2024, Vol. 41文章信息
- 殷倩倩, 邓秀平, 钟雨虹, 等.
- YIN Qianqian, DENG Xiuping, ZHONG Yuhong, et al.
- 基于Box-Behnken响应面设计优选中药复方便乃通的提取工艺
- Optimization of the extraction process for Chinese herbal compound Biannaitong based on Box-Behnken response surface design
- 天津中医药, 2024, 41(6): 789-794
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2024, 41(6): 789-794
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2024.06.19
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文章历史
- 收稿日期: 2023-12-12
2. 天津中医药大学现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 301617;
3. 武汉同济现代医药科技股份有限公司，武汉 430056
便乃通茶是一种市售的通便类中药，具有“安全、高效、稳定、可控、绿色”等特点。便乃通茶由黑芝麻、陈皮、番泻叶等药味组成，有润燥通便的功能，适用于老年津亏肠燥所致的便秘。研究表明[1-5]，便乃通茶可改善晚期癌症患者的继发性便秘症状；联合应用欧立康定可预防消化道反应，降低化疗所致便秘、腹胀纳差等不良反应，临床疗效显著。但目前仅存茶剂一种剂型，其使用剂量不易控制，患者的依从性较差。故开发BNT新剂型具有重要意义，本实验基于响应面法优化BNT的现代提取工艺，以期可为BNT剂型改良提供数据支持。
中药复方BNT中的君药为番泻叶，其提取方式为后下[6]、恒温浸泡[7-8]等，其有效成分番泻苷受热易分解[9]，考虑到加热回流提取的可操作性，选择了多次提取的方式，单次提取时间不宜过长。番泻苷为发挥泻下功效的主要成分[10-12]，研究表明番泻苷A通过调节肠道菌群以及水通道蛋白AQP1和AQP3来发挥其通便作用[13]，故选择其作为定量检测指标。陈皮具有理气健脾的功效，对肠平滑肌具有双向调节作用，其主要成分橙皮苷能够增加大鼠肠道中乳酸菌数量，促进胃肠道蠕动[14-16]，故选择橙皮苷作为检测指标。
1 材料 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪，配四元泵DEAE 207941，DAD检测器DEAC 611591，美国安捷伦公司；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，4.6×250 mm，3.5-Micron，P.N. 884950-567，S.N.USAWX 04676，美国安捷伦公司；BGZ-140型鼓风干燥箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；XP-205型十万分之一电子天平，METTLER TOLEDO公司；PX223ZH型千分之一电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；N-400旋转蒸发仪，EYELA；DLSB-5/25型低温冷却液循环泵，天津科诺仪器设备有限公司；FDU-2100型冷冻干燥机，EYELA；Millipore-Q型去离子水机，美国Millipore公司。
1.2 饮片与实验药物陈皮（产地：广西，批号：210801）、番泻叶（产地：广西，批号：220201）采购自安徽家和中药科技股份有限公司。经天津中医药大学祁东利老师鉴定为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco的干燥成熟果皮、豆科植物狭叶番泻叶Cassia angustifolia Vahl的干燥小叶。橙皮苷对照品（批号：110721-202019，纯度：95.30%）、番泻苷A对照品（批号：110824-202003，纯度：97.2%）、番泻苷B对照品（批号：110825-202004，纯度：96.0%）均采购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇、色谱纯，天津市康科德科技有限公司；磷酸（批号：218128，纯度：85%），Fisher公司；去离子水（由Millipore-Q型去离子水机制备）。
2 方法与结果 2.1 3种指标成分的含量测定 2.1.1 混合对照品溶液精密称取番泻苷B、番泻苷A适量，置棕量瓶中，加0.1%NaHCO3溶液制成每1 mL含番泻苷A 0.321 7 mg、番泻苷B 0.559 7 mg的混合对照品母液。
精密称取橙皮苷适量，置棕量瓶中，加甲醇制成每1 mL含橙皮苷0.275 4 mg的对照品母液。
2.1.2 供试品溶液取10倍处方量饮片，加料液比为1∶10的去离子水，浸泡30 min后，加热至沸腾，沸腾后回流提取20 min，提取1次，2层纱布趁热过滤，放冷后记录冷体积、冷质量。提取药液60 ℃减压浓缩密度为1.0 g/cm3左右，冷冻干燥48 h，取出研磨得到BNT干膏粉。
取BNT干膏粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为50%的甲醇溶液20 mL，称定质量，超声处理10 min，放冷，再称定质量，用体积分数为50%的甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.3 色谱条件色谱柱（ZORBAX SB-C18 4.6×250 mm，3.5 micron，P.N.884950-567，S.N.USAWX04676，美国安捷伦公司），流动相为0.05%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，流速为1 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为5 μL，检测波长280 nm（橙皮苷）、340 nm（番泻苷A、B），后运行10 min。梯度为0~15 min，15%B；15~19 min，15%~19.5%；19~22 min，19.5%B；22~30 min，19.5%~25%B；30~35 min，25%B；35~45 min，25%~56%B；45~50 min，56%~15%B。高效液相色谱图见图 1。
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| 注：1，番泻苷B；2，番泻苷A；3，橙皮苷。 图 1 高效液相色谱图 Fig. 1 HPLC Chromatogram |
将番泻苷B对照品母液依次稀释为0.017 5、0.035 0、0.070 0、0.084 0、0.167 9、0.279 8 mg/mL，番泻苷A对照品母液依次稀释为0.010 1、0.020 1、0.040 2、0.048 3、0.096 5、0.160 9 mg/mL，橙皮苷对照品母液依次稀释为0.005 5、0.027 5、0.055 1、0.068 9、0.137 7 mg/mL。按2.1.3项色谱条件进样分析，记录峰面积。以浓度C（mg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标进行回归分析，绘制标准曲线，得橙皮苷、番泻苷A与番泻苷B的回归方程见表 1，结果表明番泻苷B在0.017 5~0.279 8 mg/mL范围内、番泻苷A在0.010 1~0.160 9 mg/mL范围内、橙皮苷在0.005 5~0.275 4 mg/mL范围内线性关系良好。
取稀释后浓度为0.070 0 mg/mL的番泻苷B、0.040 2 mg/mL的番泻苷A、0.055 1 mg/mL的橙皮苷对照品溶液，按2.1.3项色谱条件连续进样6次，测得番泻苷B、番泻苷A、橙皮苷的峰面积相对标准偏差（RSD）分别为0.220%、0.356%、0.099%，表明仪器精密度良好。
2.1.4.3 重复性实验取同1批次BNT提取物，按2.1.2项供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，按2.1.3项色谱条件进样分析，测得番泻苷B、番泻苷A、橙皮苷的含量RSD分别为1.11%、1.26%、1.76%，表明该方法重复性良好。
2.1.4.4 稳定性实验取供试品溶液分别于制备后0、1、2、4、6、8、12、24、48 h按2.1.3项色谱条件进样分析，测得番泻苷B、番泻苷A、橙皮苷的含量RSD分别为1.150%、0.817%、2.080%，说明供试品溶液在常温放置48 h内稳定。
2.1.4.5 加样回收率取已知含量的BNT提取物0.1 g，精密称定，分别精密加入番泻苷B对照品溶液、番泻苷A对照品溶液、橙皮苷对照品溶液适量，按2.1.2项供试品溶液的制备方法平行制6份供试品溶液，按2.1.3项色谱条件进样分析，测得番泻苷B、番泻苷A、橙皮苷的平均回收率分别为104%、103%、98.7%，RSD分别为1.040%、0.923%、0.837%，符合2020版《中华人民共和国药典》9101分析方法验证指导原则项下规定。
2.2 工艺优化实验 2.2.1 单因素实验分别取10倍处方量饮片，考察浸泡时间（0、30、60、90 min）、料液比（1∶8、1∶10、1∶15、1∶20）、回流时间（10、20、30、60 min）、回流次数（1、2、3次），2层纱布趁热过滤，放冷后记录冷体积、冷质量。取20 mL药液测定出膏率，其余药液减压浓缩至密度为1.0 g/cm3左右，冷冻干燥24 h，取出研磨得到提取物，按2.1.2项制备供试品溶液，测定指标成分含量。
对结果直观分析，浸泡时间对4种指标成分含量的影响不大，故响应面实验的因素确定为料液比、回流时间及回流次数。各因素的水平取值为：料液比1∶6、1∶8、1∶10；回流时间30、60、90 min；回流次数1、2、3次。
2.2.2 响应面实验在单因素实验的基础上，利用Design-Expert 13.0软件设计Box-Behnken响应面实验对BNT提取工艺进行优化[17-18]。
2.2.2.1 数据处理分别以提取干膏粉中番泻苷B、番泻苷A与橙皮苷的含量W（每1 g干膏粉含指标成分的含量mg）为响应，利用Design-Expert 13.0软件进行分析。
2.2.2.2 模型建立及方差分析通过Design-Expert 13.0软件对表 2中的实验结果进行回归模型的拟合，得到各响应对考察因素自变量A、B、C的回归方程：W番泻苷B=17.812 61-0.632 063A-0.081 689B-2.100 33C+0.000 861AB+0.002 588AC+0.007 240BC+0.030 197A2+0.000 322B2+0.267 596C2；W番泻苷A=10.112 73-0.302 881A-0.048 799B-1.190 14C+0.001 283AB+0.005 235AC+0.002 372BC+0.010 265A2+0.000 177B2+0.168 205C2；W橙皮苷=-4.762 09+1.265 13A+0.024 855B+1.930 18C+0.000 365AB-0.043 628AC+0.010 251BC-0.072 762A2-0.000 289B2-0.384 858C2。对模型进行方差分析，模型P值均小于0.05，表示模型显著；失拟项P值均大于0.05，不显著，说明该回归方程对实验拟合情况良好，未知因素对实验结果的干扰性较小，可用该模型确定较优提取工艺。
各因素交互作用对响应影响的响应面图，见图 2。响应曲面坡度越大，代表该因素对响应值影响越大[19]。对比响应面坡度可知，各因素对番泻苷B、番泻苷A响应的影响为：B（回流时间）＞C（提取次数）＞A（料液比）；各因素对橙皮苷响应的影响为：C（提取次数）＞B（回流时间）＞A（料液比）。各响应均取最大值进行模型拟合，预测最优提取工艺为料液比1∶7.51，回流时间30 min，提取次数1.60次时，提取物中番泻苷B、番泻苷A与橙皮苷的含量分别为10.5、6.11、3.27 mg/g。
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| 注：SB，番泻苷B；SA，番泻苷A；Hes，橙皮苷。 图 2 各因素交互作用对指标成分影响的响应面图 Fig. 2 Response surface plots of the effects of interaction of various factors on index components |
根据模型预测结果并结合实际操作，取10倍处方量饮片，加料液比为1∶20的去离子水，浸泡20 min后，加热至沸腾，沸腾后回流提取10 min，提取1次，2层纱布趁热过滤。再加料液比为1∶8的去离子水，沸腾后回流提取30 min，提2次，混合提取液（n=3）。放冷后记录冷体积、冷质量。取20 mL药液测定出膏率，取200 mL药液减压浓缩至约50 mL后测定密度，冷冻干燥24 h，取出研磨得到提取物。按2.1.2项制备供试品溶液和2.1.3色谱条件测定指标成分含量，结果见表 3。
SA与SB验证实验含量比预测值降低5.02%、6.05%，与预测值较为接近。其含量降低可能与番泻苷受热易分解，验证工艺与预测工艺相比提取次数增加有关。平行3组实验橙皮苷含量相差较大，可能是由于处方剂量中陈皮的取样量较少，饮片质量不均匀所致，故应在后续实验中进行放大验证。橙皮苷验证实验含量比预测值增加10.5%，与预测值比较相差较大。后将对预测工艺条件增加验证实验次数，观察预测工艺的预测效果。
3 讨论除指标成分的含量外，还应对提取的出膏率进行测定，不同提取工艺对饮片的出膏率具有重要影响[20-21]。本实验工艺验证中3组平行实验的出膏率RSD为1.39%，结合指标成分含量可推断出该工艺较为稳定。
响应面法是一种常用的处方筛选或工艺优化的统计方法，可减少实验次数，并可直观地体现影响因素之间的交互作用[22-27]。除提取工艺的参数外，饮片质量、人为操作等均可能使检测指标的含量差异较大，故工艺优化之前，需对饮片质量进行控制，同时经过重复实验对工艺的稳定性进行验证。本实验利用Box-Behnken响应面法对中药复方便乃通的提取工艺进行了优化，该工艺易操作且稳定，可为后续放大工艺提供参考。
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2. Modern Traditional Chinese Medicine Discovery and Formulation Technology Engineering Research Center of the Ministry of Education, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
3. Wuhan Tongji Modern Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Wuhan 430056, China