牙周病特指只出现于牙周支持组织的各种病变，是造成牙齿松动的重要原因，在老年人群中的发生率超过80%~90%，是口腔卫生的头号“杀手”^[1]。牙周支持组织的损伤可致炎性浸润及炎症因子的增多，而病菌及其产物、细胞内毒素、肽基精氨酸脱亚胺酶等毒力因子可侵入体循环，诱发全身性疾病^[2]。目前临床上通常采用一般治疗及抗生素等药物辅助治疗，虽具有消炎杀菌、使用方便、起效快的作用特点，但是长时间、大剂量反复用药易引起耐药性，胃肠道及肝肾毒性等不良反应大且病情反复，达不到提高宿主免疫防御功能的效果^[3]。中医更加注重整体的辨证论治，认为肾脏为精气之根本，肾主骨，齿为骨之余，精固则齿坚，齿病则因在于肾^[4]。因此中医在治疗牙周病时，多秉持着外散风火、内清积热、滋阴补肾、清热解毒、凉血活血和祛瘀止痛的原则。对肾虚血热型牙周病的治疗旨在助阳补肾、滋阴清火，达到扶正祛邪、标本兼治的目的^[5]。

补肾固齿丸能显著提高牙周炎患者的临床有效率，炎症反应及牙周状态均有明显改善，体现为血清炎性因子超敏C反应蛋白(hsCRP)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平得到显著抑制；菌斑指数评分(PLI)、探诊出血(BOP)、探诊深度(PD)、临床附着丧失(CAL)等均有明显降低，患者口腔功能恢复^[6-8]。并通过调节血清骨钙素(OCN)的表达水平改善慢性牙周炎模型大鼠牙槽骨吸收、促进牙槽骨修复重建过程^[9]。方中各药配伍，共奏滋阴补肾、强筋健齿、活血消瘀、凉血解毒之功。因此该研究旨在通过采用网络药理学及分子对接的方法对补肾固齿丸复方治疗肾虚血热型牙周病有效物质基础及作用机制进行探讨，以期为该方在后续实验研究及临床应用提供理论基础。

1 材料和方法 1.1 材料

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/index.php)，本草组鉴(HERB，http://drug.ac.cn/)，中医药百科全书(ETCM，http://www.tcmip.cn)，中医药整合药理学研究平台(TCMIP) v2.0(http://www.tcmip.cn)，有机小分子生物活性数据(PubChem，http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白质数据库(UniProt，http://www.uniprot.org/)，Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/，http://www.swisstargetprediction.ch/)，在线《人类孟德尔遗传》(OMIM，https://omim.org/)，人类基因数据库(GeneCards)(https://www.genecards.org/)，蛋白质互作数据库(STRING，http://string-db.org/)，富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/)，Cytoscape 3.8.2软件，Metascape基因富集分析平台(https://metascape.org/)，世界蛋白质数据库(RCSB PDB，https://www.pdbus.org/)，分子操作环境(MOE)2019软件，补肾固齿丸(成都九芝堂金鼎药业有限公司)。

1.2 方法 1.2.1 补肾固齿丸化学成分靶标

在TCMSP/HERB等数据库和平台中检索补肾固齿丸复方中“熟地黄”“地黄”“鸡血藤”“紫河车”“盐骨碎补”“漏芦”“酒丹参”“酒五味子”“山药”“醋郁金”“炙黄芪”“牛膝”“野菊花”“茯苓”“枸杞子”“牡丹皮”“盐泽泻”“肉桂”共18味药材对应的活性成分，按照相应的药物代谢动力学(ADME)参数，根据口服生物利用度(OB)和类药性(DL)，设定0B≥20%且DL≥0.1，及Lipinsk五原则(Mw≤500，miLogP≤5，nOHNH≤5，nOH≤10)的条件进行筛选。并在蛋白数据库查询靶标的基因名和Uniprot ID。

1.2.2 牙周病相关基因

在Genecards及OMIM数据库查询“Kidney deficiency and blood heat periodontal disease”“Kidney blood heat type periodontal disease”所对应的靶标作为疾病靶标信息。

1.2.3 补肾固齿丸复方治疗牙周病相关靶标预测

采用R语言代码对补肾固齿丸治疗牙周病的共同靶标统计，并对此进行蛋白互作(PPI)网络分析，通过Cytoscape 3.8.2软件进行可视化及模块分析，筛选均大于介数中心性及度中心性平均值的成分，留作后续分析。在该软件中筛选这些成分大于度中心性平均值的靶标，作为后续分析的靶标。

1.2.4 基因功能估计分析

将筛选的靶基因通过Metascape平台进行GO功能富集分析，P值< 0.01，并以条形图展示。

1.2.5 KEGG富集分析

采用Metascape平台对筛选的靶基因进行KEGG通路富集，挑选与肾虚血热型牙周病相关的信号通路，设定P值< 0.01。

1.2.6 补肾固齿丸复方核心成分与关键蛋白分子对接

下载核心成分2D结构的sdf文件及PDB格式的蛋白结构。按照文献[10]进行蛋白筛选，具体原则如下：来源于HUMAN，分辨率≤2.5Å、并尽可能低，结构中有共晶小分子配体且配体与待对接小分子相似度高(RMSD≤2Å)，蛋白结构氨基酸序列较完整。利用MOE 2019软件对蛋白进行准备(去水、去小分子、能量最小化等)，并利用分子空洞技术判断活性位点(例如软件中site Finder模块，根据经验规律，疏水残基最多的空洞为活性位点)后进行诱导性对接；通过结合能Score值来判断两者结合能力的大小，Score值越小，结合能力越强，表示小分子越容易与受体蛋白结合。

2 结果 2.1 固齿丸复方中活性成分及疾病及成分对应靶标预测

在TCMSP及HERB、ETCM、TCMIP数据库及平台中查询到符合筛选条件的“补肾固齿丸”复方中活性成分共1 081个。在Genecards及OMIM数据库共收集到肾虚血热型牙周病相关靶标5 310个，合并后去除重复数据，得到3 193个疾病靶基因。将各个平台及数据库中查询筛选出的1 081个化学成分对应的靶标，通过Uniprot数据库查询蛋白的基因名，去除重复数据后共得到2 060条靶基因。

2.2 补肾固齿丸有效活性成分治疗牙周病相关靶标的PPI网络构建与分析

将补肾固齿丸复方中筛选得到的药物靶标与得到的疾病靶标利用R语言代码进行韦恩图及交集靶标的分析，并按照≥介数中心性及度中心性均值的条件筛选得到12个核心成分，见表 1。其共同靶标有296个，大于度中心性均值的前25位的靶标分别为核受体辅激活因子2(NCOA2)、环加氧酶1(PTGS1)、雌激素受体1(ESR1)、雄激素受体(AR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、醛糖还原酶抗体(AKR1B1)、尿激酶(PLAU)、雌激素受体2(ESR2)、雌激素合成酶(CYP19A1)，作为后续分析的靶标。

运用R语言对296个关键靶标进行可视化，并形成条形图，见图 1。同时在String平台将上步中得到的25个药物靶基因进行分析，结果显示该网络中共有节点25个，边96条，见图 2。两者交集的靶基因有3个，分别为ESR1、EGFR、PIK3CA，说明这3个靶基因在疾病治疗过程中发挥重要作用。

2.3 补肾固齿丸“活性成分-成分对应靶标-牙周病相关靶标”网络的构建

利用Cytoscape 3.8.2软件构建补肾固齿丸“活性成分-成分对应靶标-牙周病相关靶标”网络。并进行网络拓扑学结构分析，按照文献[11](以均≥介数中心性及度值均值)筛选条件筛选出关键靶标126个，含有PTGS1、AR、CYP19A1、ESR2、ESR1、11-β-羟基类固醇脱氢酶1(HSD11B1)、孕激素受体(PGR)、聚[ADP-核糖]聚合酶1(PARP1)、环加氧酶2(PTGS2)、人腺苷A2A受体(ADORA2A)等关键靶标。见图 3。

2.4 GO功能分析结果

在Metascape平台对2.3步中筛选出来的25个关键靶基因进行GO生物学功能富集分析，设定P < 0.01。发现这25种关键蛋白主要参与的生物过程有程序性细胞死亡的正向调节、细胞对有机氮化合物的反应、酶联受体蛋白信号通路、miRNA转录的调控、神经元凋亡过程的调节、凋亡信号通路、平滑肌细胞增殖的调节等。主要参与的分子功能为核受体活性、蛋白激酶活性、酶激活剂活性、生长因子结合、血红素结合、内肽酶活性、蛋白质同二聚活性。细胞组分主要富集在核膜、转录调控复合体、染色体/端粒区及细胞前缘位置。详见图 4、5、6。

2.5 KEGG通路富集分析

将25个关键靶基因通过Metascape平台进行通路富集。共得到10条KEGG通路，其中与牙周病相关的有2条，分别为细胞肿瘤抗源(P53)信号通路及核因子-κB(NF-κB)通路。说明这2条信号通路在补肾固齿丸治疗肾虚血热型牙周病过程中起到重要作用。见图 7。

将2.3中筛选出的19个关键靶基因和2条牙周病相关的信号通路导入Cytoseape 3.8.2软件构建“化学成分-靶基因-信号通路”网络。见图 8。

2.6 核心成分与核心蛋白分子对接分析

将2.2结果中得到的12种核心成分与3种网络靶标(ESR1、EGFR、PIK3CA)所对应的蛋白复合晶体进行对接。以结合能Score得分及相互作用对的数目判断其亲和力的大小，S < 0(小分子配体与蛋白受体能自发结合)，S≤-4.25 kcal/mol(配体与受体有一定的结合能)，S≤-5 kcal/mol(配体与受体结合能力较高，形成的构象能量低，结构稳定)，S≤-7 kcal/mol(配体与受体结合能力较强)。发现各小分子配体与受体蛋白均有一定的相互作用；其中Garcinone D、Calycosin、Crotepoxide、Cnidiadin及L-Octanoylcarnitine分子与ESR1，137704501、Garcinone D分子与EGFR，137704501、Garcinone D及Crotepoxide分子PIK3CA结合能力较强。见表 2、图 9。

3 总结

牙周病即为通常所说的牙龈发炎、出血和牙齿松动，是口腔最常见的疾病之一，也是成年人牙齿丢失的首位因素；具有病发率高、发病隐蔽、病程较长、危害性高的特点。按照病程及危及组织的不同，牙周病可分为2种类型，一种是牙龈病(gingival disease)，另一种为牙周炎(periodontitis)；其中牙龈病仅累及牙龈组织，而牙周炎则损害牙周深层组织(牙周膜、牙槽骨、牙骨质)。牙周病所致的炎症反应可随着体循环，引起全身性疾病(例如关节炎、肾小球肾炎、心脏内膜炎症等)，同时也是造成神经系统疾病^[12]、心脑血管/糖尿病^[13]、呼吸系统/骨质疏松症、早产等疾病的发病因素^{[5, 14]}。西医表明牙周病的病因主要在于牙菌斑(dental plaque)细菌及其产物在牙齿表面的黏附以及因营养代谢障碍、内分泌紊乱、自主神经功能紊乱等导致细菌侵袭与宿主防御间动态平衡的破坏有关。根据中医理论，肾藏精，主骨，是人体生长发育的主要器官，肾精具有促进骨骼生长发育和修复的作用；齿为骨之余，与骨同源，赖于肾精充养而生长发育，肾虚精亏血少，齿失濡养，引起骨质瘘软，兼以阴虚火旺，虚火上炎于龈肉，久则牙齿动摇、根露；或因宿体虚弱，或因久病耗伤正气，气血不足，牙龈失于滋养而病邪乘虚而入，以致龈肉菱缩，血不循经，齿龈出血，故成此病。因此，牙齿的生长和脱落与肾气的盛衰密切相关，有“肾虚齿豁”的观点，所以在治疗肾虚血热型牙周病时，要注意补肾凉血，从而强固牙齿^[15]。

补肾固齿丸由熟地黄、生地黄、紫河车等18味药材组成，其中，熟地黄填精益髓、补益肝肾，为君药；紫河车、盐骨碎补、生地黄、鸡血藤、山药、枸杞子、炙黄芪补肝肾、益精血，又能活血凉血、通经活络，共为臣药；丹参、五味子、盐泽泻、牛膝、漏芦、牡丹皮、野菊花能生津润肺、健脾利湿，又能祛瘀排脓、消肿止痛，共为佐药；肉桂引火归原，为使药。本着“肾生骨生髓”“齿为骨之余”的中医理论，既补肾益精、治其本，又能清热解毒治其标，具有补肾固齿，活血解毒的功效，故适用于治疗肾虚火旺所致的牙齿酸软、咀嚼无力、松动移位、龈肿齿衄，而慢性牙周炎体现为上述症状。

研究证实，补肾固齿丸0.8 g/(kg·d)给药30 d即可显著改善SD大鼠牙周组织炎症反应、降低骨胶原酶13(MMP-13)的表达，延缓牙周组织破坏^[16]。联合消炎汤治疗肾虚火旺型牙周炎的应用中，患者总有效率为82.98%，可有效改善牙龈出血、牙齿松动等症状，临床疗效显著^[17]，且牙槽骨密度增高、肾虚火旺主症(牙齿酸软、咀嚼无力、龈肿、齿衄及松动移位)及次症(耳鸣、腰膝酸软、五心烦热、潮热盗汗、口咽干燥、发脱、神疲乏力及舌象)评分等级降低、安全性良好^[18]。

这与现代药理学研究的发现不谋而合^[19]。牙龈卟啉单胞菌(P.g)是导致牙周病的最大因素之一，它是一种非酵解糖的革兰氏阴性厌氧球杆菌，形成的牙菌斑生物膜积聚在牙齿和牙根表面，导致牙周结缔组织和牙槽骨的破坏，是牙齿丢失最常见的原因之一^[20]。中药及其提取物对炎症反应、细胞生长及组织修复等具有显著效应。

槲皮素作为广谱抗菌活性的黄酮类物质，具有较强的抑菌活性，尤其是革兰阴性菌；通过抑制NF-κB/血管紧张素(NLRP3)炎症通路，降低炎症因子TNF-α诱导下人牙周韧带干细胞受损^[21-22]，提高其抗氧化能力，增强间充质干细胞的成骨分化能力，逆转脂多糖诱导的成骨细胞凋亡，同时激活核因子NF-E2相关因子(Nrf2)信号通路，降低牙周炎组织中活性氧(ROS)水平，缓解牙槽骨丢失，保护其成骨能力^[23-25]。

大黄素可显著抑制脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜细胞的增殖活性^[26]，在抑制NF-κB信号通路表达，降低炎性因子IL-1β、白细胞介素-4(IL-4)和IL-6合成及分泌的同时，提高牙周组织过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR)-γ表达，从而减轻炎性因子对牙周组织的破坏、降低机体的炎症反应^[27]；并通过调节酸性哺乳动物几丁质酶(AMCase)，一种参与骨重建的生物标志物的表达，显著降低破骨细胞分化因子(RANKL)诱导下破骨细胞生成，提高牙周组织中骨钙素(BGP)水平，促进牙周组织恢复、降低炎症反应及牙槽骨的丢失^[28-29]；蛇床子素(Cnidiadin)亦然^[30-31]。

异甘草素(Isoliquiritigenin)源于甘草，具有广泛的生物和药理活性，例如抗氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤及雌激素活性等；已有研究证实其可通过下调自噬和NF-κB信号通路的表达抑制体内破骨细胞形成和炎性骨吸收来防治骨破坏、促进成骨细胞增殖及分化；P53是成骨/破骨细胞增殖分化中重要的调节因子，通过诱导细胞周期停滞和/或凋亡来保护细胞免于转化，当其表达被抑制后，其下游信号分子抑癌基因(P21)表达也相对减少，成骨细胞分化增加，血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管生成分化增加；由此可见，P53信号通路可能为异甘草素抑制发挥抗炎、促进成骨细胞增殖分化的新途径^[32-33]。

辛酸(Octanoic acid)为茯苓、牛膝及肉桂中的成分，有研究报道：作为食品添加剂，辛酸具有对P.g杀菌活性，抑制菌斑生物膜的形成^[34]；虽然目前暂未有其他小分子及辛酸对牙周重建等的相关研究，但对疾病关键靶标ESR1、EGFR、PIK3CA均具有较好的结合能力，表明这些小分子将有可能是防治牙周病的新型治疗物质，具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，文章通过采用网络药理学的方法对补肾固齿丸治疗肾虚血热型牙周病的物质基础、作用靶标及通路进行预测分析，建立了复方活性成分-疾病靶标-作用通路相互作用网络图；并进一步通过分子对接手段对起主要作用的12个关键成分为槲皮素(Quercetin)、辛酸(Octanoic acid)及大黄素(Emodin)等与3种核心靶标蛋白(ESR1、EGFR、PIK3CA)所对应的蛋白复合晶体进行对接，均具有较好的结合能力。说明补肾固齿丸可通过多靶标、多通路的干预，对牙周病相关牙菌斑生成、免疫调节及炎症反应、抗氧化应激、减轻牙槽骨丢失等方面起到调节作用，以达到治疗肾虚血热型牙周病的作用。