文章信息
- 郑婧, 任水明, 高倩, 等.
- ZHENG Jing, REN Shuiming, GAO Qian, et al.
- 白芍总苷对慢性免疫性血小板减少症的作用机制
- The mechanism of total glucosides of paeony on chronic immune thrombocytopenia
- 天津中医药, 2025, 42(1): 84-89
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(1): 84-89
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.01.16
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文章历史
- 收稿日期: 2024-08-20
免疫性血小板减少症(ITP)是一种以出血及血小板减少的免疫性疾病。流行病数据显示:ITP全球发病率为3.3~8/10万人,亚洲地区高于欧美,女性高于男性[1]。ITP患者临床可表现为牙龈出血、瘀斑等,且随着疾病进展可累及肝脾,导致脾脏肿大及损伤等[2]。现阶段,ITP患者常采用糖皮质激素、免疫调节制剂等,可有效增加血小板数量但停药后复发率较高,不良反应较大,故现阶段临床多推荐传统中医治疗[3]。中医将ITP归属为“血证”“紫癜”的范畴,并认为病机为多种原因所致的气虚、营卫失调之证,故应采用益气固表、调和营卫,标本兼治。白芍总苷(TGP)是主要存在于中药白芍中的天然化合物,主要含芍药苷(PF)、芍药内酯苷(AF)等多种单萜糖苷类化合物[4]。现代药理学表明,TGP具有抗炎、免疫调节、保肝镇痛、抗氧化应激等多种作用。现阶段,已经有学者发现TGP可以用于ITP患者临床治疗,认为其可以对自身免疫多个环节具有调节作用,可以抑制CD4+T细胞计数,增加CD8+T细胞计数,并抑制辅助型T细胞功能进而提高患者临床疗效[5]。但具体研究机制还不清楚,因此,文章通过建立ITP小鼠模型,探讨TGP对其的作用机制,为相关研究提供有力依据。
1 材料与方法 1.1 动物来源无特定病原体(SPF)级BALB/C小鼠60只,体质量24~28 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:(京)2022-0011。于本院动物实验室饲养,温度:23~25 °、湿度:50%~60%自由进食及饮水,所有小鼠适应7 d后进行实验。符合鄂尔多斯市中心医院伦理审批(审批号:2022-0120)。
1.2 药物、主要试剂与仪器白芍总苷胶囊(宁波立华制药有限公司,国药准字H20055058);醋酸泼尼松(天津信谊津津药业有限公司,国药准字H310 20675);戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司,国药准字H31021725);磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25%胰酶(HyClone公司,货号:SH30256.01、SH30042.01);苏木精-伊红(HE)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号:G1120);白细胞介素(IL)-17,IL-10、转化生长因子(TGF)-β1酶链免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(上海酶研生物公司,货号EK-M27857、EKM25932、EK-M29282);FITC-CD4、Percp-CD25、PEFOXP3、Alexa Fluor R 647-IL-17流式抗体(Biolegend公司,货号100405、102027、320014、517006);小鼠抗小鼠CD41单克隆抗体(美国abcam公司,货号:ab33661);淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司,货号:P8370)TDZ4-WS型低速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);DxFLEX流式细胞仪(陕西科仪科技有限公司);Multiskan FC酶标仪(北京旭亚科技有限公司)。
1.3 实验分组、动物模型建立及干预方法60只小鼠按照随机数字方法分为对照组、模型组、TGP低剂量组、TGP中剂量组、TGP高剂量组及西药组,每组10只。将CD41单克隆抗体采用1×PBS稀释成2 μg/200 μL的MWReg30单抗磷酸盐溶液,4 ℃保存。参考文献[6]采用被动免疫法建立ITP动物模型,除对照组外均建立ITP动物模型,具体方法:小鼠腹腔注射含有2 μg的MWReg30单抗的PBS 200 μL,连续注射21 d,对照组同样的方法注射200 μL生理盐水,末次注射后采用全自动五分类血液分析仪(MINDRAY BC-5300Vet)进行血常规检测,当血小板计数降低为正常值的一半以下为建模成功。模型组及TGP中剂量组均有1只小鼠建模失败,其余小鼠均建模成功。建模成功后24 h,TGP低剂量组、TGP中剂量组、TGP高剂量组分别灌胃100 mg/kg、200 g/kg及400 mg/kg的TGP溶液,西药组灌胃5 mg/kg的醋酸泼尼松,对照组及模型组灌胃等体积的生理盐水,每日1次,连续灌胃4周。
1.4 外周血小板计数建模前、干预后1周、干预后2周、干预后3周及干预后4周分别取小鼠尾部静脉血0.5 mL,采用日本东亚Sysmex公司生产的XT-1800i型全自动血细胞计数仪检测血小板计数,按照仪器说明书进行。
1.5 流式细胞仪检测辅助性T细胞17(Th17)、全称调节性T细胞(Teg)各组小鼠尾部取静脉血1 mL,加入0.2%肝素抗凝后采用等体积的PBS稀释,加入淋巴细胞分离液,2 000 r/min离心30 min(离心半径10 cm),取中层经PBS冲洗得到单个核细胞悬液,调整为2×103个/mL,置入离心管中,100 μL/管。每个离心管中加入10 μL FITC-CD4、10 μL Percp-CD25染色20 min洗涤后固定孵育20 min,加入10 μL PE-FOXP3染色20 min,洗涤后上机检测,借助FlowJoV10软件分析Treg;离心管中加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA,100 ng/mL)及Ionomycin(1 μg/mL)孵育60 min,加入布雷菲德菌素A(BFA,10 μg/L)孵育60 min,加入10 μL FITC-CD4染色20 min,洗涤后孵育20 min,加入AlexaFluorR647-IL-17孵育30 min,洗涤后上机检测,借助FlowJoV10软件分析Th17。
1.6 酶联免疫检测仪检测Treg、Th17相关因子取尾部静脉血200 μL,静止2 h,3 500 r/min离心10 min(离心半径12 cm),保留上清液,按照试剂盒说明书进行操作,将酶联免疫吸附法(ELISA)板置于酶标仪中在450 nm波长处检测IL-17、IL-10、TGF-β1吸光度,采用SoftMaxPro软件分析表达水平。
1.7 HE染色及脏器指数各组小鼠按照颈部脱臼方法处死,提取肝组织及脾组织,甲醛固定后进行石蜡包埋后进行5 μm切片,脱蜡后采用95 %的乙醇脱水,切片先放入苏木精染色10 min后小流量自来水冲洗,1 %的盐酸乙醇褪色变红后停止操作,采用碳酸锂浸泡2 min后采用1%伊红复染后,逐级透水。光学显微镜下观察病理形态,并计算脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)。
1.8 统计学方法采用SPSS.26统计学软件分析,GraphPad Prism 8软件绘图,数据符合正态分布,以均数±标准差(x±s)表示,多组间进行单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,不同时间点组间比较采用重复测量方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠不同时间血小板计数比较模型建立前,各组小鼠血小板计数比较,差异无统计学意义(P>0.05);建模24 h及干预1周,与对照组相比,其余各组小鼠血小板计数均降低(P<0.05),但组间比较差异无统计学意义(P>0.05);干预2周、3周及4周时,与对照组相比,模型组血小板计数降低(P<0.05),与模型组相比,TGP低、中、高剂量组及西药组血小板计数升高(P<0.05),TGP低、中、高剂量组及西药组组间比较血小板计数逐渐升高,存在差异(P<0.05)。见表 1。
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与对照组相比,模型组小鼠外周血Treg百分比降低,Th17百分比升高(P<0.05);与模型组相比,TGP低、中、高剂量组及西药组Treg百分比升高,Th17百分比降低(P<0.05);且TGP低、中、高剂量组组间比较Treg百分比逐渐升高,Th17百分比逐渐降低,比较存在差异(P<0.05),但TGP高剂量组与西药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2,图 1和图 2。
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图 1 各组小鼠外周血Treg百分比比较 Fig. 1 Comparison of Treg percentage in peripheral blood of mice in each group |
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图 2 各组小鼠外周血Th17百分比比较 Fig. 2 Comparison of Th17 percentage in peripheral blood of mice in each group |
与对照组相比,模型组小鼠外周血IL-10、TGF-β1降低,IL-17升高(P<0.05);与模型组相比,TGP低、中、高剂量组及西药组IL-10、TGF-β1升高,IL-17降低(P<0.05);IL-17在TGP低、中、高剂量组组间比较差异有统计学意义(P<0.05),TGF-β1在TGP低、中、高剂量组、西药组组间比较无差异(P>0.05),IL-17在TGP高剂量组与西药组比较无差异(P>0.05)。见表 3。
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肝组织:对照组肝细胞形态正态,结构清晰无明显病理改变;模型组肝细胞严重空泡化,且细胞核坏死,边界模糊可见明显炎症浸润;TGP低剂量组及TGP中剂量组肝细胞空泡化改善,可见肝细胞具有融合现象;TGP高剂量组肝细胞轻度空泡化,炎症细胞显著减轻,肝细胞形态趋于正常;西药组:肝细胞空泡化不显著,间隙较大,炎症浸润不明显。见图 3。
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图 3 各组小鼠肝组织病理形态比较(HE染色,×400) Fig. 3 Comparison of pathological morphology of liver tissue of mice in each group(HE staining, ×400) |
脾组织:对照组红白髓间隙清晰,且动脉结构完好;模型组脾小体形态不规则,红髓显著充血且炎症浸润明显;与模型组相比,TGP低剂量组及TGP中剂量组红白髓边界相对模糊,炎症浸润改善;TGP高剂量组及西药组脾小体数量增多,脾索结构清晰,炎症因子较少分布。见图 4。
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图 4 各组小鼠脾组织病理形态比较(HE染色,×200) Fig. 4 Comparison of pathological morphology of spleen tissue of mice in each group(HE staining, ×200) |
与对照组相比,模型组小鼠肝指数及脾指数升高(P<0.05);与模型组相比,TGP低、中、高剂量组及西药组肝指数及脾指数降低(P<0.05);肝指数及脾指数TGP低、中、高剂量组组间比较差异有统计学意义(P<0.05),但TGP高剂量组与西药组比较无差异(P>0.05)。见表 4。
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ITP是以血小板减少和免疫系统异常为特征的疾病,儿童及中老年女性为发病主体,西医临床疗效较显著,但随着中医的快速发展在其治疗中发挥重要作用。TGP是一种中药成分,被广泛应用于治疗各种免疫性疾病,且已经被证实可用于ITP患者的临床治疗,且效果显著,但具体机制还不清楚,故该研究探讨TGP对ITP的作用机制,以期为该疾病的治疗提供新的思路和方法。
ITP中医发病机制为营卫不和,卫外不固,外邪侵袭肌表,郁于肌肤[7]。故辨证治疗以益气固表、调和营卫,标本兼治。中医认为肝主藏血,脾主统血,而ITP发病多为肝脾虚损,不司藏血、统血之职所致,故临床治疗应寻遵循治肝脾原则[8]。文章研究结果显示:与模型组相比,不同剂量TGP组的小鼠血小板计数升高,同时HE染色发现肝组织及脾组织病理形态均有所改善,而肝指数及脾指数均有所降低,故认为TGP可发挥治疗作用。现代药理研究表明,ITP发病机制主要在于血小板功能障碍,主要体现在血小板破坏增加生成减少,原因在于血小板特异性抗体的产生,这些抗体会结合到血小板表面的受体上,形成免疫复合物,可进一步被巨噬细胞识别并破坏,导致血小板减少[9]。文章认为ITP产生可增加肝指数及脾指数,这是在ITP中脾脏对血小板的清除过程异常增加,降低血小板计数,增加脾脏指数。肝脏主要对血小板的生成、储存和释放地发挥作用,而ITP患者免疫系统异常激活可能导致对肝组织的攻击,引发肝脏炎症和损伤,降低血小板的生成。白芍为毛茛科植物芍药的干燥根,是集养血、益气、通络为一体的中草药,是中医常见的治疗自身免疫疾病的药物[10]。白芍中主要活性成分包含但不限于芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷等,统称为TGP。TGP可用于ITP临床治疗,有研究表明,TGP可恢复Th1/Th2平衡,减少细胞因子IL-1及IL-4表达而增加B淋巴细胞活性降低血小板抗体的功能,进而减少血小板的破坏增加血小板计数[11]。有研究表明,TGP可减少关节炎大鼠炎症的同时可减少胸腺指数及脾脏指数,进一步调节异常免疫功能[12]。文章认为TGP可调理肝脾,改善津液受损、阴血不足,可发挥健脾益气的作用,进而通过调节肝脾而减少ITP血小板减少症状。
笔者研究结果显示:与模型组相比,不同剂量TGP组的小鼠Treg百分比升高,Th17百分比降低,同时检测相关细胞因子水平发现,TGP组小鼠的IL-10、TGF-β1升高,IL-17降低,说明TGP可通过维持机体免疫平衡而改善疾病。ITP发病机制较为复杂,是体液免疫及细胞免疫共同导致的结果,而Th17/Treg失衡已被证实与ITP的发生有关[13-14]。Treg是一类特殊的CD4+T细胞,主要分为自然性Treg及适应性Treg两种,而IL-10及TGF-β1是主要的细胞因子,而当Treg缺乏时可导致多种自身免疫性疾病的发生[15]。Th17是CD+T细胞一种新的类型,其表达异常可参与恶性肿瘤、免疫疾病等的进展,而IL-17是其相关细胞因子,其异常升高参与自身免疫紊乱,进一步促进ITP疾病的发生发展[16]。中医角度认为免疫异常与营卫失调的病理机制相吻合,异常的自身免疫反应是ITP疾病的本质,也是“营卫失调”产生的根源[17]。白芍治营弱,调和营卫,并可以统称人体气血、阴阳、脾胃的协调,进而提高免疫功能,逐步提高患者愈病能力[18]。有研究表明,在ITP小鼠中存在Th17/Treg紊乱,表现为Th17占比升高,而Treg占比降低,并通过降低Th17,升高Treg,实现免疫平衡而实现提高血小板水平[19]。在银屑病血虚证患者采用TGP可调节Th17 /Treg细胞失衡,降低IL-17表达而提高IL-10水平,并对细胞抗原呈递过程进行抑制,减轻炎性反应[20]。故笔者发现TGP可能通过调和营卫益气固表,改善Th17/Treg功能而发挥治疗ITP疾病的作用。
综上所述,TGP可改善慢性ITP小鼠免疫功能,提高血小板计数,减少肝脾损伤。
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