2024, Vol. 41文章信息
- 王越, 张敏, 谢明水.
- WANG Yue, ZHANG Min, XIE Mingshui.
- 18β-甘草次酸通过调控PIM1对宫颈癌细胞及裸鼠移植瘤自噬与凋亡的影响
- Effects of 18β-glycyrrhetinic acid on autophagy and apoptosis of cervical cancer cells and transplanted tumor in nude mice by regulating PIM1
- 天津中医药, 2024, 41(4): 517-525
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2024, 41(4): 517-525
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2024.04.20
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文章历史
- 收稿日期: 2023-11-09
2. 随州市疾病预防控制中心, 随州 441300
宫颈癌是女性四大最常见的肿瘤类型之一，仅在2020年，全球就有60.4万宫颈癌新发病例，34.2万人死于宫颈癌[1]，对女性健康构成巨大威胁。目前，多数早期宫颈癌患者可通过根治手术或放化疗治愈[2-3]。但对于高风险局部晚期及复发转移的患者，常用同步放化疗常引起恶心、呕吐、腹泻等不良反应[4-5]，且导致患者生存时间短，效果差，副作用大，预后较差[6]。寻找宫颈癌有效治疗靶点和药物非常重要。在多种实体瘤高表达的原癌基因PIM1编码蛋白可以抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖[7]，与患者的不良预后相关，已成为癌症的候选治疗靶点[8]。在宫颈癌中，PIM1显著过表达，且宫颈癌患者中PIM1水平的升高与肿瘤大小的增加、转移几率的增加呈正相关，抑制PIM1能促进宫颈癌细胞凋亡[9]。常见的PIM1抑制剂主要为小分子化合物，中药方面的抑制剂研究较少[10]。随着中医药的发展，大量研究证实中药辅助肿瘤治疗能控制改善临床症状、调节免疫、减少不良反应[11]，发掘新的中药PIM1抑制剂将对于宫颈癌的治疗有重要意义。
甘草作为传统中药，能补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药[12]。《本草纲目》称之“普治百邪，得王道之化”[13]。甘草主要活性成分为甘草酸，口服后甘草酸在胃肠道中不可逆地转化为18β-甘草次酸[14]。18β-GA具有抗病毒[15]、抗炎[16-17]、抗肿瘤[18-19]等作用。用于肿瘤治疗不仅副作用小[18, 20]，对肝脏和心血管还有一定的保护作用[14]。然而，18β-GA对宫颈癌的治疗作用机制尚不十分明确。本课题组前期实验发现18β-GA可明显抑制宫颈癌Hela细胞PIM1蛋白的表达。本文以18β-GA作用于宫颈癌Hela细胞与Hela细胞移植瘤裸鼠，运用分子对接、细胞实验与动物实验探究18β-GA作用于宫颈癌的基因靶点与分子机制，为宫颈癌治疗药物的研发提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株与裸鼠人宫颈癌Hela细胞株，货号CL-0101，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，稳定传代至7~8代。10只4周龄雌性无胸腺裸鼠（BALB/C-nu）购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物质量合格证编号为210726230100560743。本研究所涉及实验均符合湖北医药学院伦理委员要求，伦理审查批准号：湖北医药学院动（福）第2022-实097号。
1.1.2 药物与试剂18β-甘草次酸（上海阿达玛斯试剂有限公司，纯度98%，批号P1623951）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号21080702）；杜氏改良Eagle培养基（美国Gibco公司，批号2478988）；胰蛋白酶1∶250（德国Biofroxx公司，批号1004GR025）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）、四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法试剂盒、DAPI试剂（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为G0002、G4101、G1012）；青霉素-链霉素溶液、二甲亚砜（DMSO）、β-Tubulin抗体、4%多聚甲醛固定液、Triton X-100（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C0222、ST038、AF1216、P0099、P0096）；瑞氏-吉姆萨染色液（广州捷倍斯生物科技有限公司，批号G4486）；PIM1（ST0513）抗体（美国Novus Biologicals公司，批号HN1102）；白细胞介素-6（IL-6）抗体、PCNA抗体和BCL-2抗体（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号分别为DK9816、BL3820、EC5205）；STAT3抗体、Phospho-STAT3（Tyr705）抗体、Beclin-1抗体（美国Cell Signaling公司，批号4904、9145、3495）；Lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司，批号为2232162）；山羊抗兔HRP免疫球蛋白G（IgG）抗体、Alexa Fluor 594标记驴抗兔IgG抗体（武汉安特捷生物技术有限公司，批号1559761021、1599271192）；RIPA裂解缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司，批号C1053）；PIM1 siRNA序列（正义链5'-GCCCUGAGACCAUCA-GAUA-3'、反义链5'-UAUCUGAUGGUCUCAGGGC-3'）、阴性对照siRNA（NC siRNA）和riboFECTTM CP转染试剂（广州市锐博生物科技有限公司，批号分别为stB0004651A、siN0000001-1-5、V0623）；pcDNATM3.1（+）哺乳动物表达载体（美国Thermo Fisher Scientific公司；批号2206962）。
1.1.3 主要仪器331型二氧化碳培养箱、1384 A2型生物安全柜（美国Thermo Fisher Scientific公司），CKX31型倒置显微镜、CX41型荧光倒置相差显微镜（日本Olympus公司），Centrifuge 5424 R型低温高速离心机（德国Eppendorf公司），Epoch多体积分光光度计（美国Biotek公司），Mini-PROTEAN Tetra电泳槽、Mini Trans-Blot电泳转印槽、PowerPac Basic电源、Gel DocTM XR+凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。
1.2 方法 1.2.1 瑞氏-吉姆萨染色及免疫荧光染色将10%胎牛血清、1%双抗与DMEM培养基中对数生长的Hela细胞，胰酶消化接种于6孔板与24孔板，贴壁生长后，设置空白组、18β-GA浓度梯度（50、100、150 μmol/L）实验组培养24 h，弃培养基，4 %多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤，0.5% Triton X-100通透10 min。6孔板滴加瑞氏-吉姆萨染色液染色1 min，再加2~3倍的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）充分混合，染色10 min。24孔板用5% 牛血清白蛋白（BSA）封闭30 min，吸去BSA加入PIM1抗体孵育1 h，PBS清洗，用荧光二抗孵育30 min，洗去二抗，DAPI染色1 min，以荧光倒置相差显微镜拍摄。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率胰酶消化对数生长的Hela细胞稀释为每孔1×104个接种于96孔板。100 μL培养基培养贴壁后吸去培养基，设置空白组（加入等量药物溶剂DMSO）、18β-GA浓度梯度（50、100、150 μmol/L）实验组，加入不同浓度培养基100 μL。培养24 h后弃旧培养基，每孔加20 μL MTT溶液再培养4 h。吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解孔内的甲臜沉积物37 ℃孵育15 min，充分溶解摇匀，以多体积分光光度计检测每孔490 nm波长处吸光度值，计算增值抑制率。
1.2.3 分子对接与相关性分析运用AutoDock Vina软件（https://autodock.scripps.edu/）[21]将18β-GA和PIM1进行分子对接。
1.2.4 转染siRNA胰酶消化对数期生长的细胞接种于6孔板，细胞贴壁密度为60%时分为NC siRNA组、NC siRNA+18β-GA（100 μmol/L）组、PIM1 siRNA组、PIM1 siRNA+18β-GA（100 μmol/L）组，按比例加入培养基、siRNA与转染试剂，培养24 h后在NC siRNA+18β-GA组与si-PIM1+18β-GA加入100 μmol/L 18β-GA，继续培养24 h用MTT检测细胞增殖抑制率，蛋白印迹法检测蛋白表达量。
1.2.5 过表达PIM1胰酶消化对数期生长的细胞接种于96孔板与6孔板，细胞贴壁密度为60%时分为空载体组、空载体加18β-GA（100 μmol/L）组、PIM1过表达组、PIM1过表达加18β-GA（100 μmol/L）组，将pcDNATM3.1（+）过表达质粒通过Lipofectamine 3000转染入Hela细胞中，48 h后在空载体加18β-GA组与PIM1过表达加18β-GA组加入100 μmol/L 18β-GA，继续培养24 h收集细胞以96孔板MTT法检测细胞增殖抑制率，免疫印迹检测6孔板转染效率及蛋白表达量。
1.2.6 构建裸鼠宫颈癌移植瘤模型及组织染色胰酶消化对数期生长，密度为80%~90%同一批次传代的10个平皿Hela细胞，用PBS轻轻吹打混匀离心弃上清液洗3遍，吸去PBS加入DMEM混匀，在细胞计数板计数调整悬液细胞浓度为5×106个/mL，在每只4周龄雌性无胸腺裸鼠皮下注射0.1 mL细胞悬液，待肿瘤体积生长至100 mm3左右时将10只裸鼠随机分为对照组和18β-GA组，每组5只。18β-GA组每天灌胃0.2 mL 100 mg/kg配比为2% DMSO+30% PEG300+5% Tween-80+63%生理盐水[22]的18β-GA溶液，对照组用相同配比未加18β-GA的溶液灌胃。每天观察裸鼠的生存状况，实验结束时将裸鼠麻醉安乐死。实验结束时使用游标卡尺测量肿瘤大小，分析天平称裸鼠移植瘤质量。将裸鼠移植瘤在PBS中清洗，置于4 ℃的10%福尔马林中，乙醇脱水处理后将组织浸入石蜡包埋、切片。将石蜡切片置于60 ℃温箱中30 min，浸入二甲苯再依次放入梯度浓度乙醇，分别进行HE染色与免疫荧光染色。加入柠檬酸盐缓冲液高压修复抗原，以3% H2O2阻断过氧化物酶，5% BSA 37 ℃温箱封闭30 min，弃封闭液加1∶100稀释一抗37 ℃孵育1 h，洗去一抗用1∶200稀释荧光二抗37 ℃孵育30 min，洗去二抗，DAPI染色1 min，使用抗荧光淬灭剂封片，以荧光倒置相差显微镜观察瘤组织形态差异。
1.2.7 蛋白免疫印迹法检测以RIPA缓冲液裂解液氮研磨后的裸鼠肿瘤组织与弃去上清的6孔板中Hela细胞，将提取的蛋白加入SDS-PAGE凝胶电泳后转印至PVDF膜上，冲洗并封闭以防止非特异性结合。加入1∶1 000稀释一抗，4 ℃摇床孵育24 h，TBST洗涤3次后加入HRP IgG二抗孵育1 h，再洗涤3次用凝胶成像分析系统扫描并分析条带。
1.2.8 统计分析运用Image J软件（https://imagej.net/software/imagej/）、GraphPad Prism 8软件（https://www.graphpad.com）对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 18β-GA对Hela细胞形态的影响空白组Hela细胞胞核清晰，细胞排列较为紧密。与空白组比较，随着18β-GA处理浓度的升高，细胞密度逐渐降低，细胞核变小；100 μmol/L组细胞排列松散，细胞质染色变淡，出现网状空泡；150 μmol/L组细胞核浓缩坏死，细胞质明显破损。见图 1。
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| 注：A，空白组；B，50 μmol/L 18β-GA组；C，100 μmol/L 18β-GA组；D，150 μmol/L 18β-GA组。 图 1 18β-甘草次酸对Hela细胞形态的影响（瑞氏-吉姆萨染色，×200） Fig. 1 Effects of 18 β-glycyrrhetinic acid on Hela cell morphology(Wright-Giemsa Stain, ×200) |
空白组PIM1染色的红色荧光主要定位于细胞核，DAPI染色可见细胞核呈圆形，发出均匀蓝色荧光。与空白组相比，随着18β-GA处理浓度的增加PIM1红色荧光强度明显减弱，凋亡细胞比例增加，100 μmol/L组细胞DAPI染色观察到染色质聚集（亮蓝色荧光）与凋亡小体，150 μmol/L组出现染色质凝集以及细胞核碎裂。见图 2。
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| 注：A，空白组；B，50 μmol/L 18β-GA组；C，100 μmol/L 18β-GA组；D，150 μmol/L 18β-GA组。 图 2 18β-甘草次酸对Hela细胞凋亡和PIM1表达的影响（免疫荧光，×200） Fig. 2 Effects of 18 β-glycyrrhetinic acid on apoptosis and PIM1 expression of Hela cells(IF, ×200) |
与空白组相比，实验组（50、100、150 μmol/L）Hela细胞OD490值降低，细胞增殖抑制率升高（P < 0.05或P < 0.01）；随着18β-GA作用浓度的增加，PIM1蛋白、抗凋亡蛋白BCL-2表达水平降低，自噬相关蛋白Beclin-1表达升高，呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P < 0.01）。见表 1和图 3。
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| 注：A，空白组；B，50 μmol/L 18β-GA组；C，100 μmol/L 18β-GA组；D，150 μmol/L 18β-GA组。与空白组比较，**P < 0.01，n=3。 图 3 18β-甘草次酸对Hela细胞蛋白表达的影响（x±s） Fig. 3 Effects of the 18β-glycyrrhetinic acid on protein expression of Hela cells(x±s) |
结果显示18β-GA可以与PIM1稳定结合，结合位点位于PHE-100，结合能为-7.3 kcal/mol，见图 4。
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| 图 4 18β-甘草次酸与PIM1分子对接 Fig. 4 18β-glycyrrhetinic acid docking with PIM1 molecule |
与NC siRNA组相比，NC siRNA+18β-GA组与PIM1 siRNA组OD490值降低，细胞增殖抑制率明显增高，PIM1与BCL-2蛋白表达水平均降低，Beclin-1蛋白表达水平增高，差异具有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与PIM1 siRNA组相比，18β-GA+PIM1 siRNA组细胞增殖抑制率、PIM1、Beclin-1与BCL-2蛋白表达水平无明显差异（P＞0.05）。见表 2与图 5。
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| 注：A，NC siRNA；B，NC siRNA+18β-GA组；C，PIM1 siRNA组；D，18β-GA+PIM1 siRNA组。与NC siRNA组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，n=3。 图 5 敲低PIM1与18β-甘草次酸处理对Hela细胞蛋白表达的影响（x±s） Fig. 5 Effects of the knock down PIM1 and 18β-glycyrrhetinic acid on protein expression of Hela cells(x±s) |
与空载体组相比，空载体+18β-GA组OD490值降低，细胞增殖率抑制率升高，PIM1与BCL-2蛋白表达水平下降，而Beclin-1蛋白表达水平升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）。与空载体组相比，PIM1过表达组OD490值升高，细胞增殖抑制率降低，PIM1与BCL-2蛋白表达水平上升，而Beclin-1蛋白表达降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。与PIM1过表达组相比，18β-GA+PIM1过表达组OD490值降低，细胞增殖率抑制率增高；PIM1与BCL-2蛋白表达明显降低，Beclin-1蛋白表达升高，差异具有统计学意义（P < 0.01）。见表 3与图 6。
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| 注：A，空载体组；B，空载体+18β-GA组；C，PIM1过表达组；D，18β-GA+PIM1过表达组；与空载体组比较，*P < 0.05；与PIM1过表达组比较，##P < 0.01。 图 6 过表达PIM1与18β-甘草次酸处理对Hela细胞蛋白表达的影响（x±s，n=3） Fig. 6 Effects of the overexpression of PIM1 and 18β-glycyrrhetinic acid on protein expression of Hela cells(x±s, n=3) |
与裸鼠对照组比较，18β-GA实验组裸鼠移植瘤体积与质量明显较小，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表 4、图 7。
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| 注：A，裸鼠对照组；B，裸鼠18β-GA实验组。 图 7 18β-甘草次酸对裸鼠移植瘤体积的影响 Fig. 7 Effects of the 18β-glycyrrhetinic acid on the volume of transplanted tumor in nude mice |
HE染色可见，裸鼠对照组肿瘤组织Hela细胞排列紧密，胞核深染，与对照组相比，18β-GA实验组肿瘤细胞体积明显变小，细胞核染色较浅，出现明显的较为密集肿瘤组织与疏松空泡状组织的分界线，肿瘤凋亡核心面积增大，肿瘤细胞密度更低，能观察到实验组组织中Hela细胞被分别包裹为条索状或球囊状进而发生组织疏松空泡化，见图 8。
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| 注：A，裸鼠对照组；B，裸鼠18β-GA实验组。 图 8 18β-甘草次酸对裸鼠移植瘤病理形态的影响（HE，×100） Fig. 8 Effects of the 18β-glycyrrhetinic acid on the pathological morphology of transplanted tumor in nude mice(HE, ×100) |
免疫组织荧光染色可见，与裸鼠对照组相比，18β-GA实验组肿瘤组织PIM1标记的红色荧光强度较低，DAPI染色可见实验组肿瘤组织细胞密度较为疏松，染色质聚集的亮蓝色荧光细胞核比例更高。见图 9。
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| 注：A，裸鼠对照组；B，裸鼠18β-GA实验组。 图 9 18β-甘草次酸对裸鼠移植瘤PIM1表达的影响（免疫荧光，×200） Fig. 9 Effects of the 18β-glycyrrhetinic acid on PIM1 expression in the transplanted tumor of nude mice(IF, ×200) |
与裸鼠对照组比较，18β-GA裸鼠组增殖相关蛋白PCNA与抗凋亡蛋白BCL-2表达明显降低，自噬相关蛋白Beclin-1表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，PIM1、p-STAT3、IL-6蛋白表达降低（P＜0.05或P＜0.01），而STAT3蛋白表达无显著差异（P＞0.05）。见图 10。
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| 注：A，裸鼠对照组；B，裸鼠18β-GA实验组。与裸鼠对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，n=5。 图 10 18β-甘草次酸对裸鼠移植瘤蛋白表达的影响（x±s） Fig. 10 Effects of the 18β-glycyrrhetinic acid on the protein expression of transplanted tumor in nude mice(x±s) |
目前宫颈癌发病率和病死率居生殖道恶性肿瘤的首位，患病人数逐年增加，患者年龄逐渐减小[23]。由于宫颈癌肿瘤细胞增殖快、侵袭性高，晚期宫颈癌患者容易形成局部浸润和远处转移而导致复发率高、预后差[24]，易产生化疗耐药性[25]，因此迫切需要开发新的辅助治疗药物。PIM1属于3种原癌蛋白（PIM1、PIM 2和PIM 3）组成的丝氨酸/苏氨酸激酶的PIM家族，通过激活生长因子和细胞因子信号通路，在细胞周期进程、细胞存活、细胞凋亡、耐药和转录激活等方面具有重要作用，参与癌细胞的增殖、迁移、凋亡与肿瘤生长[8]。PIM1在宫颈癌[9]、乳腺癌[26]、前列腺癌[27]、结直肠癌[28]、肺癌[29]等多类型的肿瘤细胞中过表达，并且其过表达与肿瘤发生和进展相关。研究发现宫颈癌患者中PIM1表达增加可能表明患者肿瘤大小和转移风险增加，PIM1在一系列癌症中的作用使其成为一个有潜力的新药靶点。本研究细胞实验结果显示，与对照组相比，随着18β-GA作用浓度的增加，PIM1蛋白表达降低，细胞增殖抑制率与凋亡明显增加。动物实验免疫荧光与蛋白印迹也显示18β-GA组PIM1表达明显低于对照组，HE染色显示移植瘤凋亡核心扩大，表明18β-GA能抑制PIM1蛋白表达促进Hela细胞与裸鼠移植瘤凋亡。
促炎细胞因子IL-6是由HPV癌蛋白E5、E6和E7通过上调环氧合酶-2与前列腺素E2激活免疫系统与细胞产生，与宫颈癌与HPV病毒感染引发的炎症密切相关[30]。既往研究使用过表达和si RNA敲低后进行细胞功能分析表明，PIM1过表达能诱导STAT3激活，在Tyr705位点磷酸化增加[31]，能促进乳腺癌细胞的恶性表型，敲除PIM1可显著抑制宫颈癌Hela细胞增殖，促进其凋亡，减弱IL-6诱导的乳腺癌细胞上皮间质转化[9, 26]。抗凋亡蛋白BCL-2处于STAT3下游，BCL-2过表达与STAT3的高磷酸化显著相关[32]。敲低PIM1后抗凋亡蛋白BCL-2及其调节的靶标SOCS3的表达随之降低[10]，SOCS3通过阻断STAT3的激活来抑制IL6信号传导[28]，表明PIM1能通过抑制STAT3进而抑制BCL-2与IL-6。本研究动物组织蛋白印迹结果显示18β-GA可抑制PIM1降低STAT3的磷酸化，降低抗凋亡蛋白BCL-2与IL-6表达，与既往研究结果一致。IL-6降低显示18β-GA可能通过下调PIM1抑制STAT3/IL-6信号轴，有助于改善HPV癌蛋白引发的炎症。STAT3可通过结合p21启动子下调p21表达，p21能通过多种机制导致细胞周期阻滞，直接作用于PCNA，抑制DNA合成[33]。本研究动物实验PCNA的降低表明18β-GA可能通过下调PIM1抑制STAT3促进下游p21产生并作用于PCNA，进而抑制Hela细胞周期进程与DNA复制。
Beclin-1是自噬的中枢调控因子，研究发现Beclin-1介导的自噬激活与BCL-2下调相关，BCL-2可通过结合Beclin-1的BH3唯一结构域抑制Beclin-1[34]。本研究细胞与动物实验显示18β-GA处理能抑制BCL-2的表达，而Beclin-1表达增加。18β-GA处理、敲低PIM1与敲低PIM1后加18β-GA处理Beclin-1与BCL-2变化趋势一致，而过表达PIM1后BCL-2表达增加而Beclin-1降低，表明PIM1可能通过减少STAT3的磷酸化抑制BCL-2表达进而上调Beclin-1表达，激活肿瘤细胞发生自噬。敲低PIM1与敲低PIM1后加18β-GA处理细胞增殖抑制率、PIM1、Beclin-1与BCL-2表达水平无明显差异，而过表达PIM1与过表达PIM1后加18β-GA上述结果有显著差异以及分子对接结果说明PIM1是18β-GA作用于Hela细胞的靶点。敲低PIM1作用靶点缺失导致18β-GA对Hela细胞作用效果降低，过表达PIM1作用靶点增多而使18β-GA对Hela细胞作用更明显，表明18β-GA可能对于PIM1表达低的正常宫颈细胞副作用小，更适用于PIM1表达水平高的宫颈癌肿瘤治疗。
综上所述，本研究基于动物实验、分子对接以及细胞实验，免疫荧光与蛋白印迹多角度阐明18β-GA可由PIM1/STAT3/IL-6信号轴诱导裸鼠宫颈癌移植瘤自噬与凋亡，通过PIM1/STAT3信号通路抑制肿瘤细胞增殖促进凋亡与自噬，同时降低IL-6表达起到抗炎作用，具有改善宫颈癌免疫浸润微环境的潜力。本研究结果为深入研究甘草抗宫颈癌提供了实验基础，为宫颈癌治疗药物的研发提供了新的思路。
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