肝癌是全球第7大最常见的恶性肿瘤，也是第2大最常见的死亡原因，对全球健康构成了重大挑战^[1]。据报道，2020年全球有905 677例新发肝癌患者，死亡患者有830 180例^[2]。中国每年有395 000例病例，患病率为每100 000人有35例，占全球肝癌负担的一半^[3]。目前肝癌主要治疗方式是手术切除肿瘤或肝脏移植、化疗等，但存在着术后复发率高、耐药性、预后效果差等重大临床问题尚需解决。

肝癌中医病名归属于“积聚”范畴。“五脏之伤，穷必及肾”，肾虚是肝癌发展的最终转归，也是肝癌形成的内在根本原因。肝体阴而用阳，肝以气为用属阳，以血为本属阴，气滞瘀浊互结是肝癌发生的重要病理机制之一。中医药抗肿瘤受到广泛的关注和认可^[4]。肉桂与姜黄均为国家卫生部确定的药食同源名单，是广西桂十味道地药材和广西区域特色药材。肉桂辛、甘，大热，归肾、脾、心、肝经，主攻温补肾阳、温通经脉；姜黄辛、苦，温，归脾、肝经，主攻破血行气。肉桂、姜黄两药配伍扶正祛邪，切合中晚期肝癌本虚标实的病机本质。肉桂醛、姜黄素分别作为肉桂、姜黄的主要活性成分，近年来研究发现两者均具有良好抗肿瘤活性^[5-8]。但两者是否协同抗肝癌的作用机制有待探究。

因此，本研究基于网络药理学与分子对接技术，对肉桂醛、姜黄素的潜在作用机制进行系统预测，并通过细胞体外实验观察两药联合对SMMC-7721肝癌细胞增殖、凋亡的影响，并采用定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）对其分子机制进行初步探索验证，为寻找有效治疗肝癌药食同源中药及其联合用药提供实验基础。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

SMMC-7721肝癌细胞由广西中药药效研究重点实验室提供。肉桂醛、姜黄素（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C10128940、458377）。胎牛血清（Gibco，批号：2158737CP）、DMEM培养基（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20211021）、胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20210809）、FastPure Cell Tissue Total RNA Isolation Kit V2、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、5× TBE Buffer（诺唯赞生物技术有限公司，货号：RC112、R223-01、Q711-02、GT-RS0202- 0500）、6× Glycerol DNA Loading Buffer（国拓生物技术有限公司，货号：GT- RS0702-0005）。Hoechst33258染色液（江苏凯基生物技术股份有限公司，货号：KGA1801-100）。

1.2 仪器

荧光定量PCR仪（德国AnalytikJena，型号：GT-RS0702-0005）、全自动化学发光/荧光图像分析系统（上海天能科技有限公司，型号：5200Multi）、台式冷冻离心机（德国eppendorf，型号：5430R）、涡旋混合器（江苏省金坛市荣华实验器材有限公司，型号：XH-C）、酶标仪（美国BioTek，型号：Epoch）、荧光倒置显微镜（德国LEICA，型号：CKX41）。

1.3 肉桂醛与姜黄素潜在靶点预测

以肉桂醛“Cinnamaldehyde”、姜黄素“Curcumin”为关键词检索，在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中获取肉桂醛、姜黄素Canonical SMILES号和3D化学结构式（格式保存为“SDF”）；利用3D结构“SDF”文件在PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库中预测靶点，利用Canonical SMILES号在SwissTarget（http://www.Swiss target prediction.ch/）数据库（选取“Prob” > 0的靶点）和TargetNet（http://targetnet.scbdd.com/）数据库（选取“Prob” > 0的靶点）中预测靶点；至少两个数据库中预测到的靶点才进行使用，将所得到的靶点进行汇总。剔除重复项后利用Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库将其转化为基因名。

1.4 肝癌潜在作用靶点预测

在GeneCards（https://www.genecards.org/）（选取“score” > 15的基因）、OMIM（https://www.omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库中分别以“liver cancer”和“Hepatocellular cancer”为关键词检索获取基因，将符合条件基因汇总，删除重复项，取并集。

1.5 构建药物-疾病靶点网络

利用Venny 2.1.0（//bioinfogp.cnb.csic.es/）找到肉桂醛、姜黄素与肝癌的交集基因，绘制Venny图。

1.6 蛋白相互作用（PPI）网络构建及分析

将所获得的交集基因导入STRING（https://string-db.org/）数据库，得到PPI网络，并导出TSV文件，利用Cytoscape对交集基因进行蛋白相关网络绘制。

1.7 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

将药物与疾病的交集基因导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/），进行GO生物学过程富集分析和KEGG信号通路注释分析，将结果汇总后绘制图片。

1.8 分子对接验证

该研究拟验证4个核心靶点，分别是：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶-9（MMP9）、肿瘤坏死因子（TNF），通过PPI中按照Degree值排序得出，排列第1的AKT1核心靶点也是后续拟开展磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT通路研究的主要核心靶点。

为进一步确定小分子化合物与核心靶点稳定性的作用关系，将肉桂醛、姜黄素分子化合物利用pubchem下载小分子配体3D结构，并运用OpenBabelGUI软件进行格式转化mol 2结构；再通过PDB数据库下载核心靶点蛋白*pdb格式文件，经pymol及Autodock软件进行去溶剂分子、水分子、配体及加氢等处理，再运用Autogrid及Autodock将小分子化合物与靶点蛋白进行分子对接，最后运用Pymol进行结果可视化。

1.9 分组及干预

实验分组为空白对照组、肉桂醛、姜黄素以及联合用药组。收集对数生长期的SMMC-7721肝癌细胞，以每孔100 μL接种于96孔板中（1×10⁵个/mL）培养，贴壁后分别干预。根据前期实验结果摸索，最终定下各组优化干预浓度，肉桂醛为8 μg/mL，姜黄素为5 μg/mL、联合用药组为8 μg/mL+5 μg/mL。每组设4个复孔。

1.10 噻唑蓝（MTT）法测肝癌细胞存活率

取对数生长期的SMMC-7721细胞，以每孔1 mL接种于6孔板中（1×10⁵个/mL）培养，培养24 h后，弃掉旧的培养基加入药物干预，分别分组干预24 h后，进行MTT检测，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，培养4 h，后弃上清，加入150 μL/孔的二甲基亚砜（DMSO）溶液；使用酶标仪在490 nm处测定吸光度A，计算细胞存活率，存活率=（A给药组-A空白孔）/（A空白对照组-A空白孔）×100%。以药物相互作用指数（CDI）作为协同效应筛选标准。联合用药组存活率用AB表示，单个药细胞存活率用A或B表示；CDI＝AB/（A×B）。0.7≤CDI＜1表示协同，CDI＜0.7表示显著协同，CDI＝1表示相加，CDI＞1表示拮抗^[9]。

1.11 Hoechst 33258染色法观察肝癌细胞凋亡率

取对数生长期的SMMC-7721细胞，以每孔1 mL接种于6孔板中（1×10⁵个/mL）培养，培养24 h后，弃掉旧的培养基分组进行干预，24 h后，弃掉旧的培养基，磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）清洗2次，加入4%多聚甲醛，每孔1 mL，15 min后，弃掉固定液，PBS清洗2次，加入Hoechst33258染色液，每孔0.5 mL，避光染色10 min，弃掉染色液，用PBS清洗3次，在荧光显微镜下观察并拍照。Image-J图像分析软件计算凋亡细胞数。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.12 RT-qPCR法检测相关基因表达

取适量SMMC-7721细胞并转移至EP管中，加入TRIzol提取总RNA，加入逆转录酶进行逆转录制备cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参进行PCR扩增，检测各干预组PI3K、AKT1、mTOR、NF-κB1 mRNA的表达水平。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s；扩增引物由南宁国拓生物技术有限公司合成。引物序列见表 1。各组均设3个复孔。以2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.13 统计学方法

所有数据均使用SPSS23.0软件进行分析，统计结果以均数±标准差（x ± s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，方差不齐采用非参数检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 肉桂醛、姜黄素与肝癌相关靶点的获取

在数据库中筛选获得肉桂醛、姜黄素对应靶点86个与肝癌相关靶点1 274个，获取交集，通过Venny图得到共同作用靶点37个。见图 1。

2.2 PPI网络构建

将获得的37个交集基因导入STRING数据库，下载TSV格式文件，用Cytoscape3.8.0软件构建PPI网络图，见图 2。图中橘红色越深，Degree值越大，节点与节点相连的数目越多。AKT1、EGFR、MMP9、TNF等可能为核心靶点。

2.3 GO富集分析与KEGG信号通路分析

GO功能富集分析结果显示肉桂醛、姜黄素在分子功能方面主要参与蛋白激酶活性、蛋白激酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性等过程；在细胞组分方面主要影响质膜；生物过程方面主要参与DNA模板化、对β-淀粉样蛋白的反应等。见图 3。KEGG通路的富集分析结果显示，共富集到197条通路与肉桂醛、姜黄素抗肝癌相关，主要包括PI3K/Akt通路、白细胞介素（IL）-17通路、VEGF通路等。见图 4。

2.4 分子对接分析

将肉桂醛、姜黄素与主要核心靶点AKT1（PDBID：3QKL）、EGFR（PDBID：8A27）、MMP9（PDBID：4XCT）、TNF（PDBID：5UUI）进行对接验证。选择核心靶点晶体复合物，见表 2。结合能小于-5.0 kcal/mol提示代表具有较强的结合活性，见表 3。结果表示，肉桂醛、姜黄素均对AKT1具有较好的亲和性。

将后续拟开展的实验靶蛋白AKT1与肉桂醛、姜黄素进行最优构想可视化。见图 5。结果所示，肉桂醛借助氢键可能与AKT1的SYS-310^[10]氨基酸残基发挥作用。姜黄素借助氢键可能与AKT1的GLU-234^[11]、GLU-191、PHE-161^[12]氨基酸残基发挥作用。

2.5 肉桂醛-姜黄素联合用药对肝癌细胞存活率的影响

与空白对照组比较，肉桂醛组、姜黄素组、联合用药组的肝癌细胞存活率显著下降（P＜0.01）；与肉桂醛组比较，联合用药组的肝癌细胞存活率显著下降（P＜0.01）；与姜黄素组比较，联合用药组的肝癌细胞存活率显著下降（P＜0.01）。根据细胞存活率计算公式，CDI=0.54＜0.7，视为具有显著协同效应。见表 4。

2.6 肉桂醛-姜黄素联合用药对肝癌细胞凋亡的影响

Hoechst 33258实验结果显示，空白对照组细胞核分布均匀，染色为淡蓝色，荧光微弱；与空白对照组相比，肉桂醛组、姜黄素组、联合用药组干预后，细胞核呈亮蓝色染色数目增多，细胞核因染色后质浓缩，呈不规则形态，如梭形、圆形。联合用药组细胞凋亡程度较肉桂醛组、姜黄素组高。与空白对照组相比，肉桂醛组、联合用药组的细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与肉桂醛组比较，联合用药组的细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与姜黄素组比较，联合用药组的细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。见图 6。

2.7 肉桂醛-姜黄素联合用药对肝癌细胞PI3K、Akt、NF-κB1的mRNA基因表达影响

与空白对照组比较，肉桂醛组、联合用药组PI3K、AKT1的mRNA表达显著下降（P < 0.01）；联合用药组mTOR、NF-κB1的mRNA表达显著下降（P < 0.01）。与肉桂醛组比较，联合用药组mTOR的mRNA表达显著下降（P < 0.05）；与姜黄素组比较，联合用药组PI3K、AKT1的mRNA表达显著下降（P < 0.05或P < 0.01）。见表 5。

3 讨论

本课题组充分利用独特药食资源优势，对肉桂、姜黄两药进行研究，两药相合，补肾、行气、化瘀切合肝癌本虚标实的病机本质。其中肉桂醛、姜黄素是从肉桂、姜黄中提取到的有效成分，两者是具有多种抗癌特性的有前途的活性天然化合物，两药联合具有更强的抗肿瘤疗效优势。

本研究运用网络药理学预测肉桂醛、姜黄素治疗肝癌的靶点结果显示，经筛选AKT1、EGFR、MMP9、TNF是作用于肝癌的主要关键靶点。AKT1属于AKT家族中的一员，存在于哺乳动物的细胞中并参与到肿瘤细胞的发生发展当中。活化的AKT1蛋白通过调控其下游靶基因的级联表达，触发一系列影响细胞增殖、分化、凋亡、侵袭和迁移的致癌程序^[13]。EGFR是一种细胞表面受体，属于受体酪氨酸激酶的ErbB家族，EGFR通过结合特异性配体来激活，如表皮生长因子（EGF）或转化生长因子-α（TGF-α），其过表达与肿瘤发生、发展密切相关，可作用于下游相关信号通路来调节肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移^[14]。MMPs水平升高，尤其是MMP-9水平升高，被认为是肝癌发生的重要因素，也是肿瘤侵袭和血管生成的促进剂^[15]。TNF是肝硬化或慢性肝病患者在肝脏损伤过程中异常表达的炎性细胞因子，炎性介质释放引起细胞损伤，随后由免疫反应介导的再生，在肝癌发生中起主要作用^[16]。本研究进一步通过分子对接发现，两药均与AKT1具有较好的亲和性。

为进一步阐明肉桂醛与姜黄素通过AKT1靶点产生作用，本研究进行了靶点功能富集分析，结果证实与PI3K/AKT通路有关。在肿瘤发展中PI3K/AKT信号通路起着重要的中心作用，并与调节与肿瘤相关的广泛生物学过程的其他途径密切相关，也是开发肝癌治疗新靶点的关注点。PI3K/AKT通路激活时会促进肝癌细胞迁移、侵袭和增殖^[17]，抑制PI3K/AKT信号通路能抑制肝癌细胞增殖和转移^[18]。已经发现具有激活的PI3K/AKT信号传导的癌症变得更具侵袭性，并且AKT途径激活是临床肝癌患者早期复发和不良预后的显著风险因素^[19]。活化的AKT能够启动PI3K/AKT信号通路下游级联反应，进一步磷酸化下游mTOR促进细胞发生凋亡，也能激活下游底物NF-κB，促进细胞增殖，提高化疗药物耐受性。目前，针对PI3K/AKT信号轴和不同下游通路的抑制剂正在临床试验中^[20]。因此，本研究选择对该PI3K/AKT信号通路因子PI3K、AKT及下游通路关键靶点mTOR、NF-κB1进行体外细胞实验验证，通过RT-qPCR法结果发现肉桂醛与姜黄素联合用药能显著抑制SMMC-7721肝癌细胞的PI3K、AKT1、mTOR、NF-κB1 mRNA的表达。

细胞过度增殖与凋亡被抑制会引起肿瘤的发生，抑制细胞的增殖与促进凋亡是治疗癌症的关键^[21]。本研究结果显示，通过MTT法检测发现肉桂醛、姜黄素两药联合对SMMC-7721肝癌细胞存活率呈显著抑制作用。此外，通过Hoechst 33258染色法观察两药联合对SMMC-7721肝癌细胞凋亡形态和凋亡率的影响，亦发现两药联合能够诱导肝癌细胞凋亡，为肉桂联合姜黄临床抗肝癌作用机制提供前期实验依据。

综上，本研究借助网络药理学和分子对接系统分析了肉桂醛联合姜黄素治疗肝癌的潜在作用靶点和作用机制，最后通过体外细胞实验验证了其联合用药抑制肝癌细胞活性，诱导肝癌细胞凋亡的作用，其抗肝癌机制可能是通过下调PI3K/AKT信号通路有关。后续将进一步从动物实验深入探索。本研究为中医药抗肝癌多靶点、多途径作用机制研究提供方法学借鉴，并为今后研究药食两用中药资源肉桂联合姜黄临床治疗肝癌提供有价值的参考依据。