量变化比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 4，图 5。
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| 注：与oe-NC组比较，**P＜0.01；与oe-NKILA组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。n=3。 图 5 lncRNA NKILA的qPCR统计结果 Fig. 5 qPCR statistical results of lncRNA NKILA |
Western Blot检测JAK2/STAT3通路指标变化的结果显示，同oe-NC组相比oe-NKILA组JAK2、STAT3及其磷酸化蛋白表达量明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。同oe-NKILA组比较，oe-NKILA+AG490组JAK2、STAT3及其磷酸化蛋白表达量显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）；oe-NKILA+TCM-H组JAK2、STAT3及其磷酸化蛋白表达量明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。组间比较，虽然加入AG490抑制剂干预oe-NKILA组对于JAK2、STAT3及其磷酸化蛋白的变化量下调趋势较TCM-H组更低，但差异不具备统计学意义（P＞0.05）。见表 5、图 6。
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| 注：图A和图B，Western Blot检测JAK2/STAT3通路指标变化量结果；图C，qPCR检测结果。n=3。与oe-NC组比较，**P＜0.01；与oe-NKILA组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。 图 6 JAK2/STAT3通路指标检测结果 Fig. 6 Detection results of JAK2/STAT3 pathway indicators |
qPCR结果显示，同oe-NC组比较，oe-NKILA组通路指标JAK2、STAT3的mRNA表达量，均显著上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。同oe-NKILA组相比，oe-NKILA+AG490组、oe-NKILA+TCM-H组的JAK2、STAT3的mRNA表达量，均显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。oe-NKILA+AG490组同oe-NKILA+TCM-H组，组间比较JAK2、STAT3达量变化未见明显差异，差异无统计学意义（P＞0.05）。
6 讨论肾间质纤维化的组织病理学特征是细胞外基质（ECM）成分沉积、肾小管细胞丢失、成纤维细胞聚集以及肾小管周围微血管系统稀疏[12]。组织损伤后ECM的沉积最初可能有助于组织修复过程，然而在慢性肾脏病（CKD）发生的持续性组织损伤期间，会招募和激活先天性和适应性免疫系统等多种炎性细胞，促使局部组织炎症持续发生，而炎症细胞产生的自由基则诱导EMT，使ECM沉积不受控制，促进肾脏纤维化进程[13-16]。CKD过程中持续进行的纤维化降低了肾组织的修复能力，破坏肾脏结构，减少血液供应并扰乱肾脏功能，最终导致CKD进一步进展为终末期肾病（ESRD）[17-18]。因此，减轻或延缓CKD过程中的肾间质纤维化进程，是现阶段中医药防治肾脏病的主要手段及优势领域。
JAK2/STAT3是一条经典的炎症因子信号通路，以磷酸化为主要的作用方式，可以响应多种细胞因子信号，如IL-6家族、TGF-β1、NF-κB等[19-21]。在CKD过程中，这些炎症细胞因子可以直接激活肌成纤维细胞，或诱导上皮细胞转化为成纤维细胞，从而导致肾脏纤维化的形成[22]。而STAT3一方面可以细胞内快速响应IL-6的刺激，并且作为正调节因子激活TGF-β1及NF-κB诱导的EMT；另一方面，STAT3本身可以作为一种炎症刺激因子，持续刺激肾脏组织的炎症反应，加剧肾脏纤维化进程，造成恶性循环[23-24]。因此，JAK2/STAT3信号通路在肾纤维化进程中，既是启动因素，也是肾间质纤维化信号通路的响应因子，在肾脏EMT环节中起到十分关键的作用。
本研究使用过表达lncRNA NKILA慢病毒转染正常的HK-2细胞后，除表现明显的EMT损伤特征外，JAK2、STAT3蛋白及其磷酸化蛋白的变化量，均明显上调，一定程度上证实了该过程中激活了JAK2/STAT3信号通路。为了进一步明确lncRNA NKILA对JAK2/STAT3信号通路的影响，研究引入了JAK2/STAT3通路的特异性抑制剂AG490作为对照组。AG490是一种剂量依赖性的抑制剂，本研究结合文献资料以及CCK-8结果，选取50 μmol/L浓度干预过表达lncRNA NKILA诱导HK-2细胞纤维化模型24 h，进行JAK2/STAT3信号通路的抑制[25-28]。结果显示，AG490能够减轻过表达lncRNA NKILA诱导HK-2细胞EMT表型损伤、同时抑制JAK2/STAT3信号通路的激活。因此，研究证实lncRNA NKILA过表达造成HK-2细胞EMT损伤的过程中激活了JAK2/STAT3信号通路。
本研究中使用的加味防己黄芪汤是王耀光教授治疗CKD的核心处方，全方由生黄芪30 g，生白术10 g，防己10 g，赤芍10 g，地龙10 g组成。该方从《金匮要略》防己黄芪汤化裁而来，具有益气固表、祛风除湿的功效。方中生黄芪30 g为君，温分肉，实腠理，泻阴火壮脾胃；生白术、防己为臣，白术味苦甘温，健脾益胃，化胃经痰水，理心下急满，利腰脐血结，祛周身湿痹；防己，辛、温，通行十二经，通腠理，利九窍，泻下焦血分湿热，白术、防己配合生黄芪，具有温阳利水之功效。方中加入赤芍、地龙为佐使，赤芍，苦酸微寒，入肝脾血分，安脾肺固腠理，尤能泻肝火、散恶血，利小便，配合白术更能固护脾胃之阴津，行血中之滞；地龙，咸寒，入肝、脾、膀胱经，清热止痉、平肝息风、搜风通络、平喘利水，配合全方行虫蚁搜剔之效，通经活血、祛瘀生新。全方从固表、燥湿、通经、和血4个方面共奏扶正祛邪之效。
王耀光教授认为CKD总属本虚标实之证。其中，“本虚之证，伤于气化、病在水分，其本在肾、其节在脾、其末在肺”。《本经疏证》云“肾者藏精泄浊之总汇”，既概括了中医肾脏的生理功能，即“藏精”与“泄浊”两个方面。中医的肾脏既是周身精气贮藏之所，同时也是体内废物代谢之所，这种认识同现代生理、病理基础相统一。肾间动气为三焦之本是经脉生化之源，其意义在于肾内寄元阳，具有蒸腾阳气的功能，全身津液的运行依赖于阳气的蒸化。《灵枢》云：“五脏皆柔弱者，善病消瘅。”饮入于胃而脾脏虚弱，则输布无力、失于运化；肾脏虚弱则元阳衰惫，生化乏源三焦则无力斡旋，失于蒸腾。《素问·水热穴论》中记载：“肾者，至阴也，至阴者，盛水也。肺者，太阴也，少阴者，冬脉也，故其本在肾，其末在肺，皆积水也。”因此，CKD本虚之证，责之肺脾肾三脏亏虚，其本在肾，肾元衰惫无力气化，以至水无所制，溢渍于下；其节在脾，脾气虚弱输布无力，则水蕴于内化生湿浊、脘腹胀满饮食不下；其末在肺，肺气虚弱宣肃失常，气竭于上、水湿四溢、咳逆喘急。
再则“标实之证，风为贼首、湿热、瘀血夹杂，累及血分”。肾为先天之本，脾为后天之本，脾肾亏虚则周身阳气亏虚，是以“其有不从毫毛生而五脏阳已竭也，津液充郭，其魄独居，孤精于内，气耗于外”。卫外不固，“贼风”趁势而入“使肌肉愤而有疡”。“风者百病之长。”风邪侵袭“善行数变”致病常无定型，其清扬激奋能搏水气于上，致使“一身尽疼”；又或伏于肠胃之间，致使“多寒则肠鸣飧泄”“多热则溏出糜”；亦或传于经脉，令“血气与邪并客于分腠之间”“稽留而不去，息而成积”。因此，在CKD过程之中，风邪为贼首，始于皮肤，可传至经络、伏于脏腑，勾连内外无孔不入。《景岳全书》载：“湿由内生者，以水不化气，阴不从阳而然也，悉由乎脾肾之亏败。”《灵枢·脉度》云：“五脏不和则七窍不通，六腑不和则留结为痈。”在CKD的进程中，本有卫外不固、风邪搅扰，又因脾肾衰惫而致内湿丛生，风湿相合内伤脏腑、外壅经络，致使周身气机壅塞不通，郁而化热，湿热之邪由此而生。“血即精之属也，但精藏于肾，所蕴不多，而血富于冲，所致皆是”“然血化于气而成于阴，阳虚固不能生血”，是以脾肾之虚，不仅累及于气，更伤之于血，“血主营气，不宜损也，而损则为病”。“水病则累血，血病则累气。”水湿日久则易耗气动血。《临证指南医案》记载：“初为气结在经，久则血伤入络。”阴损及阳，则湿、热、瘀血互相胶结，是以气、血、水杂而为病，亦可归为“癥瘕”之属[29-32]。CKD过程中的癥瘕之病，病位多居于肾脏，虽由瘀血而起但时刻处于动态变化之中，《景岳全书》载“病多在血分，血有形而静也”，《血证论》载“瘀血在经络脏腑之间，则结为癥瘕”[33]、“被气火煎熬，则为干血”[34]《金匮要略》中记载“血不利则为水”，瘀血既成，一方面会受机体湿热熏蒸煎熬成干血；另一方面则会进一步阻碍气机运转，正所谓“邪之所凑，其气必虚”，瘀血因素的搅扰会加重气分、水分的病变，造成恶性循环[33]。
因此，肾间质纤维化是CKD过程中贯穿疾病始终的主要病理改变[35-38]，其本在于肺、脾、肾3脏元气衰惫，气化失司；其标在于风邪搅扰、湿热、瘀血夹杂，致使气分、水分、血分杂合为病，甚则因虚致瘀而生虚劳干血。
加味防己黄芪汤则是在中医学理论的指导下，综合了CKD过程中肾间质纤维化的病理改变及临床经验，精简而来的核心处方。现代药理研究表明，黄芪的化学成分主要包括萜类化合物、黄酮类化合物和多糖类化合物。黄芪提取物和植物化学成分具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗惊厥、免疫调节、抗纤维化等活性[39-40]。白术的主要有效成分，白术内酯Ⅲ，能够通过抑制JAK2/STAT3信号通路降低溃疡性结肠炎中的IL-1β、IL-6水平，减轻肠道损伤[41]；白术内酯Ⅱ，能够通过PI3K/AKT通路，减轻神经元细胞在氧化应激状态下的细胞自噬及凋亡损伤[42]。赤芍的有效成分为芍药苷，具有广泛的抗炎及免疫调节作用，可通过调控GPCR通路、MAPKs/NF-κB通路、PI3K/Akt/mTOR通路、JAK2/STAT3通路、TGF-β/Smads等，抑制异常激活的细胞亚群和恢复调节细胞亚群来平衡免疫细胞亚群[43]。地龙提取物具有抗菌消炎、促进创伤修复、抗癫痫、抗纤维化的作用[44-45]，同时能够通过减弱AP-1/ICAM-1信号通路抑制成纤维细胞的迁移和黏附活动，从而防止腹腔内粘连[46-48]。结合单味药药理研究及课题组前期实验基础，加味防己黄芪汤的组方成分均具有抗炎、抗纤维化、调节免疫等作用，并且高剂量组延缓肾脏肾间质纤维化进程的作用更加明显。
本研究利用加味防己黄芪汤高剂量含药血清干预过表达lncRNA NKILA诱导的HK-2细胞肾间质纤维化模型，通过EMT表型指标的检测，发现其能够下调细胞模型中FN、Col1、Vim、α-SMA蛋白表达，上调E-cad蛋白表达。并且利用qPCR检测了各干预组之间lncRNA NKILA的mRNA相对表达量变化，结果显示AG490干预组能够明显的下调lncRNA NKILA的表达，而高剂量含药血清干预组虽同样能够下调lncRNA NKILA的表达但趋势并不如AG490显著。能够从一定程度上表明，加味防己黄芪汤高剂量含药血清具备在肾间质纤维化过程中下调lncRNA NKILA的能力。进一步检测JAK2/STAT3信号通路指标变化量的结果也表明，加味防己黄芪汤能够抑制由过表达lncRNA NKILA诱导HK-2细胞EMT损伤过程中的JAK2/STAT3信号通路激活，且高剂量含药血清对于JAK2/STAT3信号通路的抑制作用同AG490干预组比较，虽然组间比较不具备统计学差异，但在数值水平上略高剂量含药血清优于AG490干预组。
综上，加味防己黄芪汤高剂量含药血清能够减轻由lncRNA NKILA过表达诱导的HK-2细胞EMT损伤，并且抑制lncRNA NKILA诱导HK-2细胞EMT过程中JAK2/STAT3信号通路的激活。本研究也存在一定的局限性，受限于客观条件的限制，研究仅使用了细胞实验进行了体外验证，并未在体内实验中进行进一步探索；同时对于lncRNA NKILA同JAK2/STAT3信号通路之间，是否具有直接的结合位点没有进行更深入的探索，未来将继续完善实验设计，挖掘更深层次的分子作用机制。
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