2024, Vol. 41文章信息
- 陈秋玲, 张金秀, 程若溪, 等.
- CHEN Qiuling, ZHANG Jinxiu, CHENG Ruoxi, et al.
- 基于网络药理学和实验验证探讨二氢杨梅素治疗炎症性肠病的作用机制
- Mechanism of dihydromyricetin in the treatment of inflammatory bowel disease based on network pharmacology and experimental verification
- 天津中医药, 2024, 41(8): 1063-1068
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2024, 41(8): 1063-1068
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2024.08.19
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文章历史
- 收稿日期: 2024-03-20
炎症性肠病（IBD）是一种以腹痛、腹泻为主要症状的肠道慢性炎症性疾病，其发病率在中国逐年增加[1-2]。IBD的发病机制与环境因素、遗传易感性、免疫失调和肠道菌群紊乱等息息相关[3]。目前IBD的治疗除传统药物外，还出现了生物制剂、粪菌移植、益生菌及微生物代谢物抑制剂等新兴药物[4-5]。然而仍有一部分患者存在无反应性或不良反应[5]。因此寻找不同治疗靶点的药物尤为重要。
二氢杨梅素（DHM）作为一种天然的二氢黄酮化合物在藤茶中含量极高，中国湖南及广西瑶族将其作为中药用于治疗发热、黄疸、头痛、肝炎等[6]。研究表明其具有抗炎、抗氧化、调节线粒体功能障碍、自噬及抗肿瘤等多种药理作用[7]。此外DHM还通过多种机制抑制肝癌[8]、肺癌[9]、乳腺癌[10]、宫颈癌[11]、结直肠癌[12]等肿瘤的发生发展。DHM目前被推荐用于治疗多种疾病，如酒精中毒、代谢或神经失衡，并且DHM胶囊已作为预防醉酒的营养补充剂在美国出售[13]。作为一种类黄酮，DHM在胃的酸性环境下保持稳定，而在pH 6.8的肠道中部分降解[14]。根据DHM的良好抗炎特性及在胃肠道停留代谢的特点，DHM在胃肠道的炎症性疾病中是否也具有良好的治疗作用，目前已有研究表明DHM能通过调节肠道微生物群改善肠道屏障功能及结肠炎症[15-16]，但是DHM是否能真正改善IBD并用于临床治疗仍需更多研究验证和机制探索。
本研究旨在通过网络药理学对DHM治疗IBD的靶点和通路进行预测分析，并采用体外实验对DHM在IBD中的抗炎作用及其机制进行验证，为后续DHM治疗IBD的药物开发提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 网络药理学分析 1.1.1 DHM潜在靶点的预测与筛选使用Pubchem数据库（https//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），查找关键字“Dihydromyricetin”，找到并下载其3D化合物结构，将文件导入PharmMapper服务器（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）。确定潜在靶点后，筛选Norm Fit≥0.7的基因并将其输入Uniprot（https://www.Uniprot.org/）网站中，规范化基因名，并查找对应的Uniprot号。
1.1.2 IBD作用靶点筛选与交集基因获取在GeneCards（https://www.genecards.org/）（选取“score” > 10的基因）、OMIM（https://www.omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.com/）数据库中分别以“ulcerative colitis” “Crohn’s disease”和“inflammatory bowel disease”为关键词检索获得靶点基因，删除重复基因后利用Uniprot数据库将其转化为基因名。将所获得的IBD靶点基因与DHM作用靶点相交，使用韦恩图将其可视化，所获得的交集基因即为DHM治疗IBD的靶点基因。
1.1.3 DHM与IBD交集的靶点蛋白互作（PPI）网络构建将上述获得的交集靶点基因输入STRING数据库（https://cn.string-db.org/），物种选择Homo sapiens，并用cytoscape 3.9.1可视化。
1.1.4 KEGG、GO分类富集分析使用R语言程序“tidyverse”“clusterProfiler”“gglot2”等语言包对DHM与IBD的交集靶点进行GO功能分析及KEGG通路富集分析，并将富集结果绘制气泡图。
1.2 细胞实验 1.2.1 细胞培养HT-29细胞接种于培养皿中，待细胞密度达到60%~80%后，使用0.5 μg/mL脂多糖（LPS）干预24 h，而后使用200 μmol/L DHM干预48 h后刮取细胞进行后续实验。
1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）按qPCR试剂盒说明进行操作，PCR指数扩增，循环数参照文献进行。应用Primer 5.0软件设计特异性引物。PCR产物通过计算机自动计算2-△△CT数值。引物序列见表 1。
蛋白上样，电泳，使用0.22 μmol/L PVDF膜电转。室温BSA封闭1 h，TBST洗膜，4 ℃孵育一抗ZO-1（Proteintech，21773-1，1∶2 000）、E-cadherin（ABclonal，A3044，1∶1 000）、GAPDH（proteintech，60004-1，1∶10 000）过夜。TBST洗膜，二抗室温孵育1 h，再次洗膜。使用Odyssey红外成像仪检测条带，Image J分析条带灰度值并归一化处理。
1.3 统计学方法采用SPSS 23.0软件或GraphPad Prism 8.0对数据进行统计学分析，结果以均数±标准差（x ± s）表示，多样本计量资料使用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 DHM、IBD交集靶点基因获取使用PharmMapper数据库筛选DHM相关靶点（Normal Fit > 0.5）共168个。在GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB、Drugbank数据库筛选出8 277个IBD靶点基因。取DHM和IBD靶点交集基因42个。见图 1。
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| 图 1 DHM预测靶点与IBD疾病靶点交集 Fig. 1 Intersection of DHM prediction targets and IBD targets |
将DHM与IBD的42个交集基因上传至STRING数据库，获得DHM治疗IBD的相关靶点PPI网络并使用Cytoscape将其可视化。其中凝血因子Ⅱ（F2）、内皮型一氧化氮合酶3（NOS3）、丝氨酸羟甲基转移酶1（SHMT1）、造血细胞激酶（HCK）、二氢叶酸还原酶（DHFR）作为度值前5名的基因，说明DHM最有可能通过其靶点改善IBD。见图 2。
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| 图 2 交集靶点蛋白关系互作网络关键靶点筛选 Fig. 2 Key target screening in the intertarget protein-relationship interaction network |
使用R语言对DHM和IBD的交集靶点进行GO和KEGG富集分析。GO功能分析显示DHM干预的生物过程（BP）主要在凝血、调节体液水平等；细胞组分（CC）主要涉及丝氨酸型内肽酶/丝氨酸型肽酶复合物、质膜筏、细胞膜小窝等。分子功能（MF）主要有丝氨酸型内肽酶/丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性、氰酰胺水合酶活性、肽链内切酶活性等。KEGG分析得到14条通路途径（P < 0.05），选取前10条通路途径绘制分析网络图，显示补体与凝血级联、黏附连接、趋化因子、Ras信号通路、胰岛素信号转导等与DHM的药物作用通路相关。见图 3。
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| 图 3 DHM治疗IBD靶点基因GO和KEGG富集分析 Fig. 3 Enrichment analysis of GO and KEGG target genes in the treatment of IBD by DHM |
使用LPS干预HT-29细胞进行造模，与对照组对比，LPS造模组炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α，P < 0.01）、白细胞介素-1β（IL-1β，P < 0.01）、白细胞介素-18（IL-18，P < 0.01）水平显著上升。而与LPS造模组相比，DHM干预组炎症因子TNF-α（P < 0.01）、IL-1β（P < 0.01）、IL-18（P < 0.01）水平显著下降。这说明DHM可以抑制LPS诱导的HT-29细胞炎症因子的释放。见图 4。
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| 注：control，对照组。与对照组比较，**P<0.01；与LPS组比较，##P<0.01。 图 4 DHM对LPS诱导的HT-29细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-18 mRNA表达的影响 Fig. 4 Effect of DHM on mRNA expression of LPS-induced inflammatory factors TNF-α, IL-1β and IL-18 in HT-29 cells |
基于网络药理学的结果，选择差异相对显著的NOS3、SHMT1、HCK、DHFR进行RT-qPCR验证。结果显示，与对照组相比，LPS造模组细胞NOS3（P < 0.01）、HCK（P < 0.01）的mRNA水平增加。而使用200 μM DHM干预后，NOS3（P < 0.01）、HCK（P < 0.05）mRNA水平明显下调。提示DHM可能通过NOS3、HCK靶点发挥治疗结肠炎作用。而SHMT1、DHER mRNA表达水平差异无统计学意义。见图 5。
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| 注：control，对照组。与对照组比较，**P<0.01；与LPS组比较，#P<0.05，##P<0.01。 图 5 DHM对LPS诱导的HT-29细胞核心靶点NOS3、SHMT1、HCK、DHFR mRNA表达水平的影响 Fig. 5 Effect of DHM on mRNA expression levels of NOS3, SHMT1, HCK and DHFR, the core targets of HT-29 cells induced by LPS |
肠道屏障的破坏是IBD发病的重要原因之一。KEGG富集分析结果显示，DHM可能通过调节黏附连接治疗IBD。Western blot检测各组细胞连接蛋白E-cadherin、ZO-1的表达水平。与对照组相比，LPS造模组HT-29中E-cadherin（P < 0.01）、ZO-1（P < 0.01）表达水平下调，而DHM干预后能够恢复HT-29细胞E-cadherin（P < 0.05）、ZO-1（P < 0.05）蛋白表达水平。见图 6。
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| 注：control，对照组。与对照组比较，**P<0.01；与LPS组比较，#P<0.05。 图 6 DHM对LPS诱导的HT-29细胞ZO-1、E-cadherin蛋白表达水平的影响 Fig. 6 Effect of DHM on the expression of ZO-1 and E-cadherin proteins in LPS-induced HT-29 cells |
IBD作为一种特发性肠道炎症性疾病，不仅累及胃肠道并发肠外并发症，还大大增加患者结肠癌的发病率[17]。而DHM具有强大的抗炎、抗氧化特性[18]，对神经炎症、肺炎、肝炎等都具有良好的抗炎作用[14, 19-20]。但目前DHM治疗IBD的研究有限，其具体作用机制尚不明确。
本研究使用网络药理学结合体外实验筛选并验证DHM治疗IBD的可能作用机制。DHM可能通过多靶点多种作用机制抑制肠道炎症。NOS3作为一种一氧化氮合酶，能使一氧化氮（NO）迅速氧化为亚硝酸盐和硝酸盐，导致细胞内ATP和NAD的消耗，诱导肠上皮通透性增加，还能通过介导中性粒细胞和巨噬细胞趋化并促进炎症[21-22]。而NO的上调也可以破坏细胞间紧密连接[23]。同时，缺乏DHFR在心血管疾病中通过驱动线粒体功能障碍导致血管重构和炎症巨噬细胞浸润[24]。研究发现Ras依赖的PI3K可以激活整合素，并通过调节细胞迁移和黏附参与炎症的发生发展[25]。其次，DHM或存在抑癌、抑制慢性炎症向癌症转化的潜在药理作用。HCK作为结直肠腺瘤发生的潜在驱动因素，促进腺瘤向癌变过程的进化[26]。研究表明溃疡性结肠炎（UC）患者存在高凝性、纤溶系统功能亢进、凝血酶原时间（PT）和部分凝血活素时间（APTT）升高，并且可作为UC活动性评估指标[27]。网络药理学结果显示DHM作用于F2，且与补体凝血级联有较高相关性，提示DHM或可改善IBD患者高凝血状态，降低并发症风险。而在体外实验中，LPS干预后NOS3、HCK表达水平增高，DHM干预可在一定程度上抑制其上调。进一步验证了网络药理学的预测结果，但其具体机制仍需更深入地研究。
肠道屏障完整性的破坏在结肠炎的发生发展中有至关重要的作用。其中在IBD患者病变部位处细胞紧密连接（TJs）结构破坏明显[28]。黏附连接（AJs）相关蛋白在IBD活动期也明显减少，缺乏黏附连接蛋白的小鼠表现出与IBD极为相似的病理特征[29-30]。已有研究发现DHM可以通过调节失调的肠道菌群及相关代谢、改善DSS诱导的结肠炎组织病理损伤及肠道屏障破坏[15]。其次，DHM还能诱导ILC3s中IL-22的表达改善肠道屏障功能[31]。实验结果也表明了DHM可以恢复LPS介导的细胞连接蛋白E-cadherin、ZO-1水平降低，说明DHM可能通过调节细胞连接蛋白表达来改善肠道屏障，这也与本研究网络药理学预测结果一致。值得注意的是，之前的研究表明在少突胶质细胞中NOS3上调导致NOS信号失调，上调的NO可以破坏细胞间紧密连接和间隙连接，而加入NOS干预剂可以在一定程度上挽救这一现象[23]。由此推测NOS3在结肠炎中的上调通过调控NOS生成从而影响细胞间的连接蛋白。但是NOS3是否作为连接DHM与细胞间连接蛋白的关键靶点仍需要更多的研究验证。
综上所述，本研究阐明了DHM可能在改善肠道黏膜屏障、抗炎等方面发挥重要作用，揭示其潜在的作用靶点和信号通路。DHM可能通过多靶点、多种作用机制在IBD治疗中发挥重要作用，DHM在未来有望成为治疗IBD的药物。
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