慢性萎缩性胃炎（CAG）是指胃黏膜变薄、固有腺体萎缩或消失、肌层增厚、伴有肠上皮化生等病理学改变，临床表现为上腹部疼痛、胃胀、恶心、食欲不振等，具有反复发作、迁延难愈的特点，被认为是胃癌病理发展的关键阶段^[1]。因此，有效抑制或逆转CAG进展对胃癌预防具有重要意义。CAG病理机制复杂，其中炎症反应和细胞凋亡在其发生发展过程中扮演着重要角色^[2-3]。Janus激酶2（JAK2）/信号转导与转录激活子3（STAT3）是炎症反应及细胞凋亡等病理机制中关键的信号传导通路，有文献报道通过抑制JAK2/STAT3通路可有效抑制CAG大鼠炎症反应和细胞凋亡，进而减轻胃黏膜损伤^[4-5]。因此，JAK2/STAT3通路可作为CAG防治药物研究的切入点。

中医药在CAG等慢性胃病防治方面具有独到的理论体系和治疗思路。在中医CAG可归属“胃脘痛”“痞满”“胃痞”等范畴，其病机在于脾虚气滞、痰湿血瘀、浊毒内蕴。中药丹参以唇形科植物丹参干燥根茎入药，味苦性寒，具有活血化瘀、行气止痛、凉血消痈等功效。有文献报道丹参单药或组方对CAG具有一定的临床疗效^[6-7]。丹参酮ⅡA（Tan ⅡA）为中药丹参的主要活性成分之一，化学结构属于共轭醌酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抑凋亡等多种生物学活性^[8]。研究证实，Tan ⅡA可减轻幽门螺杆菌所致胃部炎症和细胞凋亡^[9]；此外，Tan ⅡA对JAK2/STAT3通路及其介导的炎症反应和细胞凋亡具有抑制作用^[10-11]。本实验通过构建CAG大鼠模型，研究Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜的影响，并基于JAK2/STAT3通路探讨其机制。以期为临床治疗CAG提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 实验动物

清洁级健康Wistar大鼠（雄性、7周龄、体质量180~220 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2021-0011。在室温23~25 ℃、相对湿度45%~65%、明暗各12 h循环的安静环境中饲养，饮水进食不限。本实验获得邯郸市中心医院伦理委员会批准[伦理号：HDZXLL（K）2022-017]。

1.2 主要药物、试剂与仪器

Tan ⅡA购自四川维克奇生物科技有限公司（纯度≥98%，货号WKQ-0000161）；JAK2抑制剂AG490、JAK2激动剂Coumermycin A1（C-A1）购自英国Abcam公司（货号ab69072、ab55681）；N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍溶液（MNNG）购自大连美仑生物科技公司（货号MB0455）；雷尼替丁胶囊购自辽宁亿邦制药有限公司（规格0.15 g/粒，批号2204A013）；酶联免疫吸附（ELISA）法胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）试剂盒购自江苏晶美生物科技公司（货号JM-10448R1、JM-01898R2、JM-01587R1、JM-01454R1、JM-01597R2）；苏木精-伊红（HE）、TUNEL染色试剂盒和TRizol法总RNA抽提试剂、增强化学发光液（ECL）购自上海碧云天生物技术公司（货号C0105S、C1098、R0016、P0018S）；一步法逆转录试剂盒、RIPA裂解液、核蛋白提取试剂盒、2喹啉甲酸（BCA）法蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝生物科技公司（货号T2240、R0010、R0050、PC0020）；JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、核因子-κB p65（NF-κB p65）、B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、激活型半胱氨酸蛋白酶3（C-Cas-3）、激活型半胱氨酸蛋白酶9（C-Cas-9）、内参GAPDH、内参H3抗体购自北京博奥森生物技术公司（货号bs-23003R、bs-2485R、bs-55208R、bsm-52210R、bs-20355R、bs-4563R、bs-28034R、bs-0081R、bs-0050R、bs-41373R、bsm-60350R）。RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）；ELx800型多功能酶标仪、MINI-4型电泳仪、Turbo型转膜仪（美国Bio-Rad公司）；9600型PCR仪（美国PE公司）；ST16R型高速低温离心机（美国Thermo公司）。

1.3 方法 1.3.1 动物分组与模型制备

按照随机数字表法，将80只实验用Wistar大鼠随机分为5组（n=16）：正常（Normal）组、模型（Model）组、Tan ⅡA组、Tan ⅡA+AG490组和Tan ⅡA+C-A1组。除Normal组外，其他4组均采用连续20周MNNG（浓度0.04 g/mL）自由饮用联合雷尼替丁0.03 g/kg灌胃（每日1次）、饥饱失常饮食（饱2 d、饥1 d，循环）的综合法制备CAG大鼠模型^[12]。病理学检查胃黏膜呈现腺体数量减少、炎性细胞浸润，则认定CAG模型制备成功^[13]。

1.3.2 给药

造模完成后，Tan ⅡA组通过腹腔注射（ip）给予Tan ⅡA 5 mg/kg（根据人与大鼠剂量换算公式计算所得），Tan ⅡA+AG490组ip给予Tan ⅡA 5 mg/kg和AG490 5 mg/kg^[4]，Tan ⅡA+C-A1组ip给予Tan ⅡA 5 mg/kg和C-A1 50 mg/kg^[14]，Normal组和Model组ip给予等体积生理盐水，各组均每日1次给药，连续12周。

1.3.3 中性红清除法测定胃黏膜血流量

末次给药12 h后，分别随机取各组8只大鼠，采用中性红清除法测定大鼠胃黏膜血流量^[15]。

1.3.4 ELISA法检测血清GAS、血浆MTL、胃黏膜炎症因子水平

末次给药12 h后，分别取各组剩余的8只大鼠，40 mg/kg ip戊巴比妥钠实施麻醉，通过腹主动脉采血，3 000 r/min离心（离心半径10 cm）5 min取血清；通过抗凝采血管采血，3 000 r/min离心（离心半径10 cm）5 min取血浆；颈椎脱臼处死大鼠后，取胃组织并沿胃大弯方向切开，取部分胃黏膜组织，冰上研磨匀浆后3 500 r/min离心（离心半径10 cm）10 min后取上清液。然后按照ELISA试剂盒操作说明，通过酶标仪检测血清GAS、血浆MTL及胃黏膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.5 胃黏膜病理学变化和细胞凋亡观察

取部分胃黏膜组织置于4%多聚甲醛溶液固定5 d，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后4 μm厚度连续切片、梯度乙醇脱蜡处理后，取部分切片行HE染色，光学显微镜下观察胃黏膜病理学改变，参照文献[16]报道行黏膜萎缩病变评分：未见病变计0分、轻度病变计1分、中度病变计2分、重度病变计3分。另外取部分切片行TUNEL染色，光学显微镜下观察胃黏膜细胞凋亡状况（胞核黄褐色为阳性着色），分别取5个不重叠视野计数细胞总数和凋亡细胞数，凋亡指数=（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。

1.3.6 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测胃黏膜JAK2/STAT3通路相关mRNA表达

取部分胃黏膜组织，TRizol法提取总RNA，按照试剂盒说明，将RNA逆转录成cNDA后行PCR扩增，条件设置为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火40 s，共40个循环。PCR引物由上海生工生物公司设计与合成，序列见表 1。

1.3.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测胃黏膜JAK2/STAT3通路相关蛋白表达

取部分胃黏膜组织，RIPA法提取总蛋白，通过核蛋白提取试剂盒提取核蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每孔40 μg蛋白量上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，TBST溶液洗膜5 min×3次后加一抗JAK2（1∶1 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶800）、Bcl-2（1∶800）、Bax（1∶800）、C-Cas-3（1∶800）、C-Cas-9（1∶800）、GAPDH（1∶2 000）稀释液4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜5 min×3次后加二抗IgG（1∶2 000）稀释液室温孵育1 h，TBST溶液洗膜5 min×3次后ECL显色，通过Image J软件分析蛋白条带灰度值，目标蛋白表达量以其与内参GAPDH条带灰度值的比值表示。

1.4 统计学方法

实验数据运用SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量资料符合正态分布以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜血流量的影响

与Normal组相比，Model组胃黏膜血流量明显降低（P＜0.05）。与Model组相比，Tan ⅡA组、Tan ⅡA+AG490组和Tan ⅡA+C-A1组胃黏膜血流量明显升高（P＜0.05）。与Tan ⅡA组相比，Tan ⅡA+AG490组胃黏膜血流量明显升高，Tan ⅡA+C-A1组胃黏膜血流量明显降低（P＜0.05）。见图 1。

2.2 Tan ⅡA对CAG大鼠血清GAS、血浆MTL水平的影响

与Normal组相比，Model组血清GAS、血浆MTL水平明显降低（P＜0.05）。与Model组相比，Tan ⅡA组、Tan ⅡA+AG490组和Tan ⅡA+C-A1组血清GAS、血浆MTL水平明显升高（P＜0.05）。与Tan ⅡA组相比，Tan ⅡA+AG490组血清GAS、血浆MTL水平明显升高，Tan ⅡA+C-A1组血清GAS、血浆MTL水平明显降低（P＜0.05）。见图 2。

2.3 Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

与Normal组相比，Model组胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高（P＜0.05）。与Model组相比，Tan ⅡA组、Tan ⅡA+AG490组和Tan ⅡA+C-A1组胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低（P＜0.05）。与Tan ⅡA组相比，Tan ⅡA+AG490组胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低，Tan ⅡA+C-A1组胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高（P＜0.05）。见图 3。

2.4 Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜病理学改变及细胞凋亡的影响

HE染色结果显示：Normal组大鼠胃黏膜形态结构未见异常，腺体丰富、排列有序；与Normal组相比，Model组胃黏膜厚度降低，腺体萎缩、数量减少、排列无序，固有层可见炎性细胞浸润，上皮细胞增生并伴有杯状细胞、潘氏细胞出现，部分肠上皮化生等病理学改变；与Model组相比，Tan ⅡA组、Tan ⅡA+AG490组和Tan ⅡA+C-A1组胃黏膜病理学改变状况呈不同程度改善，其中Tan ⅡA+AG490组效果优于Tan ⅡA组，Tan ⅡA组效果优于Tan ⅡA+C-A1组。TUNEL染色结果显示：与Normal组相比，Model组胃黏膜细胞凋亡指数明显升高（P＜0.05）；与Model组相比，Tan ⅡA组、Tan ⅡA+AG490组和Tan ⅡA+C-A1组凋亡指数明显降低（P＜0.05）；与Tan ⅡA组相比，Tan ⅡA+AG490组凋亡指数明显降低，Tan ⅡA+C-A1组凋亡指数明显升高（P＜0.05）。见图 4、图 5。

2.5 Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜JAK2/STAT3通路相关mRNA表达的影响

与Normal组相比，Model组胃黏膜JAK2、STAT3 mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05）。与Model组相比，Tan ⅡA组、Tan ⅡA+AG490组和Tan ⅡA+C-A1组胃黏膜JAK2 mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05）；Tan ⅡA组、Tan ⅡA+AG490组胃黏膜STAT3 mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05）。与Tan ⅡA组相比，Tan ⅡA+AG490组胃黏膜JAK2、STAT3 mRNA相对表达量明显降低，Tan ⅡA+C-A1组胃黏膜JAK2、STAT3 mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05）。见图 6。

2.6 Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜组织JAK2/STAT3通路相关蛋白表达的影响

与Normal组相比，Model组胃黏膜Bcl-2蛋白相对表达量明显降低，p-JAK2、p-STAT3、胞核NF-κB p65、Bax、C-Cas-3、C-Cas-9蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65表达比值明显升高（P＜0.05）。与Normal组相比，Model组胃黏膜Bcl-2蛋白相对表达量明显升高，p-JAK2、p-STAT3、胞核NF-κB p65、Bax、C-Cas-3、C-Cas-9蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65表达比值明显降低（P＜0.05）。与Tan ⅡA组相比，Tan ⅡA+AG490组胃黏膜Bcl-2蛋白相对表达量明显升高，p-JAK2、p-STAT3、胞核NF-κB p65、Bax、C-Cas-3、C-Cas-9蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65表达比值明显降低（P＜0.05）；Tan ⅡA+C-A1组胃黏膜Bcl-2蛋白相对表达量明显降低，p-JAK2、p-STAT3、胞核NF-κB p65、Bax、C-Cas-3、C-Cas-9蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65表达比值明显升高（P＜0.05）。见图 7、图 8、图 9。

3 讨论

CAG动物模型的制备方法主要有化学制剂诱导法、幽门螺杆菌感染法、手术法、综合法等，其中综合造模法具有造模时间短、模型稳定性好、病理特点与人类近似等优点，是目前最常用的造模方法。MNNG为公认的CAG化学诱导制剂，易渗透至胃底黏膜，可诱导DNA部分碱基烷化而发挥致癌作用^[17]。本研究采用MNNG+雷尼替丁+饥饱失常饮食的综合法制备CAG大鼠模型，结果显示，CAG模型大鼠胃黏膜血流量和血清GAS、血浆MTL水平均明显降低；胃黏膜呈现厚度降低，腺体萎缩、数量减少、排列无序，固有层炎性细胞浸润，上皮细胞增生，部分肠上皮化生等病理学改变，与李学永等^[18]报道一致。Tan ⅡA为中药丹参的主要活性成分之一，本研究发现Tan ⅡA能够明显提高CAG大鼠胃黏膜血流量和血清GAS、血浆MTL水平，明显改善胃黏膜病理学改变、降低萎缩评分。说明Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜结构和功能损伤具有保护作用。

炎症和细胞凋亡在CAG病理机制中扮演着重要角色。戴秋红等^[19]报道CAG患者血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显高于正常者。TNF-α可诱导巨噬细胞等活化并大量释放TNF-α、IL-6等促炎因子而加重炎症反应，胡掌朝等^[20]研究发现CAG病情严重程度与血清TNF-α水平呈正相关。IL-6和IL-1β则能够刺激内皮细胞分泌血管细胞黏附分子、细胞间黏附分子等黏附因子而促进炎性浸润，进而扩大炎症损伤^[21]。线粒体通路是细胞凋亡的经典通路，Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax等）和半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族蛋白在细胞线粒体凋亡通路中发挥着关键调控作用。定位于线粒体外膜的Bax可促进线粒体外膜小孔形成并刺激线粒体通透性转换孔异常开放，一是使Ca²⁺由线粒体释放进入细胞质，导致胞质Ca²⁺超载而引发细胞凋亡^[22]；二是使细胞色素C（Cyt C）释放进入细胞质，Cyt C可诱导活化Cas-9，C-Cas-9则剪切活化Caspase-3，C-Cas-3可剪切破坏DNA结构，通过损伤DNA修复酶而抑制DNA修复，进而引发细胞凋亡^[23]。Bcl-2能够与Bax聚合而抑制其生理活性，表现出抑凋亡活性。本研究发现，Tan ⅡA能够明显降低CAG大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6水平，改善胃黏膜细胞凋亡状况，提高胃黏膜Bcl-2表达量并降低Bax、C-Cas-3、C-Cas-9表达量，说明Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜炎症损伤和细胞凋亡具有抑制作用，其对细胞凋亡的抑制作用可能与线粒体凋亡通路有关。

JAK2/STAT3是调控炎症反应和细胞凋亡的关键信号通路，可被IL-6等因子诱导磷酸化而活化^[24]。NF-κB是一种与炎症反应密切相关的核转录因子，核转位后其p65亚基可促进多种炎症因子转录表达，TNF-α、IL-1β等均为NF-κB p65靶基因，而p-STAT3对NF-κB表达与核转位具有促进作用^[25]。此外，p-STAT3可通过下调Bax表达并上调Bcl-2表达而促进细胞凋亡^[26]。本研究发现，Tan ⅡA能够明显降低CAG大鼠胃黏膜JAK2、STAT3 mRNA表达量，降低p-JAK2、p-STAT3、胞核NF-κB p65蛋白表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65比值，说明Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜炎症和细胞凋亡的作用可能与抑制JAK2/STAT3通路活化及NF-κB核转位有关。为了验证上述推论，本实验设置了Tan ⅡA+ JAK2抑制剂AG490组和Tan ⅡA+JAK2激动剂C-A1组，结果显示，AG490能够明显增强Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜血流量、胃功能、炎症反应、胃黏膜病理学改变、细胞凋亡、JAK2/STAT3通路相关mRNA和蛋白表达的调控作用，C-A1则能够明显逆转Tan ⅡA对CAG大鼠上述各检测指标的调控作用，从而进一步证实了Tan ⅡA对CAG大鼠胃黏膜的影响与抑制JAK2/STAT3通路活化及NF-κB核转位有关。

综上所述，Tan ⅡA可能通过抑制JAK2/STAT3通路活化及NF-κB核转位，减轻炎症反应和细胞凋亡，从而减轻CAG大鼠胃黏膜结构和功能损伤。本研究结果为Tan ⅡA用于CAG治疗提供了理论依据，但本研究中所用实验动物均为雄性，以排除雌激素和孕激素对结果的影响，未能阐明本实验结果是否适用于雌性动物，课题组下一步拟对本研究中的不足之处进行进一步深入探讨。