胃溃疡为临床常见的消化系统疾病，以腹痛腹胀、恶心呕吐为主要的临床表现，常见病因有幽门螺杆菌感染、非甾体抗炎药、心理因素及不良生活习惯等，具有反复发作的特点，极大影响了人们的生命健康和生活质量。临床一线使用西药治疗胃溃疡存在用药时间长、药物毒副作用大等问题。而中医药治疗胃溃疡历史由来已久，中医中的“热痞证”与西医中急性胃溃疡的临床症状相似，胃热所导致的胃溃疡出血是急性胃溃疡常见的并发症。医圣张仲景以大黄黄连泻心汤来治疗热在气分、闭塞中焦产生的“火气痞”，并采用了一种特殊的煎煮方法——麻沸汤浸渍法。

煎煮法与浸渍法是两种不同的中药浸提方法，不同的制药方法决定着临床药效的不同。煎煮法下的三黄泻心汤用以治疗血分热盛所致的吐血、衄血，麻沸汤浸渍法下的大黄黄连泻心汤则用以治疗热痞证。随着煎煮法的改变，中药性味随之改变，组成方药的功效及临床疗效亦随之改变。清代徐灵胎《医学源流论》言：“煎药之法，最宜深讲，药之效不效，全在于此。”历代医家均颇为讲究方药的煎煮时间、火候等条件。本课题组前期^[1]以时间、温度为影响因素设置不同的浸提条件，建立了准确、可靠的高效液相色谱方法，对各组大黄黄连泻心汤中的大黄素、小檗碱、黄芩苷等化学成分进行测定，通过对各组成分含量的分析，验证了在不同的浸渍条件下，大黄黄连泻心汤的化学成分也有所不同。因此，明确浸渍的温度和时间，对大黄黄连泻心汤在不同浸渍条件下性味的改变及临床效用具有重要影响。

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体是存在于免疫细胞中的一种蛋白复合体，受到特定刺激会导致强致炎因子白细胞介素1β（IL-1β）和白介素18（IL-18）的成熟及释放，引发炎症反应并导致机体组织及靶器官的损伤。研究发现，NLRP3炎症小体与消化系统疾病有着紧密联系，阻断其半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）蛋白活化可以减轻急性胃溃疡早期的炎症反应^[2-3]。本实验基于此，研究不同浸渍条件下大黄黄连泻心汤通过抑制NLRP3炎症小体活性对急性胃溃疡小鼠的保护作用，探讨其作用机制并筛选其最佳浸渍条件。

1 实验材料 1.1 动物

实验采用健康雄性ICR小鼠78只，约6~8周，体质量20~25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2021-0006。在南京中医药大学实验动物中心饲养，实验遵循《实验动物护理和使用指南》（动物伦理批号202203A049）。SPF级环境，室温20 ℃，相对湿度45%±5%，自然光照12 h，各组实验小鼠以普通饲料喂养，自由进食及饮水，实验开始前适应性饲养3 d。

1.2 药品

大黄、黄连、黄芩等药材购于南京中医药大学国医堂。

1.3 主要实验试剂及试剂盒

胃蛋白酶试剂盒，南京建成生物公司（货号A080-1-1）；MCC950（NLRP3抑制剂），金益柏生物科技有限公司（货号HY12815）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（14C10）Rabbit mAb（HRP Conjugate），美国CST公司（货号3683S）；NLRP3 Antibody，美国Affinity公司（货号DF7438）；Caspase-1Antibody，美国Affinity公司（货号AF5418）；HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG（H+L），美国博士德公司（货号BA1054）；IL-1β、IL-18酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，上海酶联生物公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物公司（货号P0010S）；广谱蛋白Marker（11-245），北京索莱宝公司（货号PR1920-20T）。

1.4 主要仪器及设备

电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司，型号HWS12；超纯水器，美国Millipore公司，型号Milli－Q Gradient A10；通用离心机，康宁上海管理有限公司，型号LSE；全封闭组织脱水机，日本樱花公司，型号Vip6；石蜡切片包埋机，日本樱花公司，型号TEC-5；半自动石蜡切片机，美国Thermo公司，型号HM340E；吸收光酶标仪，美国BioTek公司，型号EL×800；酶标分析仪，美国Rayto公司，型号RT-6100；百万分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO公司，型号XP6；冷冻离心机，德国艾本德公司，型号5424R；电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司，型号DY89—Ⅱ。

2 实验方法 2.1 实验分组

将小鼠用苦味酸标记，随机分为空白组、模型组、MCC950组和药物组，共13组，每组6只。药物组包括煎煮组和浸渍组，浸渍组分别为A组（100 ℃，5 min）、B组（100 ℃，15 min）、C组（100 ℃，48 min）、D组（85 ℃，5 min）、E组（85 ℃，15 min）、F组（85 ℃，48 min）、G组（70 ℃，5 min）、H组（70 ℃，15 min）和I组（70 ℃，48 min）。

2.2 药物制备

按照原方比例，分别取10份药物，大黄10 g，黄连5 g，黄芩5 g。各浸渍组均取用125 mL热水。浸渍A组，温度100 ℃，时间5 min；浸渍B组，温度100 ℃，时间15 min；浸渍C组，温度100 ℃，时间48 min；浸渍D组，温度85 ℃，时间5 min；浸渍E组，温度85 ℃，时间15 min；浸渍F组，温度85 ℃，时间48 min；浸渍G组，温度70 ℃，时间5 min；浸渍H组，温度70 ℃，时间15 min；药物I组，温度70 ℃，时间48 min，制得浸渍液。药物J组即煎煮组，将3味药放入适量水中进行煎煮，共煎煮2次，每次煎煮15 min，将药液混合。纱布过滤，取滤液，4 ℃保存备用。统一生药浓度0.4 g/mL。NLRP3抑制剂，即MCC950，溶解于生理盐水中，制成浓度为0.5 g/L的注射液。

2.3 小鼠给药及处理

造模及给药方法参考文献[3-4]。参考“人和动物间体表面积折算的等效剂量比率”换算方式及课题组前期实验，对药物组小鼠给予不同条件下制得的大黄黄连泻心汤浸渍液灌胃，给药剂量为20 mL/kg，剩余模型组、空白组、阳性药组灌胃等体积生理盐水；对阳性药组小鼠进行腹腔注射MCC950，给药剂量为10 mL/kg，余下各组腹腔注射相同剂量生理盐水。给药持续7 d，末次给药前禁食不禁水24 h。末次给药后1 h，除空白组外，其余组小鼠均一次性灌胃无水乙醇，剂量为10 mL/kg，以诱导急性胃溃疡。造模1 h后，各组小鼠腹腔注射麻醉，麻醉后切开小鼠胸腔，将注射器直接刺入右心室抽取血液存储于离心管，4 ℃冰箱静置1夜，第2天14 000 r/min离心5 min，离心半径8.4 cm，收集血清。打开腹腔，取鼠胃结扎幽口，沿胃大弯处剪一小口，小心挤出胃内容物于离心管中，收集胃液，离心取上清液，测定胃液酸碱度（pH）值，用胃蛋白酶测定试剂盒测定胃蛋白酶活性（PA）。然后沿胃大弯剪开，去除胃内残杂，用生理盐水冲洗胃腔，剖取全胃组织，再用滤纸把胃黏膜表面的液体吸附干净，观察溃疡情况和拍照，取部分胃组织标号放置包埋盒中，存于福尔马林溶液，剩余胃组织放入5 mL冻存管中，置-20 ℃冰箱保存，待测指标。

2.4 指标检测 2.4.1 溃疡指数（UI）

以标尺测定病灶长度和宽度，并计算UI。按Guth标准计算溃疡指数：按出血面积大小给予计分。每3个点状溃疡或出血点计1分。条状出血：以标尺测量溃疡或出血面的最大长径和垂直于最大长径的最大宽径，两者的乘积即为溃疡指数（即：溃疡指数=最大长径×最大宽径）。

2.4.2 PA水平

采用胃蛋白酶测定试剂盒检测PA。取小鼠胃液，按照胃蛋白酶测定试剂盒说明书实验步骤进行测定。

2.4.3 胃液pH值

采用pH试纸测胃液pH值。

2.4.4 苏木精-伊红染色（HE）

将储存于福尔马林溶液中的胃组织进行脱水、包埋、切片。脱蜡：将切片按顺序浸入二甲苯4 min 3次，无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2 min，蒸馏水3 min。染色：将切片依次浸入苏木素溶液4 min，用蒸馏水清洗至切片无颜色（核蓝），盐酸乙醇浸泡20 s，浸水1 min，反蓝20 s，浸水1 min，过80%乙醇2 min，伊红溶液过30 s，先后过两次95%乙醇至切片清洗干净。复水：先后过两次无水乙醇1~2 min，浸入二甲苯3 min。最后用中性树脂封片。显微镜镜检，然后进行图像采集分析。

2.4.5 采用ELISA法测血清中IL-1β、IL-18含量

取小鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书进行实验步骤。

2.4.6 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测胃组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达

按一定比例向液氮研磨后的小鼠胃组织中加入配置好的预冷的裂解液，提取蛋白，将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液按照4∶1体积比在离心管中震荡混合均匀，然后将样品100 ℃高温变性5 min后，于-80 ℃保存待用；BCA法测定蛋白浓度；配置SDS-PAGE胶（10%）及上样、跑胶、转膜、封闭，分别加入内参GAPDH（1∶5 000稀释）以及NLRP3、Caspase-1一抗（均按1∶1 000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜；洗涤干净后，用5%脱脂奶粉配置兔多抗二抗（1∶5 000）孵育、洗膜等处理后，超敏ECL发光液显影，然后将膜置于暗室中曝光。采用凝胶成像系统自带分析软件对所曝光的图片条带进行扫描分析，得出目的条带和内参条带的面积灰度值，使用灰度值软件分析结果。

3 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。各组实验数据用均数±标准差（x±s）表示，采取单因素方差分析，组间采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

4 结果 4.1 大黄黄连泻心汤对急性胃溃疡小鼠胃组织病理形态的影响

通过对各组溃疡灶的一般形态观察发现：与空白组相比，模型组小鼠胃壁溃疡形态明显，损伤面积大，斑点呈黑紫色。与模型组相比，药物各组溃疡点明显减少，多散在分布，多为浅表性点状溃疡，溃疡面积小，有的甚至未见明显溃疡。见图 1。

通过对HE染色切片的观察发现：与空白组相比，模型组小鼠胃黏膜出现明显的病理学改变，胃黏膜严重受损、脱落，浅表黏膜下增宽表明出现水肿，出现炎症细胞浸润，胃腺上皮细胞坏死等现象。与模型组相比，各药物组小鼠胃黏膜形态较模型组均有不同程度的改善，小鼠胃黏膜损伤和出血病变情况有所减轻，胃黏膜较为完整，充血水肿现象较少，与空白组生理结构较为相似。见图 2。

4.2 大黄黄连泻心汤对急性胃溃疡小鼠UI、胃液pH、PA的影响

各组小鼠UI、PA、pH进行组间比较：与空白组相比，模型组小鼠的UI等指标异常，具有显著的统计学差异（P<0.05或P<0.01）。与模型组相比，各药物组的UI、PA有不同程度的下降，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。其中F组UI最低，E组PA最低。药物A、J组与模型组的pH值比较有显著性统计学差异（P<0.05），其余各药物组与模型组相比较无明显统计学意义。见表 1。

4.3 大黄黄连泻心汤对急性胃溃疡小鼠血清中IL-1β、IL-18表达的影响

ELISA测定结果显示，与空白组相比，模型组的促炎细胞因子IL-1β、IL-18含量明显升高，差异具有明显的统计学意义（P<0.01）。与模型组相比，各药物组促炎细胞因子IL-1β、IL-18的表达明显降低，差异具有明显的统计学意义（P<0.01）。见表 2。

4.4 大黄黄连泻心汤对急性胃溃疡小鼠胃组织中NRLP3炎症小体的影响

各药物组小鼠胃组织中NRLP3炎症小体相关蛋白表达：与模型组相比，药物A、C、D、E、F、H、I组Caspase-1蛋白表达显著下调（P<0.01或P<0.05），其中以药物E组最为明显；药物B、G、H组NLRP3蛋白表达无显著性差异（P>0.05），其余药物组NLRP3蛋白表达均有所下调，尤以药物E组下调最为明显。

4.5 对各组大黄黄连泻心汤药效的综合评分

综合评分标准：以各组UI、PA、pH及IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1表达的数据为基础，计算各指标中药物组与模型组的比值，保留小数点后两位。以上各指标与急性胃溃疡炎症反应均呈负相关，绝对值越大，炎症反应越严重，药效越低。故取负值，无统计学意义的数据计作“-1”，进行统计。评分越高，药效越好。结果表明E（85 ℃，15 min）组药效的综合评分最高，即在85 ℃，15 min浸渍条件下的大黄黄连泻心汤对急性胃溃疡小鼠的治疗效果最佳。见表 3。

5 讨论

胃溃疡归为中医“胃痞”范畴，中医药治疗胃溃疡具有疗效好、价格低、安全性高的优势。中医治“痞”，制方的基本构架以“辛”“苦”“甘”3种性味为主^[5]，在此基础上，根据实际病情进行组方、剂量的增减或者煎煮条件的改变，以调整性味的重心变化、适应临床。《伤寒论》原文第154条言：“心下痞，按之濡，其脉关上浮者，大黄黄连泻心汤主之。大黄二两、黄连一两，右二味，以麻沸汤二升渍之，须臾绞去滓，分温再服。”大黄黄连泻心汤药物组成中是否有黄芩，历代医家一直对此有所争议。唐代孙思邈《千金翼方》便已提出“此方必有黄芩”的看法。陈亦人^[6]认为：“诸泻心汤均有苓、连同用，本证热聚于胃，本方中应当有黄芩为是。”现代研究^[7]发现黄芩的存在可以导致方中化学成分的变化进而影响整个复方的疗效，因此大黄黄连泻心汤中黄芩的存在有其必要性。大黄性味苦寒，具有清热泻火，凉血解毒，凉血以止血、活血以生新的功效；黄连最善清心肝、脾胃之火，热去则动血自宁；黄芩味苦，主治诸热，清热燥湿。3味药物同用，可以直折胃火，清解三焦火毒之病。用其治疗热痞，邪热得除，气机流畅，则痞闷自消。考虑到苦寒之药伤及脾胃，张仲景在大黄黄连泻心汤治疗热痞证的过程中，选用轻扬上行的麻沸汤进行浸渍，既得3味药物苦味之功，保留清泄热痞的“苦”味，又在无其药物配伍的情况下，去其寒凉之性，避免败胃伤中^[8]。但现代研究对麻沸汤浸渍的时间与温度知之甚少，因此选择合适的浸渍条件以发挥大黄黄连泻心汤最佳药效，为临床治疗急性胃溃疡提供更优方案，具有重要意义。

本实验以此为出发点进行动物实验，制作无水乙醇灌胃诱导急性胃溃疡发病的小鼠模型，研究不同浸渍条件下大黄黄连泻心汤对急性胃溃疡小鼠的保护作用，并选取最佳浸渍条件。选定最佳药效组，需考察各组大黄黄连泻心汤对急性胃溃疡小鼠UI、PA、pH值等指标的影响。研究显示，与空白组相比，模型组的各项指标显著升高，溃疡表现明显。与模型组相比，各药物组UI均有不同程度的降低。UI越低，溃疡修复效果越好，因而大黄黄连泻心汤在85 ℃条件下浸渍48 min时对溃疡的修复效果最佳。PA是消化性溃疡攻击因子，若PA高于正常值时易诱发溃疡，以此为基准，大黄黄连泻心在85 ℃条件下浸渍15 min效果最好。胃酸分泌过多会损伤胃黏膜，是引发胃溃疡的病因之一。抑制胃酸分泌，也是药效考察的指标之一，pH越接近正常值，效果越好。

急性胃溃疡可由高炎症状态诱发，亦能受其调节。炎症小体NLRP3是研究得最深入的炎症小体，主要包括NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）与Caspase-1 3部分结构。调节NLRP3炎症小体与核因子κB（NF-κB）信号通路密切相关，当病原或损伤相关分子模式的刺激被细胞膜表面的Toll样受体识别，能够激活NF-κB，并促进下游的NLRP3、ASC、pro-caspase-1、pro-IL-1β和pro-IL-18等转录。本课题组前期研究^[9-10]表明大黄黄连泻心汤能够抑制NF-κB信号通路中的炎症因子，下调关键因子NF-κB、核因子κB抑制因子α（IκBα）、IκB激酶β（IKKβ）的表达治疗“热痞证”。活化的NF-κB可以激活NLRP3炎症小体，NLRP3炎症小体激活后，pro-caspase-1会催化水解为Caspase-1，并进一步将pro-IL-1β和pro-IL-18转变为具有生物活性的IL-1β和IL-18，释放后参与后续的炎症级联反应。实验研究表明，与空白组相比，模型组中促炎细胞因子IL-1β、IL-18的表达升高，机体发生了炎症反应；与模型组相比，大黄黄连泻心汤各药物组中IL-1β、IL-18的表达明显降低，可见大黄黄连泻心汤能够有效抑制乙醇诱导的小鼠胃溃疡损伤后血清中促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的产生，减少相关不良反应。其中药物组中F组（85 ℃，48 min）、E组（85 ℃，15 min）效果最佳。研究发现，与模型组相比，各药物组小鼠胃组织中NRLP3炎症小体相关蛋白NLRP3、Caspase-1蛋白表达有所降低，说明大黄黄连泻心汤可以抑制NLRP3炎症小体的活性。将各药物组灰度值/对照模型组蛋白灰度值进行比较，E组（85 ℃，15 min）比值最低，抑制作用最强。

由此得出，大黄黄连泻心汤对无水乙醇灌胃导致的急性胃溃疡模型小鼠具有保护作用，其机制可能与抑制NLRP3炎症小体活性有关。以此各项指标为依据，对各组药效进行综合评分，最终得出结论：在85 ℃，15 min浸渍条件下，大黄黄连泻心汤对急性胃溃疡模型小鼠的保护作用最佳。

本实验仍有不足之处，该方对慢性胃溃疡是否存在同样的保护机制，不同浸渍条件下该方所发挥作用的药物成分是否相同，仍需进一步实验验证。