焦虑症是一组以烦躁、紧张、失眠为症状群的精神疾病。根据世界卫生组织研究调查，截至2019年全球约有3.01亿人患有不同程度的焦虑症，其中包括5 800万儿童和青少年^[1]。中国相关调查显示焦虑症年患病率为0.2%，终身患病率为0.3%，其病因及发病机制尚不明确，西医学研究认为其病因与个体因素、环境因素、遗传因素有关，有研究表明焦虑症患者家族的发病率为普通人的3倍^[2]。该病发病隐匿，难以诊断，患者常因不能早期发现并接受治疗致使病情恶化。伴随着社会与经济的飞速发展、现代饮食结构的改变、学业与工作压力的增加，焦虑症的发病率逐年升高，并且趋向于年轻化，临床中由于患者不能做到早期发现，早期诊断，早期预防，从而导致各种并发症的出现并难于控制^[3]。

焦虑症归属于中医学郁证范畴，其症状与“脏躁”“怔忡”“百合病”“灯笼病”符合。中医认为本病与心、肝、肾密切相关，多由情志不疏导致脏腑气机郁滞而发病。中医对于其治疗包括针灸、推拿、耳穴压豆、穴位贴敷、穴位埋线、口服方药、导引功等方法，与现代药物治疗相比，中医药治疗重视辨证论治、三因制宜，具有不良反应少、起效快、经济方便等特点，且大量临床研究显示中医药治疗能有效改善焦虑症状，提高患者生活质量，起效较快，无明显不良反应，临床案例丰富，疗效显著，且毒副作用小，安全性高^[4]。2020版《中国药典》记载参芪五味子胶囊可治疗失眠多梦、心悸气短等病症^[5]，原料为南五味子、党参、黄芪、炒酸枣仁4味中药。研究发现，参芪五味子胶囊具有抗焦虑作用，临床上联合运用参芪五味子胶囊较单用西药治疗的抗焦虑疗效更为显著。现代药理学研究显示，参芪五味子胶囊具有抗惊厥、安神、镇静，增强心脏功能和免疫功能等作用，可通过神经调节功能，增加下丘脑中5-羟色胺和去甲肾上腺素含量来改善患者的焦虑症状^[6-7]。但目前参芪五味子胶囊治疗焦虑症的研究多以临床观察为主，多停留在体外细胞、动物体内和离体水平，关于药效物质基础、药理作用机制研究较少，临床用药的选择受到限制，其多靶点、多通路及各系统调控的协同作用难以阐释，限制了系统的机制研究。因此，有关参芪五味子胶囊活性成分及相关靶点的作用机制需要进一步深入研究。

本研究基于网络药理学方法，利用相关数据库和软件，探讨参芪五味子胶囊的活性成分、作用靶点、信号通路，并将关键成分与核心靶点进行分子对接验证，旨在阐明参芪五味子胶囊治疗焦虑症的作用机制，为后期深入研究提供理论依据。

1 资料与方法 1.1 活性成分及靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://tcmsp-e.com/），以参芪五味子胶囊中4味中药（党参、黄芪、南五味子、酸枣仁）为检索词，选定口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18，筛选出参芪五味子胶囊的有效成分及其对应靶点信息。同时查阅近3年中药文献，将各中药含量较高、有明确药理作用的成分纳入补充，作为参芪五味子胶囊活性成分及靶点。将成分及靶点信息导入Cytoscape 3.10.1软件，构建“中药-成分-靶点”网络，依据度值获取排名前10位的成分及靶点信息。通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/），检索蛋白靶点ID及基因名，删除重复信息。

1.2 获取疾病相关靶点

以“Anxiety Disorder”为关键词，在TTD数据库（https://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）以及DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）中检索疾病靶点，删除重复基因后，获取药物靶点与疾病靶点交集，从而预测参芪五味子胶囊治疗焦虑症的治疗靶点。

1.3 构建蛋白相互作用（PPI）网络及筛选核心靶点

将交集靶点输入String12.0数据库（https://cn.string-db.org/），设定物种为人，并设置最低置换分数为0.9。为了确保结果准确性，删除孤立蛋白。将获取到的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）关系导入Cytoscape3.10.1软件，并使用CytoNCA插件进行拓扑分析，依据度值进行排列，筛选出核心靶点。使用CytoNCA插件分析蛋白互作网络度值，并选取度值≥20的蛋白为核心靶点。

1.4 基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

将交集靶点列表输入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，选定P < 0.05为筛选条件，以P值进行排序，进行GO及KEGG富集分析。GO分析包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF），选取GO各条目排名前10位以及KEGG前15条通路进行可视化分析，分别输出为柱状图和桑基图。

1.5 构建成分-靶点-通路网络图

选取KEGG中前15条通路，分析通路涉及的靶点及药物成分信息，将数据导入Cytoscape 3.10.1软件中，绘制“药物成分-靶点-通路”网络图。

1.6 分子对接验证

选取“药物成分-靶点-通路”网络中度值排名前6位的核心靶点与参芪五味子胶囊排名前6位的活性成分进行分子对接验证。在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中输入度值排名前6位靶点，下载高解析精度三维蛋白结构（小于2.0?魡）PDB格式并获取核心靶点PDB ID。在TCMSP（https://tcmsp-e.com/）中获取药物活性成分2D结构mol2格式文件。分别将二者导入AutoDockTools 1.5.7软件，加载其3D结构后进行去水、加氢等处理，并转化成pdbqt格式，进行分子对接及计算结合能，将结果输出为可视化热图。结合能为负值表示分子结合过程放能，负值越大放能越多，则分子自发结合力越强。将对接结果导入PyMOL 4.6.0软件可视化分析，获得分子对接模式图。

2 结果 2.1 参芪五味子胶囊活性成分及靶点的筛选

在TCMSP数据库及文献中检索参芪五味子胶囊活性成分，依据OB≥30%，DL≥0.18进行筛选，最终获得活性成分46种，其中南五味子5种，黄芪17种，党参17种，酸枣仁7种，获得相关靶点238个。

2.2 疾病靶点和交集靶点的预测

对GeneCards数据库获取的疾病靶点连续两次取均值筛选，结合TTD、OMIM、DisGeNET数据库，合并、去重后共得到疾病靶点919个。取交集后得到62个靶点，即为参芪五味子胶囊治疗焦虑症的潜在靶点，绘制Venn图，见图 1。

2.3 “药物-成分-靶点”网络的构建

利用Cytoscape 3.10.1软件构建“中药-成分-靶点”网络图，见图 2。计算成分的度值，度值越高则该节点在网络图中作用越大。排名前10位的成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素等，见表 1。

2.4 PPI蛋白互作网络的构建

通过String蛋白质相互作用数据库获取核心蛋白互作关系，导入Cytoscape3.10.1软件中绘制PPI网络图，使用CytoNCA插件筛选度值≥20的靶点选为核心靶点，进一步分析PPI数据，绘制核心靶点互作网络图，见图 3，其中度值排名前6位的靶点为IL6、AKT1、IL1B、TNF、PPARG、ESR1。

2.5 GO、KEGG功能富集分析

GO分析显示，62个交集靶点共包含400个BP，49个CC及73个MF，主要涉及信号转导、基因表达正调控、同种蛋白结合、细胞外配体门控离子通道活性、苯二氮卓类受体活性等，见图 4；KEGG分析显示，主要富集通路涵盖AGE-RAGE信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路等，见图 5。结果提示，上述信号通路可能是参芪五味子胶囊治疗焦虑症的核心通路。

2.6 “成分-通路-靶点”网络的构建

筛选KEGG富集分析中排名前15位的通路及其所包含的成分与靶点，导入Cytoscape 3.10.1软件，构建“成分-通路-靶点”网络，见图 6，度值较高的成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素，主要靶点为IL6、IL1B、TNF，关键通路涉及AGE-RAGE信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路等。本实验结果提示，参芪五味子胶囊活性分子可作用于多个靶点，多条信号通路干预焦虑症治疗。

2.7 分子对接验证分析

采用分子对接技术对度值排名前6位的中药成分及靶点进行验证，核心靶点PDB ID见表 2。分子对接模拟获得36组对接结果并绘制热图，见图 7。如图所示，36组对接结果结合能均小于-20.92 kJ/mol，证明对接良好，选取结合能最小的6组进行可视化分析，见图 8。

3 讨论

本研究结果显示，参芪五味子胶囊中槲皮素、山柰酚、木犀草素等成分与焦虑症疾病靶点结合较为紧密，提示这些活性成分可能在治疗焦虑症过程发挥重要作用。槲皮素、山柰酚、木犀草素均为黄酮类成分，具有抗焦虑、抗抑郁、抗氧化、抗癌、抑菌等药理活性^[8]。槲皮素具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎、抗血小板聚集、抗氧自由基、扩血管等生理作用，研究发现槲皮素可增加脑内谷氨酸、γ-氨基丁酸含量^[9]，有动物实验表明，槲皮素可通过靶向线粒体修饰其形态和功能途径减轻神经元损伤和抑制焦虑症样行为^[10]；山柰酚是从姜科植物山柰中提取的一种化合物，具有清除自由基、保护多种抗氧化酶等药理活性，在体内发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡的生理效应^[11]，可通过调控苯二氮卓受体、介导一氧化氮产生、抑制乙二醛酶-1和谷胱甘肽还原酶-1基因过表达干预焦虑症的形成^[12]；木犀草素广泛存在于各类水果和蔬菜中，其已被证实具有多种药理功能，包括抗氧化和抗恶性细胞增殖作用^[13]，可调控下丘脑-垂体-肾上腺轴、改善去甲肾上腺素失衡、提高5-羟色胺含量发挥抗焦虑症作用^[14]。

蛋白互作网络显示，IL1B、TNF、PPARG、ESR1、AKT1、IL6可能是参芪五味子胶囊治疗焦虑症的核心靶点。IL1B是研究正常人和精神障碍患者大脑功能的候选基因，主要在海马体表达调控神经元增殖、分化、凋亡，涉及包括焦虑症、抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病在内的多种精神疾病^[15]；TNF以自分泌或旁分泌方式激活并诱导小胶质细胞释放谷氨酸，间接发挥兴奋毒性，损伤神经元促成焦虑情绪^[16]；PPARG在杏仁核所属的基底节区进行表达，而杏仁核是大脑中负责形成焦虑和恐惧的主要部分^[17]；ESR1可通过降低下丘脑-垂体-肾上腺的应激反应减少焦虑样行为；AKT1活性改变会增加大脑扣带回、额下回区域的激活从而引发焦虑症^[18]；HDL胆固醇水平增高会介导Th2细胞分泌IL6，IL6可通过血脑屏障、发送促炎信号影响杏仁核活动诱发焦虑症^[19]。

GO功能富集分析显示，参芪五味子胶囊可通过信号转导、苯二氮卓类受体活性参与生物过程；KEGG通路富集分析显示，关键靶点在AGE-RAGE信号通路、神经活性配体-受体相互作用等信号通路表现出明显富集。激活AGE-RAGE信号通路激活小胶质细胞，诱导其释放TNF-α、IL-1β，从而引发炎症反应，引起神经元损伤，TNF-α、IL-1β可上调小胶质细胞或星形胶质细胞表达其他因子，使一氧化氮、补体、前列腺素等合成增加，损伤大脑皮质神经元和海马体的结构功能，造成学习记忆功能减退^[18]，这与焦虑症的形成有关。而通过调节AGE-RAGE轴可以避免进一步激活下游的核转录因子-κB信号通路，抑制机体的炎症反应，可以减少中枢神经的损伤，从而干预焦虑症的发生发展^[20]。动物实验表明，神经活性配体-受体相互作用信号通路共包括211个受体基因，其中Chrm3基因表达水平会影响学习和记忆能力；Drd5基因参与奖赏强化机制、认知情感及运动调节；敲除Htr1b3基因的小鼠冲动和过激行为明显增加^[21]。

分子对接显示槲皮素、山柰酚、木犀草素等成分与IL1B、TNF、PPARG等靶点的结合能均小于-20.92 kJ/mol，结合最紧密的为IL1B与7-甲氧基-2-甲基异黄酮、TNF与7-甲氧基-2-甲基异黄酮、IL1B与槲皮素，证明分子间具有紧密的结合活性。

综上所述，本研究采用网络药理学方法对参芪五味子胶囊的活性成分、相关靶点及信号通路的生物过程进行系统研究，发现参芪五味子胶囊中的槲皮素、山柰酚、木犀草素等成分可作用于IL1B、TNF、PPARG、ESR1、AKT1、IL6等核心靶点，通过AGE-RAGE信号通路、神经活性配体-受体相互作用等信号通路参与炎症与免疫反应、保护神经元，发挥抗焦虑症的药物疗效，体现了中药制剂多成分、多靶点、多通路的特点。本实验为后续临床研究提供了思路和参考，在此基础上需要进一步的细胞和动物实验加以验证。