糖尿病肾病（DKD）常见且难治，以肾小球肥大、肾纤维化为主要临床表现。调查显示^[1]，中国成人中糖尿病的患病率约为10.9%，预计最终有30%~50%的患者并发DKD，给居民的身心健康造成了极大的危害，对社会发展也产生了沉重的经济负担。目前临床上针对DKD患者常采用降糖、保肾等药物治疗，但成效不甚理想，仍有约10%的糖尿病患者是因DKD继发肾功能衰竭、尿毒症死亡的^[2]。淡豆豉异黄酮是中药材淡豆豉的主要成分，淡豆豉解表除烦、宣郁解毒，有研究显示淡豆豉异黄酮可治疗糖尿病^[3]，也有学者^[4]研发了黄精覆盆子压片糖果，其中包含了黄精、覆盆子、淡豆豉等多种中药材，可靶向修复肾脏组织、改善肾功能。据此推测，淡豆豉对DKD可能有效，而淡豆豉异黄酮作为淡豆豉的主要活性成分，可能在DKD治疗中也发挥着不可或缺的作用，但该推论仍需要进一步研究证实。转化生长因子-β1（TGF-β1）是DKD发生和发展的经典信号调控通路，其下游的Smads、Smad核转录共抑制因子（SnoN）也均参与其中，有研究指出^[5-7]TGF-β1表达增高可激活Smads，而SnoN可结合激活的Smads形成转录失活复合物，负向调控TGF-β1/Smads通路。然而淡豆豉异黄酮是否可通过调控TGF-β1/SnoN通路保护DKD小鼠的肾组织尚需深入研究。基于此，本研究选取50只清洁级db/db小鼠和10只清洁级db/m小鼠开展实验探讨上述问题，旨在为DKD新药的开发提供新方向。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

50只清洁级db/db小鼠和10只清洁级db/m小鼠，雌性、雄性各25只，4~6周龄，体质量18~30 g，来源：北京维通利华实验动物公司[SCXK（京）2020-0001]。本实验经郑州大学实验动物中心伦理委员会审批（审批号：ZZUEAC20200011），许可证号：SYXK（豫）2020-0015。

1.1.2 实验试剂

淡豆豉异黄酮（西安齐岳生物科技有限公司，批号：190814）；依那普利（深圳奥萨制药，规格：10 mg，批号：202001113）；二喹啉甲酸（BCA）法检测试剂盒（北京普利莱茵技术有限公司，货号：P1511-3）；己糖激酶法检测试剂盒（上海优选生物，批号：190812）；鼠血清血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、TGF-β1酶联免疫法（ELISA）试剂盒（上海酶联生物，批号：191014、191125、191103）；福尔马林（南京森贝伽生物，规格：10%，货号：R2052）；苏木精-伊红（HE）试剂盒（北京索莱宝，批号：201907145A）；Mallory试剂盒（北京索莱宝，批号：201910128C）；A1cⅠ、Ⅱ、Ⅲ（南京森贝伽生物，规格：均95%，货号：R2038A、R2041A、R2067）；A1c Ⅰ、Ⅱ（南京森贝伽生物，规格：均100%，货号：R2038B、R2041B）；Trizol（美国Invitrogen，货号Y10185）；反转录试剂盒（Takara中国公司，批号：190714）；TGF-β1、Smad2/3、Smad7、SnoN引物序列（美国ABI）；琼脂糖凝胶（南京森贝伽生物，规格：1%，货号：R3889）；兔抗鼠TGF-β1、Smad2/3、Smad7、SnoN、磷酸化-Smad2/3（p-Smad2/3）（一抗，稀释比例均1∶500），羊抗兔TGF-β1、Smad2/3、Smad7、SnoN、p-Smad2/3（二抗，稀释比例1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶5 000）（Abcam中国公司，货号：ab235506、ab230618、ab231715、ab230916、ab230115、ab230611、ab230425、ab230702、ab230410、ab230419）。

1.1.3 实验设备

3600M021型鼠代谢笼（意大利Tecniplast公司）；Z206型医用离心机（德国Hermle公司）；BS-220型全自动生化分析仪（广东迈瑞医疗）；BDF-86V158型超低温冰箱（山东博科集团）；HS-4000型组织切片机（金华市华速科技）；T100型聚合酶链反应（PCR）仪（美国Bio-Rad公司）；SE 600X型电泳仪（美国Hofer公司）。

1.2 方法 1.2.1 模型验证、分组与给药

标准饲料，25 ℃、50%湿度条件下，12 h光照12 h黑暗喂养1周。收集24 h尿液，采用BCA法测定24 h尿蛋白，若≥0.4 mg则记为建模成功，后随机分为模型组、依那普利组、淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组，10只db/m小鼠记为对照组。依那普利组予以依那普利10 mg/kg溶于0.1 mL/kg生理盐水中灌胃，淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组分别予以12.5 mg/kg（临床等效剂量）、25 mg/kg（临床等效剂量×2）、50 mg/kg（临床等效剂量×4）淡豆豉异黄酮溶于生理盐水中灌胃，对照组和模型组均予以生理盐水灌胃，均每日1次，共干预8周。

1.2.2 各组小鼠空腹血糖（FBG）、24 h尿蛋白

分别于干预前（分组后开始给药前）、4周后（给药4周后）、干预后（给药8周后）抽取小鼠尾静脉血并收集24 h尿液，采用己糖激酶法、BCA法测定各组小鼠FBG、24 h尿蛋白。

1.2.3 各组小鼠肾功能、血清TGF-β1水平检测

分别于干预前、4周后、干预后抽取小鼠尾静脉血，3 500 r/min离心10 min（离心半径10 cm），取上清采用ELISA试剂盒并利用全自动生化分析仪测定Scr、BUN、TGF-β1水平。

1.2.4 各组小鼠肾组织病理变化

1）取材与保存：于干预后处死各组小鼠，无菌摘取肾脏，做扇形纵切，固定于福尔马林固定液用于HE染色和Mallory染色；另取肾组织至于冻存管中液氮冷冻。2）HE染色：取组织脱水、石蜡包埋、修整、连续切片（层厚4 μm）、脱蜡，按说明书处理，中性树胶封片后于400倍显微镜下观察。3）Mallory染色：同上操作至脱蜡，入媒染液室温1 h，自来水冲洗1 min，超纯水冲洗1 min；入Ⅰ染液2 min，超纯水冲洗3 min；入Ⅱ染液20 min；95% A1c Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2 min，100%A1cⅠ、Ⅱ各3 min，后透明、封片及观察方法均同上。

1.2.5 各组小鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、Smad7、SnoN信使核糖核酸（mRNA）表达检测

取上述保存的肾组织采用实时-逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测。研磨匀浆，提取总RNA，鉴定纯度与完整性。反转录为25 μL互补的脱氧核糖核酸（cDNA），进行扩增反应，反应体系共22 μL，其中TGF-β1上游：5′-TAGCGATTAGCTATA-3′，下游：5′-CGCG CTATAGGCTAT-3′，预计产物长度260 bp；Smad2/3上游：5′-AGGCTATAGGCTATAGC-3′，下游：5′-CGATATGCTATAGGCGATA-3′，预计产物长度286 bp；Smad7上游：5′-TAGAGTTTCGAGATCTAGAGCT-3′，下游：5′-GCGTATAGCGTATAGCTAGCGAT-3′，预计产物长度296 bp；SnoN上游：5′-CGCGTATATATTATCTATAT-3′，下游：5′-ATTAAGCTATAGCGATATGC-3′，预计产物长度310 bp；β-actin上游：5′-CGATATTATCGAGATTCGATAG-3′，下游：5′-AGAGCTTAGAGCTATAGGCTAGCTAG-3′，预计产物长度240 bp。反应条件：94 ℃（3 min，预变性），35个循环：94 ℃（30 s，变性），60 ℃（60 s，退火），72 ℃（30 s，延伸），最后72 ℃（10 min，总延伸）。扩增产物电泳，用Bandscan图像分析系统分析各基因积分吸光度，计算目的基因与内参的吸光度比值记为目的基因的相对表达量。

1.2.6 各组小鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、Smad7、SnoN蛋白表达及p-Smad2/3水平检测

取上述保存的肾组织采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测。研磨匀浆，3 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），反复冲洗后再离心，共离心3次。弃磷酸盐缓冲液，加蛋白裂解液，置于冰上30 min，每隔3 min震荡1次。最后12 000次/min离心30 min（离心半径8 cm），取上清定量总蛋白。蛋白与缓冲液4∶1混匀。配置分离胶与浓缩胶，电泳。2 h后加一抗（1∶1 000），室温4 h。加入二抗（1∶5 000，经酶标记），室温2 h。暗室曝光、定影。Quantity one 4.1.1分析蛋白条带。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件处理，计量资料若符合正态分布且方差齐，采用均数±标准差（x ± s）描述，重复测量的数据用重复测量方差分析和LSD-t检验，多样本比较用单因素方差分析和SNK-q检验；计量资料若不符合正态分布，采用中位数（上四分位数，下四分位数）[M（Q₁，Q₃）]描述，用非参数秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组干预前、4周后、干预后FBG、24 h尿蛋白比较

50只db/db小鼠经验证有48只DKD模型建立成功，成功率为96.00%，分为模型组（10只）、依那普利组（9只）、淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组（9、10、10只）。给药期间6组小鼠均无异常死亡。

与正常组比较，其余5组FBG、24 h尿蛋白均升高（P＜0.05）；与模型组比较，依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组4周后、干预后24 h尿蛋白均下降（P＜0.05）；与依那普利组比较，淡豆豉异黄酮低剂量组4周后、干预后24 h尿蛋白均升高（P＜0.05），淡豆豉异黄酮中剂量均无显著变化（P＞0.05），淡豆豉异黄酮高剂量组4周后、干预后24 h尿蛋白均下降（P＜0.05）；依那普利组各时刻FBG与模型组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；与干预前比较，模型组4周后、干预后FBG、24 h尿蛋白与依那普利组FBG均升高（P＜0.05），淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组FBG、24 h尿蛋白与依那普利组24 h尿蛋白均下降（P＜0.05）；与4周后比较，模型组干预后FBG、24 h尿蛋白与依那普利组FBG均升高（P＜0.05），淡豆豉异黄酮高剂量组均下降（P＜0.05），依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组干预后24 h尿蛋白均下降（P＜0.05）。见表 1。

2.2 各组干预前、4周后、干预后肾功能、TGF-β1水平比较

与正常组比较，其余5组Scr、BUN、TGF-β1水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组4周后、干预后均下降（P＜0.05）；与依那普利组比较，淡豆豉异黄酮低剂量组4周后、干预后均升高（P＜0.05），淡豆豉异黄酮中剂量均无显著变化（P＞0.05），淡豆豉异黄酮高剂量组4周后、干预后均下降（P＜0.05）；与干预前比较，模型组4周后、干预后Scr、BUN、TGF-β1均升高（P＜0.05），依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组均下降（P＜0.05）；与4周后比较，模型组干预后Scr、BUN、TGF-β1均升高（P＜0.05），依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组干预后均下降（P＜0.05）。见表 2、表 3。

2.3 各组小鼠肾组织病理改变比较

正常组小鼠肾结构清晰、层次分明；模型组小鼠可见肾小球肥大改变，系膜细胞与肾小球壁层上皮细胞大量增生，肾间质炎性浸润严重，部分肾小管萎缩且有大量透明管型；依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组小鼠肾组织均较模型组有改善，且淡豆豉异黄酮高剂量组肾组织结构最接近正常。见图 1。

Mallory染色显示正常组小鼠肾小球系膜区、肾小管间质仅有极少量胶原纤维；模型组小鼠肾小球系膜区、肾小管间质可见大量胶原纤维沉积；依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组小鼠肾小球系膜区、肾小管间质胶原纤维均较模型组减少，且淡豆豉异黄酮高剂量组胶原纤维沉积量少，与正常组最为接近。见图 2。

2.4 各组小鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、Smad7、SnoN mRNA相对表达量比较

与正常组比较，其余5组TGF-β1、Smad2/3 mRNA相对表达量均升高（P＜0.05），Smad7、SnoN mRNA相对表达量均下降（P＜0.05）；与模型组比较，依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组TGF-β1、Smad2/3 mRNA相对表达量均下降，（P＜0.05），Smad7、SnoN mRNA相对表达量均升高（P＜0.05）；与依那普利组比较，淡豆豉异黄酮低剂量组TGF-β1、Smad2/3 mRNA相对表达量均升高（P＜0.05），Smad7、SnoN mRNA相对表达量均下降（P＜0.05），淡豆豉异黄酮中剂量组均无显著变化（P＞0.05），淡豆豉异黄酮高剂量组TGF-β1、Smad2/3 mRNA相对表达量均下降（P＜0.05），Smad7、SnoN mRNA相对表达量均升高（P＜0.05）。见表 4。

2.5 各组小鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、Smad7、SnoN蛋白表达与p-Smad2/3水平比较

与正常组比较，其余5组TGF-β1蛋白、p-Smad2/3水平相对表达量均升高（P＜0.05），Smad7、SnoN蛋白相对表达量均下降（P＜0.05）；与模型组比较，依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组TGF-β1蛋白、p-Smad2/3水平相对表达量均下降，（P＜0.05），Smad7、SnoN蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）；与依那普利组比较，淡豆豉异黄酮低剂量组TGF-β1蛋白、p-Smad2/3水平相对表达量均升高（P＜0.05），Smad7、SnoN蛋白相对表达量均下降（P＜0.05），淡豆豉异黄酮中剂量组均无显著变化（P＞0.05），淡豆豉异黄酮高剂量组TGF-β1蛋白、p-Smad2/3水平相对表达量均下降（P＜0.05），Smad7、SnoN蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）。见表 5，图 3。

3 讨论

DKD早期常出现微量白蛋白尿，继而可出现大量蛋白尿，最终可导致慢性肾功能衰竭，甚至病死。因此该领域工作者应积极探讨DKD的有效防治措施。db/db小鼠属于自发性2型糖尿病，4周龄开始可出现贪食、肥胖等表现，且可发展为早期DKD^[8]，因此本研究选用db/db小鼠实验。db/m小鼠是一条链为db杂合另一条链为dock7突变的小鼠，此类小鼠糖代谢正常，且不会引发DKD，故本研究选用db/m小鼠作为正常对照。

血糖长期处于高水平是DKD发生的重要原因，高血糖水平可导致肾血流量增高，引起肾小球滤过率升高，进而可增加肾脏负担，诱发DKD并逐步加重^[9]。本研究发现依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组均可降低DKD小鼠的24 h尿蛋白水平，还可改善肾功能，减轻肾病变，且淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组还可降低FBG，淡豆豉异黄酮高剂量组的效果最佳。依那普利为血管紧张素转换酶抑制剂，具有降血压作用，可改善DKD的肾功能，减轻肾损害^[10]，因此本研究选用该药物作为阳性对照，但是依那普利并无降糖作用，故而依那普利组小鼠的FBG持续处于高水平。另外本研究针对FBG、24 h尿蛋白、肾功能设置了干预前、4周后和干预后共3个观察时间点，主要考虑到DKD是一个慢性的病理改变过程，而药物干预也是一个缓慢的过程，另外设置3个观察时间点不仅能了解上述指标的动态改变，还可明确依那普利和淡豆豉异黄酮对DKD的持续作用。

淡豆豉性苦寒，清火散阴，清上降火，主治伤寒热病、寒热证等。DKD可归属于中医“消渴”“水肿”“虚劳”等范畴，久病入络，而肾乃络脉聚集之所，加之久病伤耗阴津，痰热郁结，阻于脉络，形成微型症瘕。淡豆豉治疗虚劳、关格诸症由来已久，现代中医学家认为^[11]淡豆豉善治热病口渴、阴虚消渴，与淡豆豉炮制过程中需加入桑叶、青蒿等清热消渴、滋阴生津有关。药理研究发现^[12]，淡豆豉中富含大豆蛋白、异黄酮等成分，可经微生物发酵或体外酸水解进而释放出苷元，被机体吸收、利用，进而发挥降糖作用。有报道指出^[13]，淡豆豉中的不同成分均能够调节糖脂代谢，其中淡豆豉异黄酮作用最佳，淡豆豉多糖效果次之，本研究部分结果与该报道一致。由此可知，淡豆豉异黄酮可降低DKD小鼠的血糖水平。也有研究显示^[14]淡豆豉提取物对2型糖尿病大鼠大血管病变有理想的防治作用。而淡豆豉异黄酮对DKD的治疗作用并未见既往相关报道。

TGF-β1已成为公认的致纤维化因子，可参与肾小球系膜区和肾小管间质细胞外基质代谢，影响细胞外基质的合成与降解。有报道证实^[15]，TGF-β1/Smad2/3通路的活性可影响基质沉积和上皮细胞间质转化，参与肾系膜增生与纤维化。另一方面，TGF-β1还可促进蛋白尿的形成，在DKD病变过程中受致病因素刺激，TGF-β1信号转导通路被激活，TGF-β1表达升高，血清TGF-β1水平升高的同时还可导致大量蛋白质从肾基底膜区域受损的裂隙膜通过，增加24 h尿蛋白水平，并伴随着肾小球硬化及肾间质纤维化^[16]。本研究发现模型组血清TGF-β1升高，且肾组织TGF-β1、Smad2/3 mRNA表达与TGF-β1蛋白表达、p-Smad2/3水平也升高，与上述分析相符，提示TGF-β1/Smad2/3通路激活可能是DKD发生的重要机制，也有既往研究证实该结论^[17]。

Smad是TGF-β1受体胞内激酶底物，可经Smad蛋白将TGF-β1的活性信息传至细胞核，调节基因的转录和下游蛋白的表达。激活的TGF-β1可激活Smad2/3，使其磷酸化并向核内传递信号，同时抑制Smad7表达，放大肾脏纤维化病变信号^[18]。SnoN可与TGF-β1反应基因启动子上的因子作用抑制后者的转录，还可募集Sin3等形成大分子复合物间接抑制TGF-β1，并能够干扰复合物与转录辅激活剂的相互作用进而抑制TGF-β1。有研究表明^[19]，Smad7与SnoN的缺失均是诱发并加重肾纤维化的基础。但是在无特异性信号激活剂和阻断剂佐证的前提下，结合既往报道中的结论：Smads信号通路上游存在负性调控因子SnoN，且该因子可通过与Smads的相互作用抑制TGF-β1转录^[20]，加之本研究发现依那普利组和淡豆豉异黄酮低、中、高剂量组肾组织结构与功能损害减轻，故而可以推测依那普利、淡豆豉异黄酮均可抑制TGF-β1和Smad2/3表达，降低p-Smad2/3水平，增强Smad7和SnoN表达。

综上，依那普利和淡豆豉异黄酮均可降低DKD小鼠的24 h尿蛋白水平，改善肾功能，降低血清TGF-β1，减轻肾组织病理改变和纤维化病变，抑制TGF-β1和Smad2/3表达，降低p-Smad2/3水平，增强Smad7和SnoN表达，且淡豆豉异黄酮还可降低FBG水平，其肾保护作用呈剂量依赖性，在DKD防治方面显示出良好的开发前景。