糖尿病肾病（DN）是2型糖尿病（T2DM）的常见并发症，主要与体内长期的高糖环境导致的肾脏结构和功能损害有关，已成为全球终末期肾脏疾病的主要原因^[1]。DN发病隐匿、患病率高且后期预后较差^[2]。目前治疗DN主要以降血糖、降血压、调血脂、减少尿蛋白为主^[3]，治疗手段局限且不良反应明显^[4]。而随着中国DN发病率逐年升高，开发安全可靠的药物用于DN的早期干预及后期治疗迫在眉睫。

中医药在DN的治疗中具有巨大的优势^[5]。槲皮素可能通过靶向丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导在T2DM中具有治疗作用^[6]。桔梗皂苷D可以通过抑制肾脏氧化应激和炎症反应，缓解DN肾损伤^[7]。酸枣仁皂苷A和薯蓣皂苷均能通过激活线粒体自噬，抑制肾脏氧化应激和细胞死亡，从而缓解肾损伤^[8-9]。

藏红花素（CRO）是传统中药藏红花的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等多种作用^[10]，有研究发现，CRO能够通过抑制氧化应激和炎症反应发挥缓解DN肾损伤的作用^[11-12]，但其治疗DN的作用机制尚不明晰。本研究通过建立DN小鼠模型，研究CRO对DN小鼠的治疗作用，并从脂质过氧化和铁死亡角度研究CRO治疗DN的作用机制。

1 材料 1.1 动物

SPF级健康雄性C57BL/6小鼠[北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0008]，体质量20~22 g，5只小鼠一笼饲养于24 ℃，50%相对湿度，明暗周期12 h的室内，小鼠可以自由进食饮水。

1.2 药品与试剂

铁死亡抑制剂Fer-1（货号：HY-100579，MCE）；藏红花素（货号：17304，美国Sigma）；BCA法微量蛋白检测试剂盒（货号：W041-1-1，南京建成生物工程研究所）；牛血清白蛋白（货号：BSA，W071-1-1，南京建成生物工程研究所）；Masson染液（货号：D026-1-3）、苏木素-伊红（HE）染液（货号：D006-1-4）、肌酐（Cr）测定试剂盒（货号：C011-2-1）、尿素氮（BUN）测试盒（货号：C013-2-1）、尿蛋白定量（UPQ）测试盒（货号：C035-2-1）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（货号：A003-1-2）、活性氧（ROS）测定试剂盒（货号：E004-1-1）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）测试盒（货号：H268-1-2）、总铁（Fe）测试盒（货号：A039-2-1）均购自南京建成生物工程研究所；TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）染色试剂盒（货号：C1082）购自碧云天；一抗：前列腺六跨膜上皮抗原3（STEAP3，货号：K001723P）、转铁蛋白（TF，货号：K002787P）、重链铁蛋白（FTH1，货号：K108517P）、轻链铁蛋白（FTL，货号：K002972P）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4，货号：K113159P）；二抗：羊抗兔IgG-HRP（货号：SE134）均购自北京索莱宝科技有限公司；总RNA提取试剂盒（货号：#DP419）、cDNA反转录试剂盒（货号：#KR116-02）、SYBR扩增试剂盒（货号：#P205-02）均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 仪器

SpectraMax M3多功能酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；5427R高速台式冷冻离心机（艾本德中国有限公司）；PowerPAC Basic电泳仪和ChemiDoc XRS凝胶成像自动分析仪（Bio-Rad公司）；LEPGEN-96荧光定量PCR仪（北京乐普）。

2 方法 2.1 造模、分组与给药

造模：60只小鼠适应性喂养1周，高脂饮食（HFD）继续喂养8周，之后开始造模。造模方法如下：禁食不禁水12 h后，腹腔注射链脲霉素（STZ）30 mg/kg。正常组腹腔注射等体积的1% 柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾静脉采血测定随机血糖，以随机血糖≥ 16.7 mmol/L为T2DM成模标准。之后继续喂养，每周检测小鼠24 h尿蛋白定量（24 h-UPQ）。以随机血糖水平≥16.7 mmol/L、24 h-UPQ≥20 mg作为DN模型标准。

分组：造模结束后，随机平均分为正常组、模型组、铁死亡抑制剂组（Fe-1）、低剂量CRO组（CROL）、中剂量CRO组（CROM）、高剂量CRO组（CROH）6组。

给药与取样：正常组与模型组每天灌胃0.2 mL生理盐水，Fe-1组每天灌胃10 mg/kg Ferrostatin-1，CROL、CROM和CROH组每天分别灌胃5、10、20 mg/kg CRO，CRO剂量根据之前报道设计^[12]。连续给药8周后，使用代谢笼收集各组小鼠24 h尿液样本。通过目内眦取血获得血液样本。安乐死后打开腹腔，收集左侧肾脏固定于4%多聚甲醛中，右侧肾脏冷冻保存。

2.2 肾功能与脂质过氧化相关指标检测

将收集的24 h尿液在4 000×g离心10 min，随后分离上清液，使用试剂盒24 h-UPQ的含量。血液4 000×g离心15 min，收集血清，使用试剂盒测定Cr、BUN水平。取部分冷冻的肾组织1∶9与生理盐水混合匀浆，4 000×g离心20 min后收集上清液，使用试剂盒测定脂质过氧化相关指标MDA、ROS、4-HNE水平，使用试剂盒测定肾组织Fe水平，同时检测组织匀浆中总蛋白浓度对样本进行均一化处理。

2.3 病理学染色

取出用4%多聚甲醛溶液固定好的肾脏组织脱水、包埋并切片（4 μm），然后分别进行HE、Masson和TUNEL染色，观察肾脏组织病理形态与纤维化情况。

2.4 实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应（RT-qPCR）检测铁死亡相关基因表达

按照总RNA提取试剂盒的方法从肾组织及细胞中提取总RNA，之后反转录获得cDNA，最后使用qPCR测定目的基因的mRNA表达量。引物序列见表 1，使用2^-ΔΔCT法基于Actb计算目标mRNA相对表达量。

2.5 蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测铁死亡相关蛋白表达

取30 mg肾组织提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。提取的蛋白质通过SDS-PAGE分离后电转到PVDF膜。使用5%脱脂奶粉溶液封闭膜2 h，随后用目的蛋白的抗体在4 ℃下孵育过夜。用TBST清洗3次孵育后的膜，然后用HRP标记的二抗在室温下培养2 h，再次洗膜后经ECL化学发光显影，最后使用Image J软件对条带进行量化分析。

2.6 统计学分析

采用Excel 2022以及SPSS Pro在线数据分析平台进行数据分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 CRO对DN小鼠的治疗作用

肾功能检测结果显示，与正常组相比，模型组DN小鼠血清中Cr、BUN水平以及24 h-UPQ含量显著升高；与模型组相比，Fe-1组以及CROL、CROM、CROH组DN小鼠血清Cr、BUN水平均有不同程度的降低，Fe-1组和CROH组DN小鼠24 h-UPQ含量显著降低（图 1A-1C）。HE和Masson染色结果发现，与正常组相比，模型组出现肾小球肥大、系膜基质增生和肾小球基底膜增厚等病变，Fe-1组以及CROL、CROM、CROH组DN小鼠肾脏病理损伤均有不同程度的好转（图 1D，1E）。

3.2 CRO对DN小鼠脂质过氧化及细胞死亡的影响

与正常组比较，模型组DN小鼠肾组织MDA、ROS、4-HNE水平显著提高；与模型组比较，Fe-1组以及CROL、CROM、CROH组DN小鼠肾组织MDA、ROS、4-HNE水平显著降低（图 2A-2C）。

肾组织TUNEL染色结果显示，与正常组相比，模型组肾组织中出现大量绿色荧光，表明肾组织发生细胞死亡。与模型组相比，Fe-1组以及CROL、CROM、CROH组肾组织中荧光阳性反应明显减弱（图 2D，2E）。

3.3 CRO对DN小鼠铁死亡的影响

对肾组织Fe水平检测发现，与正常组相比，模型组肾组织Fe水平明显升高，与模型组相比，Fe-1组以及CROM、CROH组肾组织Fe水平出现不同程度降低（图 3A）。

RT-qPCR结果显示，与正常组相比，模型组DN小鼠肾组织Steap3、Trf mRNA表达明显升高，Fth1、Ftl、Gpx4 mRNA表达明显降低；与模型组相比，Fe-1组以及CROL、CROM、CROH组DN小鼠肾组织Steap3、Trf mRNA表达出现不同程度降低，Fth1、Ftl、Gpx4 mRNA表达出现不同程度升高（图 3B）。

Western blot结果显示，与正常组相比，模型组DN小鼠肾组织中STEAP3与TF蛋白表达明显升高，FTH1、FTL以及GPX4蛋白表达明显降低；与模型组相比，Fe-1组以及CROL、CROM、CROH组DN小鼠肾组织中STEAP3与TF蛋白表达不同程度降低，FTH1、FTL以及GPX4蛋白表达不同程度升高（图 3C，3D）。

4 讨论

HFD饮食联合STZ注射诱导是一种经典的DN模型造模方法，造模成功后可以表现出与人类DN相似的症状^[13]。HFD饮食可诱发小鼠的胰岛素抵抗，STZ注射后可使小鼠胰腺β细胞坏死引发胰岛素分泌功能丧失，两者联合使用可引发肾脏功能性病变与损伤^[14]。24 h-UPQ、Cr、BUN是评估DN的敏感指标，主要反映肾小球滤过功能受损情况，水平升高提示肾功能减退^[15-17]。本研究中DN小鼠肾脏出现严重病变，主要表现为肾小球和肾小管上皮细胞肥大，基底膜增厚等，与上述症状相当，提示造模成功。Fe-1与CRO治疗后有效地改善了上述DN症状，但其作用机制尚不清楚，需要进一步研究。

有研究表明，脂质过氧化在DN发展中起到了重要的作用^[18]。因此，本研究接下来检测了MDA、ROS、4-HNE等指标以便研究CRO对DN小鼠脂质过氧化的影响。在高糖环境中，机体产生的ROS明显升高，细胞膜脂质双层中的ω-6多不饱和脂肪酸如亚油酸及花生四烯酸在ROS的作用下发生脂质过氧化^[19-20]，产生MDA以及4-HNE等醛基产物，影响细胞的信号转导及基因表达^[21-22]。极低浓度的MDA和4-HNE可参与机体的正常生理活动，而当其浓度升高时则可通过多种途径产生细胞毒性作用，导致细胞死亡^[23-24]。本研究发现，CRO干预可降低DN小鼠MDA、ROS、4-HNE水平，抑制脂质过氧化，减少肾组织细胞死亡，进而缓解DN肾损伤。

研究表明，过量脂质过氧化物的产生会导致细胞发生铁死亡^[25]。铁死亡与DN发展有着非常密切的联系。1项回顾性研究显示，与健康人群相比，DN患者的肾小管上皮细胞显示出更高的铁沉积和转铁蛋白表达^[26]。而另1项体外实验表明，铁死亡激动剂（如RSL3）能够诱导肾小管细胞死亡，促进DN进程^[27]。因此，本研究检测了铁死亡相关因子（Fe水平、STEAP3、TF、FTH1、FTL和GPX4）的表达以探究CRO对DN小鼠铁死亡的影响。铁死亡主要与铁代谢紊乱、GPX4抗氧化以及脂质过氧化有关^[28]。生理状态下，Fe³⁺经由TF进入细胞内，并被STEAP3还原成Fe²⁺，Fe²⁺可以与铁蛋白（FTH1/FTL）结合储存于细胞内，也可被氧化成Fe³⁺通过膜转铁蛋白转出细胞，参与体内铁循环，维持机体铁稳态^[29-30]。有研究表明，高血糖会导致铁过载，当铁过载时，高浓度的Fe²⁺发生芬顿反应，产生ROS造成细胞膜氧化损伤，最终导致细胞铁死亡^[31]。本研究发现，模型组DN小鼠肾组织Fe水平显著高于正常组，这可能与其STEAP3与TF显著升高以及FTH1与FTL显著降低有关，而CRO干预改善了上述指标，减轻了DN小鼠肾组织铁死亡。此外，GPX4是已知的唯一能够直接清除脂质过氧化物的酶，在铁死亡的过程中发挥核心调控的作用，敲除GPX4相关基因或使用GPX4抑制剂（如RSL3）将会诱导细胞铁死亡^[32]。本研究发现，CRO可上调GPX4表达，进而清除ROS，抑制脂质过氧化，减轻细胞铁死亡，最终缓解DN肾损伤。为了进一步确定CRO治疗DN的作用机制，本研究选取铁死亡抑制剂Fe-1作为阳性对照，结果表明，CRO发挥了与Fe-1相近的治疗作用。

综上所述，CRO可以通过抑制脂质过氧化并减轻细胞铁死亡发挥对DN小鼠肾脏的保护作用。