糖尿病属于第三大慢性非传染性疾病，且随着人们饮食与生活方式的改变，中国糖尿病患者数量持续增加^[1-2]。而持续高糖易引起糖尿病心肌病，主要表现为心肌纤维化，进而导致心脏功能降低、心脏器质性病变，甚至死亡，严重威胁患者生命健康^[3]。因此控制血糖、抑制心肌纤维化对于延缓糖尿病引起的心肌病至关重要。贝母素乙提取自贝母的干燥鳞茎，具有降糖降脂、抗炎、抗凋亡、抗癌等多种药用价值，对心肌梗死诱导的心肌损伤和纤维化具有保护作用^[4]。生长停滞特异性蛋白6（GAS6）/Axl信号通路参与多种生理病理活动，已知激活GAS6/Axl信号通路可改善衰老相关心脏重塑，减轻心肌纤维化和细胞凋亡^[5]。贝母素乙能否通过调控GAS6/Axl信号通路改善糖尿病大鼠心肌纤维化尚未可知。本研究主要通过探究贝母素乙对糖尿病大鼠心肌纤维化及GAS6/Axl信号通路的影响，以期为糖尿病心肌纤维化治疗寻求新途径。

1 材料与方法 1.1 主要材料

60只8周龄、体质量190~210 g SPF级雄性SD大鼠购自中国医学科学院医学生物学研究所，生产许可号为SCXK（滇）K2022-0002，本研究已获得动物伦理委员会批准（批号：2300419）；贝母素乙（HPLC≥98%，Y10055-LFT）购自北京百奥博莱科技有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）、血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（FY-A014670、FY-A014596）购自上海富雨生物科技有限公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（G1120-100）购自北京索莱宝科技公司；Masson染色（G1006）购于武汉塞维尔生物；R428（> 98 %，ab141364）及Gas6、Axl抗体（ab232720、ab215205）购自英国Abcam公司；p-Axl抗体（SAB4504605）购自德国默克集团。

1.2 方法 1.2.1 构建糖尿病大鼠模型

先适应性喂养1周，所有48只造模大鼠给予单次腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素，72 h后血糖仪随机测大鼠空腹血糖（FBG），FBG≥16.7 mmol/L表示糖尿病大鼠模型构建成功，随后造模大鼠给予高脂饲料喂养4周，对照组大鼠给予普通饲料喂养^[6]。

1.2.2 分组与处理

将造模成功大鼠随机分为模型组（DM组）、贝母素乙低、高剂量组（PMI-L、PMI-H组）、贝母素乙高剂量+通路抑制剂R428组（PMI-H+R428组），各12只，另取12只正常大鼠作对照组（Control组）；PMI-L、PMI-H组^[7]：分别给予10、20 mg/kg贝母素乙灌胃；PMI-H+R428组^[8]：给予20 mg/kg贝母素乙灌胃及腹腔注射75 mg/kg R428；Control组与DM组灌胃与PMI-L、PMI-H组等量生理盐水；给药持续4周。

1.2.3 心肌功能检测

给药结束，30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉并固定大鼠，M型超声心动图连续测量5个心动周期的左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD），计算左室短轴缩短率（LVFS）。

1.2.4 FBG及心肌损伤标志物水平检测

心功能检测完毕，30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉各组大鼠，腹主动脉取血5 mL，随后处死取心肌组织，冷冻待用。将血液静置后，2 500 r/min离心5 min，离心半径10 cm，取上清液，全自动血液分析仪检测FBG、CK-MB、LDH水平。

1.2.5 心肌组织病理观察

取1.2.3收集的各组6个心肌组织，甲醛固定后浸蜡包埋，制成4 μm厚石蜡切片，然后脱蜡水化，HE染色，DAB显色，冲洗干净后，干燥封片，显微镜观察心肌组织切片病理情况。

1.2.6 心肌纤维化观察

取1.2.4制备的石蜡切片，常规脱蜡水化，加入Masson染色，冲洗后，加入苯胺蓝染色，水洗后干燥封片，显微镜观察心肌组织切片纤维化程度。

1.2.7 心肌细胞凋亡检测

取1.2.4制备的石蜡切片，脱蜡后，加入Triton X-100室温反应，再依次加入TUNEL、DAPI室温孵育，脱水封片，显微镜下观察TUNEL阳性细胞即凋亡细胞，分析心肌组织细胞凋亡情况。

1.2.8 心肌组织胶原蛋白检测

取1.2.4制备的石蜡切片，脱蜡后与0.01 mol/L枸橼酸钠溶液反应进行抗原修复，冷却后，加入过氧化氢反应，血清封片，加入胶原蛋白Ⅰ（COLⅠ）、胶原蛋白Ⅲ（COLⅢ）抗体4 ℃过夜孵育，次日加入山羊抗兔二抗室温孵育30 min，再依次与DAB、苏木素反应，脱水封片，荧光显微镜观察染色区域并收集图像，Image软件分析阳性染色区域光密度取均值。

1.2.9 Gas6/Axl信号通路相关蛋白检测

将各组剩余6个心肌组织蛋白裂解后，提取总蛋白BCA法定量，再将蛋白变性后40~60 V凝胶电泳4~5 h、200 V湿转膜1~2 h，封闭，然后将膜与兔源Gas6（1∶1 000）、p-Axl（1∶1 000）、Axl（1∶1 000）一抗4 ℃过夜共孵育，洗膜3次后再与山羊抗兔二抗孵育2 h，ECL显影，收集图像并进行条带灰度分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0进行统计分析，实验数据符合正态分布，以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05时表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 贝母素乙对糖尿病大鼠心肌功能的影响

DM组较Control组LVEDD、LVESD增大，LVFS降低（P < 0.05）；PMI-L、PMI-H组较DM组LVEDD、LVESD减小，LVFS升高（P < 0.05）；PMI-H+R248组较PMI-H组LVEDD、LVESD增大，LVFS降低（P＜0.05）。见表 1。

2.2 贝母素乙对糖尿病大鼠血糖及心肌损伤标志物水平的影响

DM组较Control组FBG、CK-MB、LDH水平升高（P＜0.05）；PMI-L、PMI-H组较DM组FBG、CK-MB、LDH水平降低（P＜0.05）；PMI-H+R248组较PMI-H组FBG、CK-MB、LDH水平升高（P＜0.05）。见表 2。

2.3 贝母素乙对糖尿病大鼠心肌组织病理变化的影响

Control组心肌纤维排列整齐，心肌细胞完整有序，无炎性细胞浸润；DM组较Control组心肌纤维断裂，心肌细胞排列紊乱，细胞肥大，细胞核固缩深染，炎性细胞浸润明显，细胞减少，可见纤维化；PMI-L、PMI-H组较DM组心肌纤维排列相对整齐，细胞形态相对正常，炎性细胞浸润减少，细胞增多，纤维化现象减少；PMI-H+R248组较PMI-H组心肌组织病理损伤加重，炎性细胞浸润及心肌组织纤维化明显。见图 1。

2.4 贝母素乙对糖尿病大鼠心肌组织纤维化程度的影响

胶原纤维呈蓝色，Control组存在少量胶原纤维；DM组较Control组胶原纤维沉积增多，且排列紊乱，分布弥散；PMI-L、PMI-H组较DM组胶原纤维沉积减少，且排列相对整齐；PMI-H+R248组较PMI-H组胶原纤维沉积明显增多。见图 2。

2.5 贝母素乙对糖尿病大鼠心肌组织胶原蛋白的影响

DM组较Control组COLⅠ、COLⅢ表达升高（P＜0.05）；PMI-L、PMI-H组较DM组COLⅠ、COLⅢ表达降低（P＜0.05）；PMI-H+R248组较PMI-H组COLⅠ、COLⅢ表达升高（P＜0.05）。见图 3、表 3。

2.6 贝母素乙对Gas6/Axl信号通路的影响

DM组较Control组Gas6、p-Axl/Axl表达降低（P＜0.05）；PMI-L、PMI-H组较DM组Gas6、p-Axl/Axl表达升高（P＜0.05）；PMI-H+R248组较PMI-H组Gas6、p-Axl/Axl表达降低（P＜0.05）。见图 4、表 4。

3 讨论

糖尿病发病受糖代谢异常、遗传、氧化应激等多因素相互作用影响，加剧病情，诱发心肌纤维化，心肌细胞凋亡，心功能障碍，进而引发心力衰竭甚至死亡。贝母素乙在治疗糖尿病、保护心功能等方面具有重要作用。研究显示，贝母素乙可抑制肾小球系膜氧化应激水平及细胞凋亡，保护糖尿病肾病大鼠肾功能^[7]；还可以抑制心肌细胞的凋亡，缓解炎症水平，保护柯萨奇B病毒性心肌炎新生小鼠心肌受损，并显著改善其心脏功能^[9]。本研究结果显示，贝母素乙可降低血糖，减少胶原纤维沉积及心肌细胞凋亡，保护糖尿病大鼠心肌损伤。

心肌纤维化是糖尿病心肌病主要病理基础，主要是由于胶原纤维过量沉积导致，而COLⅠ、COLⅢ胶原蛋白主要分布在心脏细胞外基质，是造成胶原纤维沉积的主要成分，参与糖尿病心肌病发生发展进程，并发挥重要作用^[10]。心肌胶原蛋白的合成与降解处于平衡状态，对于维持心脏结构和功能具有重要作用，而心肌胶原蛋白合成增多会导致胶原纤维沉积，促使心肌纤维化，引发心功能障碍，甚至死亡。研究显示，减少COLⅠ、COLⅢ的合成可以减缓心肌纤维化症状^[11]。另外抑制COLⅠ、COLⅢ表达可改善心肌收缩功能障碍及肥厚和损伤，减轻2型糖尿病大鼠心肌纤维化^[12]。本研究显示，贝母素乙可抑制COLⅠ、COLⅢ表达，抑制糖尿病大鼠心肌纤维化。

心肌纤维化的最终将会导致心功能障碍，甚至死亡，期间往往伴随着心肌损伤。LVEDD、LVESD、LVFS等心功能相关指标的高低是评价心功能最直接表现方式，LVEDD、LVESD减小，LVFS升高可以改善糖尿病大鼠心功能^[13]。另外研究显示，抑制COLⅠ、COLⅢ表达，升高LVFS，可减轻心肌纤维化程度，改善糖尿病心肌病大鼠心功能^[14]。CK-MB、LDH是心肌损伤常见标志物，降低CK-MB、LDH水平，可以减轻心肌损伤，减少心肌细胞凋亡，减少心肌胶原纤维，保护糖尿病大鼠^[15]。研究显示，降低CK-MB、LDH水平，抑制COLⅠ、COLⅢ表达，可减轻2型糖尿病大鼠心肌纤维化，发挥保护心脏作用^[16]。本研究结果显示，贝母素乙治疗大鼠后，大鼠心功能指标明显改善，提示贝母素乙可改善糖尿病大鼠心功能。

GAS6/Axl信号通路参与调控细胞增殖、凋亡、趋化、免疫调节等多种细胞功能，还有降血糖、保护心肌等作用。已知GAS6属于维生素K依赖性蛋白家族成员，单跨膜蛋白Axl属于TAM（Tyro3、Axl和Mertk）受体酪氨酸激酶家族，GAS6可通过与其位于细胞膜表面的受体Axl结合，激活AXL，进而调控多种通路，抑制胶原合成及心肌细胞凋亡等进程，维持体内的稳定，发挥心肌保护的作用。研究显示，上调GAS6表达可以降低2型糖尿病小鼠的高血糖，维持体内葡萄糖稳态^[17]。Axl的表达水平与心肌纤维化过程密切相关，上调Axl表达可降低心肌纤维化细胞的活力，抑制细胞增殖，进而改善心肌纤维化，延缓心肌重构^[18-19]。激活GAS6/Axl信号通路可抑制心肌氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和线粒体功能障碍，减轻心肌组织损伤，发挥心肌保护作用^[20-21]。本研究结果显示，贝母素乙可上调Gas6、p-Axl/Axl表达，推测其可能激活GAS6/Axl信号通路抑制糖尿病大鼠心肌纤维化，另外对糖尿病大鼠进行通路抑制剂R248处理，发现R248可逆转贝母素乙对DM大鼠心肌纤维化的改善作用，说明贝母素乙可通过激活GAS6/Axl信号通路抑制糖尿病大鼠心肌纤维化。

综上所述，贝母素乙可抑制糖尿病大鼠心肌纤维化，其作用机制与激活GAS6/Axl信号通路有关。本研究仍存在不足之处，贝母素乙参与糖尿病、心肌损伤等进程的GAS6/Axl信号通路，对糖尿病引起的心肌纤维化具体作用机制尚不清晰，另外本研究初次探讨贝母素乙对糖尿病引起的心肌纤维化的影响，其中间的调控机制尚不清楚，可能通过调控多条通路影响糖尿病大鼠心肌纤维化，其具体作用机制还需进一步探究。