系统中药学是基于系统科学的思路研究中药复杂系统的学科^[1]。系统科学通过研究复杂系统的要素、结构和功能间的关系，探讨各种复杂现象背后的规律和机制。中药是一个复杂系统，其作用的人体也是一个复杂系统，中药对人体的调节是两个复杂系统之间的相互作用，具有多成分、多靶点、整体调节的特点，通过长期深入总结中药与人体间的相互作用规律，得到了中药的具体功效。中药功效是系统中药学的核心，阐述中药功效、挖掘中药的功效标志物的关键在于从微观层面上挖掘中药功效成分并解释其对人体的调节作用^[2-3]。

早在东汉《神农本草经》中就已记载附子是毛茛科乌头的子根加工品，被称为“回阳救逆第一品”。附子是乌头属植物，主产于四川、湖北、湖南等地区^[4-5]。现代药理研究显示，附子主要成分包括二萜类生物碱以及多糖类、皂苷类、挥发油类等非生物碱，具有强心、改善心功能、抵抗心室重构和心脏损伤、调节心肌能量代谢紊乱和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）、抑制心肌细胞凋亡、保护心肌细胞和改变血流动力学等缓解心力衰竭的治疗作用^[6-8]，具体机制可能与激动α、β肾上腺素能受体^[9]，调控PI3K-Akt与Jak-STAT通路以改善心肌功能相关^[10]，这也是对附子“回阳救逆”功效的科学解释，但其强心作用主要成分及机制尚存争议。

本研究基于系统中药学研究附子回阳救逆功效，首先收集乌头属附子化学成分，并对其靶点（元素）进行挖掘，然后建立蛋白互作网络（结构），通过生物模块分析关键靶点的生物功能和参与的生物学过程来寻找附子回阳救逆功效与其他功效的边界，以“中药-成分-靶点-药理-功效”的模式，从系统中药学的元素、结构、边界、功能层面阐释附子回阳救逆的机制，挖掘附子回阳救逆的功效标志物。见图 1。

1 方法 1.1 中药附子成分的收集

以“附子”为关键词，通过中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）、中药高通量实验和参考指南数据库本草组鉴（HERB）等中药化学成分数据库查询附子主要活性成分，结合文献查询补充附子发挥回阳救逆功效的成分，再通过有机小分子生物活性数据库PubChem得到其2D结构，将其上传到SwissADME数据库，并依据胃肠道吸收（GI）的得分为“High”和类药性（DL）至少通过2个“Yes”为进一步筛选的指标^[11]，得到附子回阳救逆功效潜在成分库。

1.2 中药附子功效系统中元素的筛选

元素是构成系统的基本单元。本研究是通过靶点建立附子潜在功效成分与附子回阳救逆功效之间的联系，因此靶点是中药附子功效系统中的元素。将“1.1”中得到的附子回阳救逆功效潜在成分的2D结构上传至SwissTargetPrediction数据库，取置信度＞0的成分靶点为附子回阳救逆功效的潜在靶点。

1.3 中药附子功效系统中结构构建

系统的结构是元素之间关联方式的总和，就是元素间相互作用中形成的关系。中药附子功效系统的结构就是靶点间的相互作用，即蛋白互作网络。通过String11.0数据库获得蛋白互作数据，筛选置信度高于0.7^[12]的蛋白互作数据导入Cytoscape 3.6.1平台，应用Advanced network merge插件中的Union计算得到全集网络，去除网络中的孤立点、重复边、自环边，取最大连通子网为附子有效成分蛋白互作网络（PPIN）^[13]。

1.4 中药附子功效系统中功能的阐释

中药功效系统的核心是研究中药的整体功能，本研究从药理作用、功效2个层次上明确中药附子功效系统的功能。通过附子回阳救逆的蛋白互作网络得到关键靶点，结合文献挖掘成分对关键靶点的调节作用，明确靶点的生物功能和参与的生物学过程，明确靶点发挥的药理作用，再通过文献查询，确定靶点参与的药理作用与功效间的联系，阐释中药附子功效系统的功能。

1.5 附子回阳救逆功效标志物的发现

基于系统中药学挖掘附子回阳救逆的功效标志物就是寻找可以表征附子回阳救逆功效的代表性成分。中药附子功效系统的边界就是要明确附子回阳救逆功效与其他功效间的界限，系统边界是系统包含的功能与系统不包含的功能间的界限，因此附子回阳救逆关键靶点的生物功能及参与的生物过程即为系统边界，通过分析关键靶点的生物功能、参与的生物过程与附子回阳救逆药理作用间的联系，明确关键靶点，调节关键靶点的成分即为附子发挥回阳救逆的功效标志物。本研究通过Cytoscape 3.6.1平台中分子复合物检测法（MCODE）插件对“1.3”中得到的PPIN进行生物模块分析^[14]，设置模块参数K-Core为3；通过BinGO插件对模块中的靶点进行基因生物功能注释，再用Centiscape插件计算PPIN中度值（degree）和介数（betweennes）的平均值，将大于平均值的靶点与每个模块中得到的靶点取交集，进一步通过文献验证得到关键靶点。

2 结果 2.1 中药附子成分信息

通过TCMSP、HERB等中药与化学成分数据库查询附子主要活性成分，结合文献查询补充。经SwissADME数据库筛选和Swiss Target Prediction数据库靶点预测，最终确定潜在活性成分57个，作用靶点共295个，其成分信息见表 1。

2.2 中药附子功效系统中结构构建及功能的辨识

通过String11.0数据库将附子成分靶点进行蛋白互作分析，得到的PPIN包含239个节点和687条边，基于MCODE算法共识别出6个有效网络模块，通过Centiscape插件计算得到PPIN中degree的平均值为5.749 0，betweenness的平均值为679.949 8，其中degree，betweenness值均高于平均值的靶蛋白共32个，将这32个靶点与采用MCODE算法获取的生物网络功能模块中的靶点取交集，经文献验证分别获得各模块中的关键靶点。通过BinGo插件对关键靶点的生物功能和参与的生物过程进行分析，发现模块1中无关键靶点，结果见表 2。

2.3 附子回阳救逆的功效标志物

附子作为温阳类中药，在临床上应用广泛。《神农本草经》中提到“附子为回阳救逆之要药”。通过检索关键靶点的生物功能、参与的生物过程与附子回阳救逆药理作用间的联系，明确了附子具有正性肌力、抗心肌细胞凋亡、减轻缺血再灌注损伤、降血压、神经保护、抗氧化应激、减轻心力衰竭引起的肌少症等药理作用。

通过模块分析与靶点药理作用分析得到，附子成分主要通过6个模块、12个关键靶点发挥回阳救逆的功效。其中ADRB2、ADRA1B、CHRM1、HTR2C、KCNMA1参与G蛋白偶联受体蛋白信号通路和细胞内钾离子转运，发挥正性肌力、抗细胞凋亡、减轻缺血再灌注损伤和降血压的作用；LCK、JAK2、PIK3CA参与细胞程序性死亡的调控和细胞内蛋白激酶级联，发挥抗心肌凋亡的作用；CYP2D6、CNR1、MAOA参与氧化还原反应，发挥神经保护、抗氧化应激的作用；CYP19A1可参与类固醇合成，阻断雄激素转化为雌激素，干预心力衰竭引起的肌少症。

能够调节关键靶点的成分，经文献验证，即为附子发挥回阳救逆的功效标志物，研究结果表明附子回阳救逆的功效标志物为去甲乌药碱、次乌头原碱、多根乌头碱、查斯曼宁碱、去氢宋果灵、附子吡嗪B、去甲猪毛菜碱、一枝蒿丙素、苯甲酰次乌头原碱、宋果灵、和厚朴酚、异甘草素。具体过程见图 2。

3 讨论

功效是系统中药学的核心，本研究基于系统中药学研究附子回阳救逆功效，首先收集附子潜在活性成分，对其作用和靶点进行挖掘，然后建立蛋白互作网络，通过生物模块分析关键靶点的生物功能和参与的生物学过程来寻找附子回阳救逆的功效标志物，从系统中药学的元素、结构、边界、功能层面明确附子回阳救逆功效与其他功效的边界，阐释附子回阳救逆的机制，挖掘附子回阳救逆的功效标志物。

模块1关键蛋白主要参与G蛋白偶联受体蛋白信号通路，ADRB2、ADRA1B参与G蛋白信号传导与cAMP核苷酸第二信使偶联。β2受体被激活后通过Gs蛋白激活腺苷酸环化酶，使cAMP生成增加，cAMP通过激活蛋白激酶A，使RYR2的释放Ga²⁺通道过度磷酸化促使肌浆网Ca²⁺释放，引起细胞收缩加强，进而舒张心血管^[23]。Liu等^[24]通过转染细胞系实验明确了去甲乌药碱通过β2受体介导使心肌细胞增强K⁺分泌和Na⁺吸收，再通过钠、钙离子的交换机制，使细胞内Ca²⁺增多而发挥正性肌力作用。世界反兴奋剂机构（WADA）已经将去甲乌药碱列为β2受体激动剂^[25]。有研究通过虚拟筛选和双荧光素酶报告基因检测法和逐步正向分析-亲和色谱联用法发现次乌头原碱、多根乌头碱、查斯曼宁碱为β2受体激动剂^[26-27]。ADRA1B基因是指α1B-肾上腺素能受体。ADRA1B参与肾上腺素对心脏收缩力的正调节作用，压力感受器反馈对系统动脉血压的调节，Zhang等^[28]发现去甲乌药碱是一种新型的α1肾上腺素受体（α1-AR）拮抗剂，体外实验发现10 μmol/L去甲乌药碱可以降低正常血压、自发性高血压和去氧肾上腺素（PE）诱导的大鼠高血压模型的血压。WU等^[29]还发现去甲乌药碱能激活β2肾上腺素受体，抑制心肌细胞的凋亡，减轻心肌细胞缺血再灌注损伤。因此，去甲乌药碱可以通过调节血压和抗心肌细胞凋亡来发挥附子回阳救逆的作用。

模块2主要参与程序性细胞死亡的调控，JAK2主要参与细胞凋亡的调控，激活的JAK2能够磷酸化靶蛋白，进而激活STATs使其进入细胞核，调控特定基因的表达，影响细胞增殖、分化等细胞功能。基于附子转录组学研究提示附子水煎液激活Jak-STAT通路附子治疗急性心力衰竭的作用机制之一^[30]。去氢宋果灵和附子吡嗪B是附子中水溶性成分^[16]，可能通过激活Jak-STAT通路抑制心肌细胞凋亡发挥附子回阳救逆的作用。

模块3主要参与细胞内钾离子转运，KCNMA1编码大电导钾离子通道，主要分布在心血管系统和平滑肌组织，通过调节细胞内钾离子流动来调控细胞电位，参与神经递质释放和平滑肌收缩等生理过程。心力衰竭可能使心肌细胞钾离子通道功能异常，影响心肌细胞电位稳定性和肌肉收缩过程。和厚朴酚对高电导的转离子激活的钾离子通道蛋白基因KCNMA1有抑制作用，和厚朴酚能激活上皮细胞的质膜钙离子ATP酶，促使钠、钙离子交换，降低钙离子通道的活性，阻止肌浆网Ca²⁺离子的释放和Ca²⁺离子的内流^[31]。和厚朴酚可以改善心肌缺血再灌注损伤时心功能降低，拮抗再灌注早期的心律失常，机制可能与减少细胞内游离钙、减轻缺血再灌注损伤时钙超载有关^[32]。综上说明和厚朴酚通过作用于KCNMA1基因编码大电导钾离子通道来减少细胞内游离钙和钙超载发挥回阳救逆功效。

模块4主要参与类固醇合成过程，芳香化酶（CYP19A1）是一种位于内质网上的酶，主要存在于肾上腺、卵巢、睾丸、和脂肪组织等部位，主要参与性激素代谢和合成。慢性心力衰竭的患者通常伴有肌少症，血清睾酮水平降低与心力衰竭患者心肌损伤、运动能力降低、病死率升高有关^[33]。睾酮通过周围组织包括脂肪、肝脏、肌肉中的CYP19A1转化为雌激素，CYP19A1是其转化的关键基因^[34]。黄酮类化合物异甘草素能够抑制乳腺癌细胞MCF-7中芳香化酶的过表达^[35]，提示异甘草素可以作为芳香化酶抑制剂，阻断睾酮转化为雌激素。异甘草素作为芳香化酶抑制剂可以作用于CYP19A1基因，干预慢性心力衰竭患者的肌少症，从而辅助附子发挥回阳救逆的功效。

模块5主要参与细胞内蛋白激酶级联反应，PIK3CA是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）家族中的一个基因。PI3K是参与细胞信号传导的关键酶，其中PIK3CA通过催化磷脂酰肌醇二磷酸转化为磷脂酰肌醇三磷酸，从而激活Akt蛋白。基于附子转录组学与代谢组学研究提示附子水煎液激活PI3K/Akt通路是附子治疗急性心力衰竭的作用机制之一^[30]。研究证实，PI3K/Akt通路中的受体和激酶与心力衰竭有着密切联系，尤其在调控心肌细胞的凋亡与存活方面发挥着重要的作用^[36-38]，一枝蒿丙素、苯甲酰次乌头原碱均为水溶性生物碱^[16]，本研究推测其可能通过PI3K/Akt信号通路抗心肌凋亡发挥附子回阳救逆的功效。

模块6主要参与氧化还原反应，心力衰竭发展过程中存在持续性的氧化应激反应。MAOA主要参与多巴胺分解代谢过程，认知障碍是心力衰竭一个常见的合并症，其机制尚未得到充分的解释，主要概括为神经炎症和氧化应激^[39]。去甲猪毛菜碱可改变中枢神经系统中多巴胺能神经元的功能，其作用24 h能够挽救H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞死亡，降低其活性氧水平和半胱天冬酶活性，说明去甲猪毛菜碱可以通过抑制氧化应激损伤实现神经保护的目的^[16]。CNR1主要参与一氧化氮合酶（NOS）活性的负调控，有研究表明附子水提取液可以通过降低NOS抑制小鼠心脏NO含量，减轻小鼠心脏的氧化应激程度^[40]，保护心脏组织，这与本研究推测附子水溶性成分附子吡嗪B通过作用于CNR1调控NOS，从而达到抗氧化应激的作用发挥回阳救逆功效相一致。CYP2D6是细胞色素P450家族的一员，主要参与药物代谢过程。细胞色素P450（CYP）在心力衰竭的发病、进展和预后中发挥重要作用。实验证据表明花生四烯酸及其代谢物参与心力衰竭的多种病理过程，包括脂质代谢、炎症反应、氧化应激和心肌细胞凋亡^[41-42]，附子调节机体内源性代谢产物的分子作用机制研究中通过作用于CYP450影响花生四烯酸代谢等途径，调节机体能量代谢，从而发挥治疗心力衰竭作用^[43]。这与本研究推测宋果灵通过作用于CYP2D6调节氧化应激发挥回阳救逆功效相一致。

综合上述分析，次乌头原碱、多根乌头碱、查斯曼宁碱、去甲乌药碱、去氢宋果灵、附子吡嗪B、一枝蒿丙素、苯甲酰次乌头原碱、去甲猪毛菜碱、宋果灵、和厚朴酚、异甘草素为附子发挥回阳救逆的功效标志物，现有研究可佐证筛选出的功效成分，可为附子的质量控制与药物研发提供新的思路与方法。