2025, Vol. 42文章信息
- 谭培艺, 田光, 欧阳慧子, 等.
- TAN Peiyi, TIAN Guang, OUYANG Huizi, et al.
- 基于网络药理学的中药复方醒脑治瘫胶囊治疗气虚血瘀型中风的作用机制研究与实验验证
- Study on the mechanism of action of traditional Chinese medicine Xingnao Zhitan Capsule in the treatment of blood stasis due to qi deficiency type of stroke based on network pharmacology and experimental validation
- 天津中医药, 2025, 42(1): 90-99
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(1): 90-99
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.01.17
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文章历史
- 收稿日期: 2024-08-14
2. 国家中医针灸临床医学研究中心, 天津 300381
脑卒中是人类致死、致残的重大疾病之一。中国脑卒中的发病率逐年上升，目前已成为中国第一位死亡原因[1]。缺血性脑卒中是最常见的卒中类型，占中国脑卒中的79.6%~87.8%，且复发率高，严重影响人类健康和生活[2]。中医学对中风病有着两千多年的诊治经验和深刻的理论认识，在《黄帝内经》中就有关于中风症状的详细记载。历代医者从自身行医经验中总结中风病的病因机制。现代中医理论认为，缺血性脑卒中主要病机之一在于气虚血瘀，气虚为本，血瘀为标，因气虚推动无力，瘀血内停，瘀阻络脉，窍闭神匿，神不导气，而出现半身不遂、口眼歪斜、语言不利等中风病症状。国医大师石学敏院士为代表的多位专家名医总结现代病例救治经验，在经典方剂补阳还五汤基础上进行加减，创立天津中医药大学第一附属医院特色院内制剂“醒脑治瘫胶囊（批准文号：津药制字Z20070769）”，用于治疗气虚血瘀型中风患者，多年来享有盛名。方中重用黄芪补气，大气一转，气旺血行，瘀去络通，为君药。黄芪补益中焦脾气，又助脾胃运化，气血生化有源，输布水谷精微濡养周身；黄芪主升，助脾散精，清阳上行，机窍灵动；黄芪又可生津止渴，滋阴润燥治内热消渴。臣药当归长于补血活血，与黄芪配伍可补气而生血，又可活血通络不伤血。赤芍、川芎、桃仁、红花助当归以祛瘀活血，共为佐药。全蝎、水蛭、土鳖虫，增加了活血通络之功效，又增添了远志和石菖蒲，起到开窍醒脑的作用。诸药合用，共奏补气活血通络之功。在笔者医院几十年对脑卒中患者的治疗过程中，醒脑治瘫胶囊发挥了重要的作用，帮助广大患者摆脱疾病困扰，提高生活质量。
虽然醒脑治瘫胶囊的临床疗效突出，但是对其系统药理机制研究相对匮乏，仍停留在单独几味药材或药对治疗脑卒中的药理机制研究，缺乏系统性强的药理作用机制研究。中药含有多种有效成分、这些成分又通过多重机制作用于多个靶点。简单验证中药复方个别药材的药理机制难免挂一漏万。近些年，网络药理学的迅速发展为解决中药复方多重机制的研究提供了新方法。文章综合应用网络药理学手段和分子对接技术对醒脑治瘫胶囊治疗气虚血瘀型中风病的潜在靶点和网络机制进行研究。
1 实验材料和方法 1.1 醒脑治瘫胶囊活性成分及靶点筛选首先以丹参、黄芪、桃仁、土鳖虫、石菖蒲、制远志、红花、川芎、牛黄、当归、赤芍等药材名为关键词检索TCMSP数据库（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）中各药材对应的化学成分及其相关靶点，检索筛选标准为口服生物利用度≥30%（OB），类药性≥0.18（DL）。其次，对在TCMSP数据库中未检索到化学成分的药材使用TCM-ID数据库[3]（https://www.bidd.group/TCMID/index.html）进行进一步检索，或查阅相关药材参考文献报道的化学成分进行补充。将补充的化学成分再一次输入TCMSP数据库，按照上述筛选标准保留适当化学成分及其对应的疾病靶点。使用UniProt数据库（https://uniprot.org/）校正检索得到的靶点名称为官方通用基因名（Gene Symbol），实现靶点信息标准化。
1.2 气虚血瘀型中风病相关靶点的查找及药物-疾病交集靶点的获取气虚血瘀型中风的临床症状与缺血性卒中（ischemic stroke）非常相似，文献常以缺血性卒中动物模型模拟气虚血瘀型中风[4]。因此，本文以“ischemic stroke”为关键词代替气虚血瘀型中风在数据库DrugBank[5]，OMIM[6]，GeneCards[7]，TTD[8]，DisGeNET数据库中进行疾病相关基因查找。同时在PubMed和CNKI进行文献检索获取疾病相关基因。将各数据库和文献检索得到的靶点基因名称取并集获得气虚血瘀型中风病相关基因。使用Venn图在线绘制工具[9]，对上一步检索数据库得到的醒脑治瘫胶囊预测靶点与气虚血瘀型中风病相关靶点取交集，获得醒脑治瘫胶囊-气虚血瘀型中风病相关潜在靶点。
1.3 中药活性成分调控疾病相关靶点的网络构建将醒脑治瘫胶囊活性成分与气虚血瘀型中风病潜在靶点导入Cytoscape 3.9.1软件中，绘制“醒脑治瘫胶囊药材-活性成分-气虚血瘀型中风病潜在靶点”网络并进行统计分析，得出节点数（Nodes）、边数（Edges）、联结度值（Degree）。
1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建将1.2项获得醒脑治瘫胶囊活性成分与气虚血瘀型中风病潜在靶点输入到STRING数据库（https://stringdb.org/），将物种设置为“Homo sapiens”，相互作用阈值设为0.9（高相关性），生成PPI网络。
1.5 基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析使用DAVID数据库对1.2项得到的醒脑治瘫胶囊活性成分与气虚血瘀型中风病潜在靶点进行GO和KEGG富集分析，将物种设置为“Homo sapiens”，认为P<0.001时具有统计学意义。
1.6 关键活性成分与核心靶蛋白的分子对接验证利用Open Babel 2.3.2软件[10]将从TCMSP数据库下载的化合物mol2格式文件转化为PDBQT格式，在此过程中完成加氢、加电荷操作。从PDB数据库（http://www.rcsb.org/pdb）获得关键靶点的蛋白质X-射线晶体结构的PDB格式文件。对于PDB数据库中未收录的蛋白分子，使用AlphaFold数据库预测该蛋白的模型[11-12]，并下载相应的PDB格式文件用于后续分子对接。使用PyMOL（https://pymol.org/）软件对蛋白PDB文件进行去除水分子和小分子配体的操作。使用AutoDockTools 1.5.6[13]把拟对接的蛋白PDB文件转化为PDBQT格式，同时逐一确定各靶点对接盒子的中心坐标与体积大小。利用AutoDock Vina 1.1.2软件[13]完成小分子与靶点蛋白的分子对接。以分子对接构象的结合能（kcal/mol）进行排序，使用Discovery Studio Visualizer软件完成分子对接得到的低能构象与相应靶点进行分子间相互作用模式分析。
1.7 SH-SY5Y细胞的培养、分组及氧糖剥夺/复糖复氧（OGD/R）模型的建立复苏SH-SY5Y细胞后，加入含10%胎牛血清、1%青/链霉素混合液的DMEM高糖培养基在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中进行培养。当细胞覆盖瓶底面积达80%时，弃去培养液，磷酸盐缓冲溶液（PBS）荡洗2次后，加入浓度为0.25%的胰蛋白酶液消化、离心、吸去上清液，加入培养基重悬后接种于96孔培养板中初始浓度为5×104个/mL或6孔培养板中初始浓度为1×106个/mL。在倒置显微镜下观察细胞生长状态良好方可进行后续实验。取对数生长期的SH-SY5Y细胞，随机分为正常组、OGD/R组、醒脑治瘫胶囊高剂量组、醒脑治瘫胶囊低剂量组、依达拉奉组。除正常对照组外，其余各组加入含终浓度为15 mmol/L Na2S2O4的无糖Earle’s液处理，然后放入含37 ℃，5% CO2培养箱中培养，氧糖剥夺1.5 h后，将各给药组含终浓度为15 mmol/L Na2S2O4的无糖Earle’s液更换为给予醒脑治瘫胶囊高剂量和低剂量组（80、20 μg/mL）、依达拉奉（20 μg/mL）的含药培养液放入37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h后即建立OGD/R细胞模型，用于后续实验。
1.8 CCK-8法检测细胞存活率分别于96孔板每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h后，用全自动酶标仪在450 nm处检测细胞存活率，实验重复3次。细胞存活率（%）=实验组A450 nm/正常对照组A450 nm×100%，A为吸光度。
1.9 细胞乳酸LDH释放检测分别于6孔板中收集细胞上清液。另取96孔板，在其中加入细胞上清液及LDH试剂，混匀，室温静置5 min后，在全自动酶标仪中测450 nm处的光密度（OD）值，此为细胞上清液中LDH释放量。LDH释放率（%）=上清液OD值/（上清液OD值+细胞破膜液OD值）×100%。
1.10 RT-qPCR检测关键基因采用TRIzol法提取细胞内总RNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。然后以转录后的cDNA为模板，GADPH为内参，使用GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（TliRNaseH Plus）荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR扩增。反应体系为TB GreenPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus，2×）10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol /L）0.8 μL，cDNA 2 μL，无菌去离子水6.4 μL，总体积20 μL。引物序列如表 1所示。
蛋白表达细胞裂解液冰上裂解细胞，于4 ℃下，12 000 r/min离心5 min（离心半径为8 cm），取上清。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入5 ×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，加热煮沸5 min，使蛋白充分变性，冷却到室温后，蛋白样品加入SDS-PAGE胶加样孔内，100 V、90 min电泳。使用PVDF膜，转膜，随后用5%脱脂奶粉于室温下封闭1 h。加入PTGS2、PTGS1、HSP90-α抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜3次后加入二抗室温孵育1 h。ECL化学发光试剂盒显影，以目标蛋白与GADPH条带灰度的比值表示各蛋白的相对表达。
2 结果 2.1 醒脑治瘫胶囊活性成分及靶点筛选通过在数据库中查找到醒脑治瘫胶囊所含药材丹参，黄芪，桃仁，土鳖虫，石菖蒲，制远志，红花，川芎，牛黄，当归，赤芍的化学成分按照筛选条件进行检索筛选，得到符合筛选条件的化学成分133个，对应潜在靶点259个。
2.2 气虚血瘀型中风相关疾病靶点的查找及药物-疾病交集靶点的获取在多个疾病数据库中共检索到474个疾病靶点，其中醒脑治瘫胶囊与气虚血瘀型中风的交集潜在靶点共78个，绘制Venn图如图 1所示。
将上一步分析出的78个交集靶点以及这些靶点对应的醒脑治瘫胶囊的113个化学成分导入Cytoscape 3.9.1软件中，绘制“醒脑治瘫胶囊活性成分-气虚血瘀型中风潜在靶点”网络，如图 2所示。经软件统计分析得出该网络共有386个节点（Nodes）和2 486条边（Edges）。进一步计算关联度值（Degree）发现，关联度值最高的靶点是PTGS2，也就是环氧合酶2（Cyclooxygenase-2）；关联度最高的化学成分是槲皮素。表 2和表 3分别展示了部分靶点和小分子化合物信息。
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| 注：蓝色菱形：基因名；各色六边形：中药化学成分；圆形：药材名称拼音缩写分别是丹参（DS），黄芪（HQ），桃仁（TR），土鳖虫（TBC），石菖蒲（SCP），制远志（ZYY），红花（HH），川芎（CX），牛黄（NH），当归（DG），赤芍（CS），两种或两种以上药材含有的共有化学成分（XNZT）。 图 2 醒脑治瘫胶囊中化学成分与气虚血瘀型中风相关潜在靶点网络关系图 Fig. 2 Network diagram of the chemical composition of Xingnao Zhitan Capsules and the potential targets of blood stasis due to qi deficiency type of stroke disease |
将气虚血瘀型中风与醒脑治瘫胶囊活性成分对应交集靶点输入到STRING数据库得到PPI网络（图 3），共有78个节点，203个相互作用，平均联结度5.21。
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| 图 3 蛋白-蛋白相互作用网络图 Fig. 3 Protein-protein interaction network |
在进行GO分析时对气虚血瘀型中风与醒脑治瘫胶囊化学成分对应的交叉基因分别进行了生物过程（Biological Process）、细胞组分（Cellular Component）、分子功能（Molecular function）3个方面分析。生物过程分析得到569个相关条目，P<0.001的条目共158条，取排名前10的相关条目作图（图 4），主要包括炎症应答、基因表达正相调节、基因表达负相调节、LPS的细胞应答、TNF的细胞应答等生物过程。细胞组分分析得到60个相关条目，P<0.001的条目共17条，取排名前10的相关条目作图（图 4），主要包括胞外区域、内质网、质膜等。分子功能分析得到83个相关条目，P<0.001的条目共20条，取排名前10的相关条目作图（图 4），主要包括蛋白结合、酶结合、蛋白激酶结合、细胞因子活性、转录因子结合等。
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| 图 4 GO富集分析图 Fig. 4 GO enrichment |
通过KEGG通路富集分析显示，醒脑治瘫胶囊治疗气虚血瘀型中风的潜在作用靶点主要涉及140条信号通路，P<0.001的条目共93条，取排名前30的相关条目绘制气泡图，如图 5所示，脂质和动脉粥样硬化通路、糖基化终末产物-受体（AGE-RAGE）通路、白细胞介素-17（IL-17）通路、肿瘤坏死因子（TNF）通路、Toll样受体（TLR）通路、核因转录子（NF-κB）通路等。
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| 图 5 KEGG富集分析图 Fig. 5 KEGG enrichment |
本文以分子对接手段验证上述网络药理学分析结果，分别将表 2中的靶点与表 3中化学成分小分子进行两两分子对接研究，所得结果绘制热图，如图 6所示。在进行的全部80组对接实验中，结合能低于或等于-9.0 kcal/mol的有13组实验，占比为16.25%。图 7展示了4个代表性化合物与靶点的对接结合模式图。如图 7A所示，木犀草素苯环与β2-肾上腺素能受体（ADRB2）的PHE1193，PHE1289存在π-π相互作用；两个酚羟基分别与THR1110，ASP1113，VAL1114，SER1207，THR1118形成氢键作用，羰基与ASN1293形成氢键相互作用。如图 7B所示，槲皮素苯环与环氧合酶-2（PTGS2）的PRO153，LEU152，CYS47，CYS36形成π-烷基相互作用；羰基与TYR130形成氢键相互作用，5位酚羟基与GLY135形成氢键相互作用。如图 7C所示，黄芩素的苯环与M1受体（CHRM1）的TYR85和TYR404形成π-π相互作用；5位羟基与CYS178形成氢键相互作用。如图 7D所示，隐丹参酮苯环与环氧合酶-1（PTGS1）的HIS207形成π-π相互作用，羰基与GLN203形成氢键相互作用。
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| 图 6 关键化学成分与潜在靶点的分子对接结果打分示意图 Fig. 6 Hot map of molecular docking results of key chemical components with potential targets |
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| 注：图A，木犀草素（luteolin）与β2-肾上腺素能受体（ADRB2）；图B，槲皮素（quercetin）与环氧合酶-2（PTGS2）；图C，黄芩素（Baicalein）与M1受体（CHRM1）；图D，隐丹参酮（cryptotanshinone）与环氧合酶-1（PTGS1）。 图 7 4个代表性化合物与靶点的分子对接结合模式图 Fig. 7 Molecular docking binding model of four compounds to their targets |
如图 8所示，与正常对照组比较，OGD/R组细胞存活率显著降低（P<0.01）；与OGD/R组比较，高剂量和低剂量醒脑治瘫胶囊提取物组（20、80 μg/mL）和依达拉奉组（20 μg/mL）可使细胞存活率显著提高（P<0.01）。
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| 注：Normol，正常组；OGD/R，氧糖剥夺/复糖复氧组；XNZT-L，醒脑治瘫胶囊提取物低剂量组；XNZT-H，醒脑治瘫胶囊提取物高剂量组；YDLF，依达拉奉组；与正常组相比，#P<0.01；与OGD/R组相比，*P<0.01。 图 8 各组SH-SY5Y细胞存活率 Fig. 8 Survival rate of SH-SY5Y cells in each group |
如图 9所示，与正常对照组比较，OGD/R组细胞LDH释放显著升高（P<0.01）；与OGD/R组比较，高剂量和低剂量醒脑治瘫胶囊提取物组（20、80 μg/mL）和依达拉奉组（20 μg/mL）可使细胞存活率显著降低（P<0.01）。
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| 注：Normol，正常组；OGD/R，氧糖剥夺/复糖复氧组；XNZT-L，醒脑治瘫胶囊提取物低剂量组；XNZT-H，醒脑治瘫胶囊提取物高剂量组；YDLF，依达拉奉组；与正常组相比，#P<0.01；与OGD/R组相比，*P<0.01。 图 9 各组SH-SY5Y细胞LDH释放率 Fig. 9 Release rate of SH-SY5Y cells in each group |
如图 10所示，与正常对照组比较，各组NCOA2的基因无显著变化；OGD/R组的PTGS2、PTGS1和HSP90AA1基因显著升高（P<0.01）；与OGD/R组比较，高剂量和低剂量醒脑治瘫胶囊提取物组（20、80 μg/mL）可降低PTGS2、PTGS1和HSP90AA1基因表达（P<0.01）。
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| 注：Normol，正常组；OGD/R，氧糖剥夺/复糖复氧组；XNZT-L，醒脑治瘫胶囊提取物低剂量组；XNZT-H，醒脑治瘫胶囊提取物高剂量组；YDLF，依达拉奉组；与正常组相比，#P<0.01；与OGD/R组相比，*P<0.01。 图 10 各组SH-SY5Y细胞mRNA表达情况 Fig. 10 The mRNA expression level of SH-SY5Y cells in each group |
如图 11所示，与正常对照组比较，OGD/R组的PTGS2、PTGS1和HSP90α蛋白表达显著升高（P<0.01）；与OGD/R组比较，高剂量和低剂量醒脑治瘫胶囊提取物组（20、80 μg/mL）可显著降低PTGS2、PTGS1和HSP90α蛋白表达（P<0.01）。
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| 注：Normol，正常组；OGD/R，氧糖剥夺/复糖复氧组；XNZT-L，醒脑治瘫胶囊提取物低剂量组；XNZT-H，醒脑治瘫胶囊提取物高剂量组；YDLF，依达拉奉组；与正常组相比，#P<0.01；与OGD/R组相比，*P<0.01。 图 11 各组SH-SY5Y细胞蛋白表达情况 Fig. 11 Protein expression level of SH-SY5Y cells in each group |
槲皮素可与GPIIb/IIIa血小板受体结合，从而抑制钙离子载体的聚集促进特性，避免血小板衍生颗粒的增加；这些改善血液流变学，并减少C57BL/6大鼠由三氯化铁诱导的颈动脉损伤后的血栓形成[14]。槲皮素可下调TLR-NF-κB信号通路，降低COX、5-LOX、NOS、MPO和CRP的活性，抑制LDL诱导的黏附分子表达，并改善动脉粥样硬化的内皮功能障碍[15]。在1项临床试验中，口服槲皮素30和120 min后，血小板聚集被抑制，胶原蛋白刺激的血小板酪氨酸磷酸化也相应减少[16]。与I/R组相比，灌胃给药山柰酚100 mg/kg治疗可减少实验性脑缺血中风大鼠的梗塞体积和脑含水量，而山柰酚100 mg/kg治疗可改善脑缺血急性期的体质量和神经功能恢复[17]。最近的1项研究采用大鼠缺血性中风模型，通过短暂的大脑中动脉闭塞（MCAO）显示，使用100 mg/kg的山柰酚胃内给药7 d，能够抑制小胶质细胞的激活和TNF-α及白细胞介素如IL-6、IL-1β和IL-5的表达[18]。OGD诱导的PC-12细胞活力变化是一种公认的缺血性脑卒中体外研究细胞模型，文献报道10 μmol/L木犀草素（luteolin）可以浓度依赖地保护OGD诱导的PC-12细胞的活力[19]。石杉醇（Stigmasterol）通过抑制细胞凋亡，下调Bax和Caspase-3的表达，上调Bcl-Xl的表达起到减少氧化应激和炎症来降低脑卒中大鼠脑组织损伤程度[20]。黄芩苷（baicalein）通过抑制小胶质细胞TLR4/NF-κB途径和下调STAT1磷酸化起到抗炎作用间接改善了中风后神经元损伤[21]。大脑中动脉闭塞（MCAO）后3 d，小鼠腹腔注射常春藤皂苷元（Hederagenin），并对神经功能和脑梗死体积进行了评估，结果显示常春藤皂苷元通过减弱MLK3信号通路的激活减轻模型动物的细胞凋亡和梗塞区炎症细胞因子表达[22]。丹参酮IIA在缺血性脑中风的动物模型中展现出广泛的神经保护作用，集中体现在抗炎、抗氧化和减少兴奋性氨基酸毒性等方面[23]。
PTGS1基因和PTGS2基因表达的蛋白分别为环氧合酶-1（COX-1）和环氧合酶-2（COX-2），环氧合酶是花生四烯酸代谢通路的重要酶，催化花生四烯酸代谢生成血栓素A2，这与血栓形成密切相关。临床中广泛使用的抗血小板聚焦药物阿司匹林和吲哚布芬均是通过抑制环氧合酶减少血小板聚集进而实现抗栓作用。热休克蛋白90（HSP-90）作为一种分子伴侣蛋白与卒中同样密切相关。文献报道，抑制HSP90可以保护缺血性卒中小鼠的血脑屏障完整性[24]。由此可以推测，已经在笔者医院临床上广泛使用的醒脑治瘫胶囊很可能通过对PTGS1、PTGS2以及HSP90的调控起到对气虚血瘀型中风患者的治疗作用。
网络药理学是近些年发展起来的新兴交叉学科，为传统中医药作用机制研究提供了新的研究工具，但同时也存在着一些不足之处。比如疾病靶点数据库虽然数据众多，但其准确度和相关性还有一定局限。另一方面，各种中药化学成分数据库虽然收录了常见化学成分，但是这些成分在体内是否达到一定的血药浓度，还需要一些实验手段比如液相-质谱联用法进行验证。对于经过网络药理学分析得到的一些靶点，还需要在细胞层面或动物层面深入验证靶点功能改变情况。文章选择了缺血性卒中疾病研究常用的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）进行初步验证并证实了部分网络药理学分析结果。课题组将在其他细胞系比如小胶质细胞、海马神经元细胞等细胞系进一步验证网络药理学研究结果，为醒脑治瘫胶囊临床作用机制研究提供更有力的实验证据。
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2. National Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion Clinical Medical Research Center, Tianjin 300381, China