慢传输性便秘（STC）是由结肠传输功能下降造成肠内容物停留时间延长的消化系统功能障碍疾病^[1]，临床表现主要有排便困难、排便次数减少、腹胀、无便意等^[2]。近年来由于饮食结构的调整和生活节奏的加快，STC的发病率呈逐年上升趋势^[3]。长期便秘不仅会导致肛裂、内痔、肠梗阻等肛门直肠疾病发生，还可能加重心脑血管疾病猝发的风险，严重影响患者生活质量^[4]。目前临床药物治疗STC主要采用泻药、促肠动力药、促分泌类药及微生态制剂，但不良反应明显，且容易形成药物依赖性^[5]。其发病机制复杂，现代研究多认为是由结肠推动力不足、肠神经递质紊乱、Cajal间质细胞（ICCs）减少、水通道蛋白（AQPs）异常、肠道微生态改变、精神心理因素等引起的^[6]。研究发现，Cajal间质细胞在胃肠道动力障碍性疾病中具有重要作用。研究表明增强磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号转导可以减少ICCs的凋亡从而改善慢传输型便秘^[7]。

STC属于中医“便秘”的范畴，其发病在肠，与肾、脾胃相关^[8]。中医认为，STC的发病机制与大肠主津理论有着密切联系^[9]。“大肠阴津不足、肠道失润、燥屎内结”是临床中便秘常见的病因病机，患者多表现为阴虚肠燥证^[10]。近年研究发现，中医药治疗STC具有不良反应少、耐药性低以及远期疗效显著等，其独特优势日渐凸显^[11]。中医学家朱秉宜教授根据“津不足，津不布”病机理论所创的“养阴润肠方”临床治疗便秘效果显著^[12]。此外，Jiang等^[13]发现养阴润肠方能够改善功能性便秘小鼠的胃肠蠕动功能。不少研究发现，中医药可以通过血清干细胞因子（SCF）/c-kit通路调控Cajal间质细胞治疗慢传输型便秘^[14]。本研究针对便秘的病因病机，探索以滋阴润肠方为代表的滋阴润肠法调节肠道动力治疗慢传输型便秘的作用机制。方中番泻叶、决明子清肠通便，土茯苓清热利湿，淮山药温润调和，北沙参润补濡养，一通一养，润肠通便，但其对STC的治疗效果及潜在机制仍未报道，因此，本研究通过盐酸洛哌丁胺灌胃法建立小鼠慢传输型便秘模型，基于PI3K/Akt通路探讨滋阴润肠法调控Cajal间质细胞对慢传输型便秘的治疗效果及作用机制，为中医药治疗慢传输型便秘提供潜在策略。

1 实验材料 1.1 实验动物

SPF级ICR雄性小鼠，体质量（22±2）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号为SCXK（京）2016-0006]。小鼠普通饲料饲养，自由饮水，室温（22±2）℃，相对湿度60%~70%。动物实验由天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（TCM-LAEC2021248）。

1.2 实验药物

滋阴润肠方由绿茶（Thea viridis）、土茯苓（Smilacis Glabrae Rhizoma）、北沙参（Glehniae Radix）、淮山药（Dioscoreae Rhizoma）、番泻叶（Sennae Folium）、决明子（Cassia tora linn）等组成，由北京澳特舒尔保健品开发有限公司提供，由天津中医药大学中药资源与鉴定教研室李先宽副教授鉴定；盐酸洛哌丁胺胶囊（西安杨森制药有限公司，LLJ0727）、枸橼酸莫沙比利片（江苏豪森药业股份有限公司，产品批号124220306）。

1.3 实验试剂与仪器 1.3.1 实验试剂

RNA提取试剂盒（普洛麦格生物技术有限公司，LS1040）；RNA反转录试剂盒（With gRNase，SYBR）、RNA扩增试剂盒（SYBR Green，FP217）均购自北京天根生化科技有限公司；5-羟色胺（5-HT）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉基因美科技有限公司，CSB-E08365m）；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）抗体（CST公司，Y607）、PI3K抗体（CST公司，4292）、GAPDH抗体（CST公司，D16H11）、c-细胞因子受体（c-kit）抗体（Abcam公司，ab283666）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗体（CST公司，9271S）、Akt（CST公司，9272S）；特超敏ECL化学发光即用型底物（武汉博士德生物工程有限公司，AR1196-200）；0.22 μm/0.45 μm PVDF膜（北京索莱宝科技有限公司，BSP0161）。

1.3.2 实验仪器

实时定量PCR仪（Bio-Rad CFX96 Touch，美国）；多功能酶标仪（Infinite M200 PRO，瑞士）；核酸分析仪（NANODROP ONE，Thermo）；小型垂直板电泳槽（Bio-Rad，美国）；小型转印槽（Bio-Rad，美国）；基础电泳仪电源（Bio-Rad，美国）。

2 实验方法 2.1 滋阴润肠方的提取与浓缩

称取绿茶、土茯苓、沙参、淮山药、番泻叶、决明子共50 g，加入10倍量90 ℃热水，浸泡30 min，用8层纱布过滤收集滤液。取滤渣，再加入10倍量90 ℃热水，浸泡30 min，用8层纱布过滤收集滤液，合并两次滤液，浓缩至192.3 mL，得到0.26 g生药/mL药液，用时用蒸馏水稀释。

2.2 分组、造模与给药

实验前将适应性饲养的50只雄性ICR小鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组、滋阴润肠方低剂量组、滋阴润肠方高剂量组和阳性药组，每组10只。每天上午除正常组外各组小鼠灌胃给予5 mg/kg（相当于临床等效剂量的4倍）盐酸洛哌丁胺建立慢传输型便秘模型，正常组给予等量的生理盐水，每天下午各组分别灌胃给予相应药物治疗，滋阴润肠方低剂量组和滋阴润肠方高剂量组分别灌胃给予1.3 g/kg（相当于临床等效剂量的2倍）和2.6 g/kg（相当于临床等效剂量的4倍）的滋阴润肠方提取物，阳性药组给予3 mg/kg（相当于临床等效剂量的4倍）的莫沙比利混悬液，给药体积为0.1 mL/10 g。正常组和模型组给予等量的生理盐水。每日1次，连续给药14 d。给药期间予小鼠正常进食饮水。

2.3 检测指标与方法 2.3.1 粪便含水量测定

于给药第13天检测小鼠粪便含水量，当天给药30 min后，将每只小鼠单独饲养于鼠笼中，上午9—11时收集各组小鼠粪便，用万分之一分析天平称量小鼠粪便湿质量，电热恒温干燥箱90 ℃烘烤3 h后称量粪便干质量，排除尿液对大便质量的影响，计算其粪便含水量。

粪便含水量（%）=（粪便湿质量－粪便干质量）÷粪便湿质量×100%

2.3.2 首次排黑便时间

于给药第14天检测小鼠首次排黑便时间，检测前1 d禁食不禁水12 h，当天给药30 min后，灌胃给予黑色固体糊（0.3 mL/只），立即单鼠单笼饲养所有小鼠，并开始计时，每隔10 min监测粪便中是否出现第1个黑色粪便，最终得到每只小鼠的首次排黑便时间。

2.3.3 肠道传输率检测

末次给药后第2天检测小鼠肠道传输率，实验前1 d小鼠禁食不禁水12 h，实验当天灌胃给予黑色固体糊（0.3 mL/只）。15 min后用异氟烷麻醉小鼠，剪开腹腔取出小肠（幽门至回盲部），用尺子量取小肠的全长和及幽门至黑色固体糊运动前端的长度（即黑色固体糊推进长度），计算小肠推进率。

计算方法：小肠推进率（%）=（黑色固体糊推进长度/小肠全长）×100%。

2.3.4 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测小鼠结肠组织中5-HT含量

末次给药后第2天，取小鼠结肠组织50 mg，剪成细碎小块并加入磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）溶液，置于组织匀浆机中70 Hz震荡研磨60 s后得组织匀浆，于12 000 r/min，4 ℃下离心10 min后取上清液，离心半径为8.6 cm（下同）。严格按照ELISA试剂盒说明书操作方法检测各组小鼠结肠组织上清液中5-HT含量。

2.3.5 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测结肠组织中c-kit、SCF mRNA表达水平

末次给药后第2天，小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，取下自回盲部至直肠末端的全部肠管，剪取3~4 cm的结肠组织，在生理盐水（4 ℃）中清洗，除去内容物。将结肠组织分为2段，利用组织研磨器首先将结肠组织破碎，然后严格按照RNA提取试剂盒说明书的具体操作，提取结肠的总RNA，测定RNA样本纯度，按试剂盒要求将RNA反转录为cDNA后，用荧光定量PCR进行PCR扩增，最后严格按照反转录与扩增试剂盒说明书的具体操作，使用实时定量PCR仪进行测定结肠组织中c-kit、SCF mRNA表达水平，引物见表 1。

2.3.6 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织中c-kit、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达

取小鼠结肠组织50 mg，加入500 μL RIPA组织/细胞裂解液后，置于组织匀浆机中70 Hz下震荡研磨60 s得组织匀浆，在冰上放置30 min后，于12 000 r/min，4 ℃下离心10 min后取上清，BCA法测定样品蛋白浓度，制备蛋白样品。SDS-PAGE凝胶电泳分离后将凝胶转移至PVDF膜上，快速封闭液封闭20 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，PBST洗膜3次，每次15 min。加入ECL化学发光显影后，并用Image J软件进行结果分析。

2.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 23.0统计软件，使用单因素方差分析进行统计，以均数±标准差（x±s）表示，使用Graphpad Prism 6.0软件作图，P < 0.05为差异具统计学意义。

3 结果 3.1 滋阴润肠方对慢传输型便秘小鼠粪便含水量、首次排黑便及肠道传输率的影响

与正常组比较，模型组小鼠粪便含水量显著下降（P < 0.05），首次排黑便时间显著延长（P < 0.01），肠道传输率显著下降（P < 0.01），说明STC模型造模成功且较为稳定；给药后，与模型组比较，滋阴润肠方高剂量组小鼠粪便含水量显著升高（P < 0.01），滋阴润肠方低剂量组粪便含水量有升高的趋势，差异无统计学意义；阳性药组粪便含水量无明显变化，差异无统计学意义。滋阴润肠方高剂量组及阳性药组小鼠首次排黑便时间均显著缩短（P < 0.01）；滋阴润肠方低剂量组小鼠的首次排黑便时间有缩短的趋势，差异无统计学意义。滋阴润肠方低剂量组、高剂量组小鼠以及阳性药组肠道传输率均显著加快（P < 0.05或P < 0.01）。表明高剂量滋阴润肠方具有增加STC小鼠粪便含水量，缩短STC小鼠首次排黑便时间，提高STC小鼠肠道传输率的作用。见图 1。

3.2 滋阴润肠方对慢传输型便秘小鼠结肠组织中5-HT的影响

5-HT是机体重要神经递质之一，与人体胃肠道动力的调节有密切联系。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中的5-HT含量明显降低（P < 0.05）；与模型组比较，滋阴润肠方高剂量组和阳性药组小鼠结肠组织中5-HT含量明显增加（P < 0.05），提示滋阴润肠方可以增加STC小鼠结肠组织中的5-HT的含量。见图 2。

3.3 滋阴润肠方对慢传输型便秘小鼠结肠组织ICCs的影响

Cajal间质细胞是胃肠慢波活动的起搏器和传导者，ICC异常是STC重要的发病机制，ICC的量通过将c-kit与其配体SCF结合来确定。RT-PCR结果显示，与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中的c-kit、SCF mRNA表达含量均显著降低（P < 0.01）；与模型组比较，滋阴润肠方高剂量组c-kit、SCF mRNA的表达均明显升高（P < 0.05），阳性药组表达有升高的趋势，但差异无统计学意义。Western blot结果显示，与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中c-it蛋白表达含量显著降低（P < 0.01）；与模型组比较，阳性药组与滋阴润肠方高剂量组c-kit蛋白表达含量均显著上升（P < 0.01），提示高剂量滋阴润肠方能够增加STC小鼠结肠组织ICCs数量。见图 3。

3.4 对慢传输型便秘小鼠结肠中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响

PI3K/AKT是c-kit/SCF途径下游信号转导通路之一，被不同的理化因子刺激，可以激活不同的信号传导通路，从而参与细胞凋亡、迁移、血管发生等多种生物学过程。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中的p-PI3K/PI3K蛋白表达含量显著下降（P < 0.01）；与模型组比较，滋阴润肠方高剂量组和阳性药组表达情况均明显上升（P < 0.05）。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中的p-Akt/Akt蛋白表达含量明显下降（P < 0.05）；与模型组比较，滋阴润肠方高剂量组和阳性药组表达情况均显著上升（P < 0.01）。表明高剂量滋阴润肠方可以上调STC小鼠结肠组织中p-PI3K和p-Akt蛋白的表达。见图 4。

4 讨论

慢传输型便秘是一种由于大肠功能紊乱，传导失常而导致的排便周期延长和排便困难的复杂疾病^[15]，其发病机制至今尚未阐明。近年来，STC患病率不断增加，不仅严重影响生活质量，而且还给患者带来一定的经济负担^[16]。目前临床上虽有多种治疗药物和治疗方式，但仍存在疗效不佳和不良反应等问题^[17]。因此，亟待寻找更安全有效的治疗方法。目前中医药已被广泛用于预防和治疗各种疾病，大量药理学和临床研究已经证实了中药治疗STC具有独特优势^[18]。现代研究发现中药可以通过调节肠神经系统结构及肠神经递质水平、调节ICC表达、恢复平滑肌电活动节律性、调节水通道蛋白表达、调节肠道菌群平衡等作用机制治疗STC，且具有多靶点、多通路、多机制的特点^[19]。

STC发病机制较为复杂，主要涉及ICCs、肠神经系统、肠道平滑肌、水通道蛋白、肠道菌群等多个方面。近年来关于ICCs在慢传输型便秘的发生机制中的研究逐年增加，ICCs被认为是胃肠运动的起搏器细胞，它不仅可以控制胃肠自主节律性运动，而且在胃肠道慢波电位的产生和传播以及介导神经信号传递中发挥重要作用^[20-21]。ICCs表面可以表达多种神经递质受体，其中包括兴奋性受体与抑制性受体。5-HT作为一种兴奋性的神经递质，可以直接兴奋肠道平滑肌，促进肠管蠕动，诱发胃肠道感知、运动及分泌的改变^[22]。阳性药枸橼酸莫沙比利是高选择性5-羟色胺4受体（5-HT4）激动剂，通过选择性地增加肌间神经丛释放乙酰胆碱，刺激胃肠道而发挥促动力作用，同时增加肛门括约肌的正性促动力和促肛管自发性松弛的时间，从而改善功能性消化不良患者的胃肠道症状，但不影响胃酸分泌，对慢性功能性便秘具有一定的疗效^[23]。此外研究还发现，番泻叶中有效成分番泻苷A和番泻苷B对胃肠蠕动均有较为明显的作用，番泻苷A可以通过激活ICC细胞膜上HCN1通道蛋白，提高肠道机械感觉敏感度以及调节肠内不同性质的神经递质释放，从而调控胃肠蠕动。本实验中，通过对STC小鼠胃肠道的研究，发现滋阴润肠方高剂量组效果显著，因此后面对滋阴润肠方高剂量组进行进一步的机制研究。给予高剂量滋阴润肠方可以显著缩短STC小鼠首次排黑便时间，提高粪便含水量以及肠道传输率，增加小鼠结肠组织中5-HT含量，加快肠道传输。

ICCs是广泛分布于胃肠道肌层的一种间质细胞，可以被细胞因子受体c-kit特异性标记^[24]。c-kit又称CD117和KIT，主要表达在造血干细胞表面及其他类型的细胞上，是原癌基因c-kit编码的人类同源物^[25]。SCF是由平滑肌细胞和神经元产生的一种干细胞因子（stem cellfactor），又称肥大细胞生长因子（MGF），位于小鼠MGF基因第10号染色体SL基因，有可溶性蛋白和跨膜蛋白两种形式存在，属免疫球蛋白超家族成员，含有酪氨酸激酶和自身磷酸化的结构域，是c-kit的天然配体^[17]。研究发现，c-kit与SCF特异性结合后会引起细胞间信号的级联反应，进而调控SCF/c-kit信号通路及其多条下游信号通路，将细胞内多种转录因子活化，从而调节细胞增殖、分化和生长，阻断SCF/c-Kit信号通路可间接引起功能性便秘^[26]。近年来，已有研究证实结肠组织中c-kit蛋白的异常表达会破坏胃肠道慢波的产生和电流转导，从而影响肠平滑肌蠕动并导致慢传输型便秘的发生^[27]。研究发现，肉苁蓉水提物可以通过涉及PI3K、SCF和c-kit的信号通路明显改善ICC的功能，并加快结肠运动^[28]。此外，王星月等^[29]还发现山药芝麻糊可以显著提高结肠推进率，促进ICC表达从而改善慢传输型便秘。本实验中，给予高剂量滋阴润肠方后，小鼠结肠组织中SCF、c-kit mRNA及c-kit蛋白表达含量均明显升高，表明高剂量滋阴润肠方可以增加小鼠结肠组织中ICC细胞数量。

近年来研究发现，PI3K/Akt信号通路在抑制细胞凋亡、促进细胞增殖等方面具有重要作用^[30]，而且还可以参与细胞的生长、分化、运动、存活和代谢等相关的信号转导。PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，是生长因子超家族转导过程中的重要分子^[31]，蛋白激酶Akt是位于PI3K下游的调节分子。研究发现，紫檀芪可以通过PI3K/AKT/Nrf2信号通路抑制氧化应激诱导的ICCs凋亡，从而改善LOP诱导的肠动力障碍^[7]。李健等^[32]还发现通过PI3K→Akt→mTOR→P70S6K→Cyclin D3→Rbp42/p94可以调节ICCs细胞的数量。此外，PI3K/Akt通路可以参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，对于钙离子的活化、释放从而产生慢波电位至关重要^[33]。本实验中，给予高剂量滋阴润肠方后，小鼠结肠组织中p-PI3K、p-Akt表达含量均显著升高。表明高剂量滋阴润肠方均能上调p-PI3K、p-Akt的表达增加ICC细胞数量，其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路抑制细胞凋亡有关。

综上所述，高剂量滋阴润肠方能够显著缩短首次排黑便时间，提高粪便含水量以及肠道传输率，增加小鼠结肠组织中5-HT含量，上调结肠中p-PI3K、p-Akt的表达，增加ICC细胞数量，从而起到良好治疗效果，提示滋阴润肠法治疗慢传输型便秘疗效确切，为进一步治疗慢传输型便秘提供了新的方向和理论基础。