2025, Vol. 42文章信息
- 范晓旭, 刘双巧, 华姞安, 等.
- FAN Xiaoxu, LIU Shuangqiao, HUA Ji'an, et al.
- 基于TGF-β/Smad和Fas/FADD信号通路探讨白芍总苷减轻肝纤维化的作用机制
- The mechanism of action of total glycosides of paeony in attenuating liver fibrosis based on TGF-β/Smad and Fas/FADD signaling pathways
- 天津中医药, 2025, 42(10): 1285-1294
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(10): 1285-1294
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.10.12
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文章历史
- 收稿日期: 2025-05-27
引用本文 |
2. 川北医学院，南充 637100;
3. 新疆医科大学，乌鲁木齐 830011
白芍（Paeoniae Radix Alba，PRA）在中国已有上千年的临床应用历史，历代医家对其有着丰富的见解。成无己在《注解伤寒论》中多次提及“芍药之酸”可以“收敛津液而益荣”“扶阴”“收阴气”，认为芍药具有“扶阴益荣，敛津液”之效；而张山雷则认为白芍可以“补益肝脾真阴而收摄脾气之散乱、肝气之恣横”，具有补脾益肝、敛脾气、疏肝气之效，这与缪希雍白芍可以“收阴气，敛逆气，理中气”的观点不谋而合。《萃金裘本草述录》中则提到“阴虚阳亢者则用白芍，取其收阴和阳以补之”，表明白芍还具有收阴和阳的作用。根据这些医家的认识，医者们可以更好地理解白芍“养血敛阴、柔肝缓急、平抑肝阳”之效。现代药理研究发现白芍及其有效物质成分对多种肝脏疾病具有防治作用，如自身免疫性肝炎[1]、系统性红斑狼疮肝损伤[2]、药物性肝损伤[3-4]、非酒精性脂肪性肝病[5-6]。
多种慢性肝脏疾病必经的发展过程都有肝纤维化，这一阶段是扭转肝硬化或肝癌的关键阶段，对这一阶段实施有效的防治措施，有利于延缓病情发展。肝脏在遭受乙醇、药物、有毒化学物质或环境毒素等的刺激后，炎性细胞活化增殖并释放相关因子刺激肝星状细胞（HSC）的活化和增殖，并诱导其向成纤维细胞转化，大量分泌的细胞外基质（ECM）沉积（肝纤维化的重要病理标志），致使肝脏自身合成和降解能力失衡，而ECM沉积过多后逐渐形成纤维结缔组织，从而发展为纤维化。课题组前期研究表明，白芍有效物质成分白芍总苷（TGP）和白芍多糖（PRAP）对四氯化碳所致化学性肝损伤均有一定的保护作用，PRAP在一定程度上还能够延缓肝纤维化的进程，促进肝纤维化的恢复[7-10]。相关文献也报道TGP可以降低四氯化碳所致肝纤维化引起的Ⅲ型前胶原（PCⅢ）和透明质酸（HA）分泌，并可以促进活化的肝星状细胞凋亡[11]，但其深层次作用机制仍不清晰，需要进一步研究和探讨。
因此，本研究采用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导HSC-LX2细胞活化模型，观察TGP对HSC-LX2细胞活化、增殖和凋亡的影响，并深入探讨TGP抗纤维化的细胞分子机制，为白芍防治化学性肝损伤引起的肝纤维化疾病提供科学的实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞HSC-LX2细胞株，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0506，本实验室自行传代冻存备用。
1.1.2 药物及试剂白芍总苷（帕夫林），购于宁波利华制药有限公司，国药准字H20055058，生产货号：210602，完全培养基溶解后滤膜过滤待用。DMEM培养基（货号：SH30284.01），购于美国Hyclone公司。0.05%胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（货号：T4299）和二甲基亚砜（货号：C6295），购于美国Sigma-Aldrich公司。胎牛血清（货号：10099-141），购于美国Gibco公司。细胞活力检测试剂盒（CCK-8，货号：CK04），购于日本同仁化学研究所。细胞凋亡检测试剂盒（货号：KGA1026），购于江苏凯基生物技术股份有限公司。肿瘤坏死因子-α（TNF-α，货号：E-EL-H0109）、白细胞介素-1β（IL-1β，货号：E-EL-H0149）和环氧合酶2（COX2，货号：E-EL-H1846）酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒，购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。重组人转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白（货号：HZ-1011）、β-actin单克隆抗体（货号：66009-1-Ig）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体（货号：14395-1-AP）、Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）多克隆抗体（货号：14695-1-AP）、Ⅲ型胶原（COL-Ⅲ）多克隆抗体（货号：22734-1-AP）、基质金属蛋白酶1（MMP1）多克隆抗体（货号：10371-2-AP）、金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）多克隆抗体（货号：16644-1-AP）、Smad2多克隆抗体（货号：12570-1-AP）、Smad3单克隆抗体（货号：66516-1-Ig）、肿瘤坏死因子受体超家族成员6（Fas）多克隆抗体（货号：13098-1-AP）、Fas相关死亡域蛋白（FADD）多克隆抗体（货号：14906-1-AP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）多克隆抗体（货号：19677-1-AP）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）多克隆抗体（货号：13423-1-AP），购于武汉三鹰生物技术有限公司。TGF-β1多克隆抗体（货号：A2124），购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。HRP标记羊抗小鼠二抗（货号：BA1051）和HRP标记羊抗兔二抗（货号：BA1054），购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.1.3 仪器设备细胞培养瓶、细胞培养板、离心管，美国Corning公司；超净工作台，青岛海尔股份有限公司；酶标仪、二氧化碳培养箱，美国Thermo公司；水浴锅，上海博讯公司；组织细胞破碎仪，美国Sonics公司。电泳仪、Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统，BIO-RAD；成像系统，中国勤翔；CytoFLEX型流式细胞仪，美国Beckman公司。
1.2 细胞培养与处理HSC-LX2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养，于37℃、5% CO2的培养箱中孵育。采用10 ng/mL的TGF-β1造模药诱导48 h建立肝纤维化HSC-LX2细胞模型。将细胞分为空白、模型、TGP 125 μg/mL组、TGP 250 μg/mL组、TGP 500 μg/mL组，观察TGP对各指标的影响。
1.3 CCK-8法检测TGP对HSC-LX2细胞非活化及活化状态的影响按照5×103每孔的密度接种于96孔板中，摇匀后于37 ℃培养箱培养，24 h后进行给药操作。TGP对HSC-LX2细胞的影响：分为空白组及TGP不同浓度组（分别为62.5、125、250、500、1 000 μg/mL），每组3个复孔培养24 h和48 h后采用CCK-8法检测细胞活性。TGP对活化HSC-LX2细胞的影响：根据前一步骤结果，选取TGP 62.5、125、250、500 μg/mL 4个浓度组验证TGP对造模后HSC-LX2细胞活力的影响。共设置空白组、模型组、62.5 μg/mL组、125 μg/mL组、250 μg/mL组和500 μg/mL组，共6组，每组3个复孔培养24 h和48 h后采用CCK-8法检测细胞活性。细胞活性公式如下：细胞活力（%）=[（模型组OD值-空白孔OD值）/（空白组OD值-空白孔OD值）]× 100%。
1.4 流式细胞术检测TGP对HSC-LX2细胞凋亡率的影响按照1×106每孔的密度接种于6 cm培养皿中，24 h后给药处理。实验分组为空白组、模型组和TGP不同浓度组（125、250、500 μg/mL），每组3个复孔给药48 h。按照试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。
1.5 ELISA法检测TGP对HSC-LX2细胞COX2、IL-1β和TNF-α含量的影响采用ELISA法，按照试剂盒说明书检测细胞培养上清液中炎性因子COX2、IL-1β和TNF-α含量。
1.6 实时荧光定量PCR法检测TGP对TGF-β/Smad和Fas/FADD信号通路的mRNA表达的影响据“1.3”结果，选择125、250、500 μg/mL作为TGP干预浓度，并按“1.3”项下方法处理细胞并给药后48 h，弃上清，收集各组细胞，Trizol法提取总RNA，检测RNA浓度及纯度，然后反转录为cDNA。PCR扩增反应：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s、95 ℃延伸15 s，循环40次。以β-actin为内参，以2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表 1。
| 基因 | 引物 | 引物序列（5'-3'） |
| β-actin | 上游 | AGCGAGCATCCCCCAAAGTT |
| 下游 | GGGCACGAAGGCTCATCATT | |
| TGF-β1 | 上游 | CAGCAACAATTCCTGGCGATACCT |
| 下游 | CGCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT | |
| Smad2 | 上游 | TCTCTTGATGGTCGTCTC |
| 下游 | CTGTTAGGATCTCGGTGT | |
| Smad3 | 上游 | ACGACTACAGCCATTCCATCCC |
| 下游 | CATCTGGTGGTCACTGGTTTCTC | |
| Caspase-3 | 上游 | ACTGGACTGTGGCATTGAGA |
| 下游 | GCACAAAGCGACTGGATGAA | |
| Caspase-8 | 上游 | GAGGAGTTGTGTGGGGTAA |
| 下游 | CTCTTCAAAGGTCGTGGT | |
| FADD | 上游 | CTGGGGAAGAAGACCTGTGT |
| 下游 | TGCGTTCTCCTTCTCTGTGT | |
| Fas | 上游 | CCGGACCCAGAATACCAAGT |
| 下游 | GAAGACAAAGCCACCCCAAG |
据“1.3”结果，选择125、250、500 μg/mL作为TGP干预浓度，并按“1.3”项下方法处理细胞并给药后48 h，弃上清，收集各组细胞，提取总蛋白。制备蛋白样品，150 V 35 min快速电泳，400 mA 30 min湿转至PVDF膜。采用5 %脱脂奶粉室温摇床封闭PVDF膜2 h。一抗4 ℃过夜孵育，1×TBST洗膜3次。随后，二抗1∶10 000室温下摇床孵育1 h，1×TBST洗膜3次后采用化学发光法显影，以Image J软件分析各蛋白条带灰度值。
1.8 统计学方法使用IBM SPSS Statistics 20.0软件和GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析和绘图，符合正态分布的测量数据用均数±标准差（x±s）表示。使用单因素方差分析进行组间比较，当方差齐时，使用最小显著差法（LSD），当方差不齐时使用Dunnett’T3方法。以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 TGP对HSC-LX2细胞活力的影响在探索TGP对活化HSC-LX2细胞的作用前，笔者先研究了TGP对HSC-LX2细胞活力的影响。分别使用TGP 62.5、125、250、500、1 000 μg/mL作用于HSC-LX2细胞24 h和48 h。24 h后，TGP浓度为62.5、125、250、500 μg/mL时，TGP可以促进HSC-LX2细胞增殖（P < 0.05）；TGP浓度为1 000 μg/mL时，对细胞既无增殖作用亦无抑制作用（P > 0.05）。48 h后，TGP浓度为62.5 μg/mL时细胞活力增强，且具有统计学意义（P＜0.05），TGP浓度为125、250、500 μg/mL时，对细胞活力无影响（P > 0.05）。TGP浓度为1 000 μg/mL时，对细胞有明显抑制作用，且差异具有统计学意义（P < 0.05）。见图 1。
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| 注：与空白组比较，*P < 0.05。 图 1 TGP对HSC-LX2细胞活力的影响 Fig. 1 Effects of TGP on the viability of HSC-LX2 cells |
化学性肝损伤肝纤维化过程中会出现肝星状细胞的增殖，以10 ng/mL TGF-β1诱导HSC-LX2细胞活化增殖，并分别与TGP 62.5、125、250、500 μg/mL作用于活化HSC-LX2细胞24 h和48 h。TGP干预活化HSC-LX2细胞24 h：与空白组相比，模型组HSC-LX2细胞活化，细胞活力增强（P＜0.05）；与模型组相比，TGP浓度为62.5、125、250、500 μg/mL时，可以抑制活化HSC-LX2细胞的活力（P＜0.05）。TGP干预活化HSC-LX2细胞48 h：与空白组相比，模型组HSC-LX2细胞活化，细胞活力增强（P＜0.05）；与模型组相比，TGP浓度为125、250、500 μg/mL时，对活化HSC-LX2细胞活力有明显的抑制作用（P＜0.05）。见图 2。
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| 注：N，空白组；M，模型组。与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 2 TGP对活化HSC-LX2的细胞活力的影响 Fig. 2 Effects of TGP on cell viability of activated HSC-LX2 cells |
TGP诱导HSC-LX2细胞活化48 h后，与空白组相比，模型组HSC-LX2细胞凋亡率差异无统计学意义（P > 0.05）。与模型组相比，TGP 125、250、500 μg/mL组凋亡率显著升高（P＜0.001）。见图 3。综合2.2和2.3结果，笔者选择了125、250、500 μg/mL的TGP干预48 h用于后续研究。
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| 注：N，空白组；M，模型组；L-TGP，125 μg/mL TGP组；M-TGP，250 μg/mL TGP组；H-TGP，500 μg/mL TGP组。与模型组比较，###P＜0.001。 图 3 TGP对活化HSC-LX2细胞凋亡的影响 Fig. 3 Effects of TGP on apoptosis of activated HSC-LX2 cells |
与空白组相比，模型组HSC-LX2细胞COX2、IL-1β和TNF-α含量显著升高（P＜0.001）。相反，与模型组相比，125、250、500 μg/mL TGP组的以上指标均下降（P＜0.01或P＜0.001）。见图 4。
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| 注：N，空白组；M，模型组；L-TGP，125 μg/mL TGP组；M-TGP，250 μg/mL TGP组；H-TGP，500 μg/mL TGP组。与空白组比较，***P＜0.001；与模型组比较，##P＜0.01，###P＜0.001。 图 4 TGP对活化HSC-LX2细胞炎症反应的影响 Fig. 4 Effect of TGP on the inflammatory response of activated HSC-LX2 cells |
与空白组相比，模型组COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及α-SMA蛋白表达水平上升，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，TGP 250 μg/mL组COL-Ⅰ蛋白表达水平下降，TGP 500 μg/mL组COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及α-SMA蛋白表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；但TGP 125 μg/mL组COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及α-SMA蛋白表达水平，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 5。
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| 注：N，空白组；M，模型组；L-TGP，125 μg/mL TGP组；M-TGP，250 μg/mL TGP组；H-TGP，500 μg/mL TGP组。与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 5 TGP对活化HSC-LX2细胞COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及α-SMA蛋白表达的影响 Fig. 5 Effects of TGP on COL-Ⅰ, COL-Ⅲ, and α-SMA protein expression in activated HSC-LX2 cells |
与空白组相比，模型组TIMP1蛋白表达水平上升，MMP1蛋白表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，TGP 250 μg/mL组、500 μg/mL组TIMP1蛋白表达水平下降，MMP1蛋白表达水平上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）；但TGP 125 μg/mL组TIMP1和MMP1蛋白表达水平，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 6。
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| 注：N，空白组；M，模型组；L-TGP，125 μg/mL TGP组；M-TGP，250 μg/mL TGP组；H-TGP，500 μg/mL TGP组。与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 6 TGP对活化HSC-LX2细胞TIMP1和MMP1蛋白表达的影响 Fig. 6 Effect of TGP on TIMP1 and MMP1 protein expression in activated HSC-LX2 cells |
与空白组相比，模型组TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白表达上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，TGP 500 μg/mL组的TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表达水平均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，TGP 250 μg/mL组和500 μg/mL组的TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA表达水平均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图 7。
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| 注：N，空白组；M，模型组；L-TGP，125 μg/mL TGP组；M-TGP，250 μg/mL TGP组；H-TGP，500 μg/mL TGP组。与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 7 TGP对活化HSC-LX2细胞TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA及蛋白表达的影响 Fig. 7 Effects of TGP on TGF-β1, Smad2, Smad3 mRNA and protein expression in activated HSC-LX2 cells |
与空白组相比，模型组Fas、FADD、Caspase-8和Caspase-3 mRNA及蛋白表达量下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，TGP各浓度组Fas、FADD、Caspase-8和Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 8。
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| 注：N，空白组；M，模型组；L-TGP，125 μg/mL TGP组；M-TGP，250 μg/mL TGP组；H-TGP，500 μg/mL TGP组。与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。 图 8 TGP对活化HSC-LX2细胞Fas、FADD、Caspase-3、Caspase-8 mRNA及蛋白表达的影响 Fig. 8 Effect of TGP on Fas, FADD, Caspase-3, Caspase-8 mRNA and protein expression in activated HSC-LX2 cells |
TGF-β1诱导LX2细胞活化是肝纤维化研究中的经典细胞模型。LX2细胞是HSC的永生化细胞系，常用于模拟肝纤维化过程中HSC的活化状态[12]。与原代HSC相比，LX2细胞具有稳定性高、易于培养的特点。TGF-β1是肝纤维化的关键驱动因子，当肝损伤时肝细胞分泌TGF-β1，诱导HSC从静息状态向活化状态转化，是肝纤维化发生的中心环节[13]。
本研究选择了125、250、500 μg/mL的TGP干预48 h用于后续研究。结果显示，TGP干预活化HSC-LX2细胞48 h后，与模型组相比，125、250、500 μg/mL TGP对活化HSC-LX2细胞活力有明显的抑制作用，且125、250、500 μg/mL TGP对活化HSC-LX2细胞的凋亡率显著高于模型组。后续的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及α-SMA蛋白检测也证实了笔者浓度和时间选择上的合适性。α-SMA的表达是HSC活化的标志物，HSC激活的典型特征是ECM蛋白的过度沉积，包括胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ。笔者的结果显示，125、250、500 μg/mL的TGP降低了α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达，表明TGP对LX-2细胞产生了抗活化的作用。因此，笔者选择了125、250、500 μg/mL TGP干预48 h用于进一步实验。此外，有研究报道，60、120、240 μg/mL的TGP作用48 h时促进HSC凋亡[11]，这对本研究TGP给药浓度和时间的选择提供了参考。
肝纤维化是一种肝损伤反复发生时的伤口愈合反应，是数百万各种慢性肝病患者的常见病理表现[14-15]。肝纤维化的特征在于ECM因子如胶原和纤连蛋白在肝组织中的过度沉积。HSC负责产生大部分ECM，并且在肝纤维化中起核心作用。HSC在暴露于反复肝损伤时被激活并转化分化为肌纤维母细胞样细胞，并表现出增强的增殖、趋化性和胶原合成[16-17]。肝纤维化类似于细胞损伤修复过程中错误的胶原合成或瘢痕增生，如果不对这种过度的修复过程进行干预，可能会进一步发展为肝硬化或者肝癌[18-20]。笔者发现，TGP可以促进活化HSC-LX2细胞凋亡，降低HSC激活的病理学标志物与特异性分子标志物α-SMA的表达，抑制肝纤维化进程中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的分泌，这与文献报道TGP可以抗肝纤维化[11]的结论正好相符。ECM受到MMP和TIMP的共同调控，MMP在其中起到了分解ECM的作用，而TIMP则是起到抑制MMP活性的作用[21]。通过细胞实验发现TGP可以抑制TIMP1激活，促进MMP1表达，从而起到分解ECM的作用。以上验证均表明TGP具有促进活化HSC-LX2细胞凋亡和抑制肝纤维化的作用，但其深层次机制并不明确。因此，笔者还对TGP促凋亡和抗纤维化的机制作了更进一步的探索。
COX2、IL-1β和TNF-α参与了肝纤维化的形成和发展。COX2作为促炎介质，通过催化前列腺素E2（PGE2）合成，激活HSC转化为肌成纤维细胞，促进胶原分泌；而IL-1β和TNF-α作为关键促炎细胞因子，其水平升高通常反映肝内炎症微环境活跃。IL-1β和TNF-α与肝纤维化有直接关系。IL-1β和TNF-α通过与HSC表面IL-1R1和TNFR1/2结合，激活NF-κB、MAPK等信号通路，诱导HSC活化和ECM合成。此外，IL-1β、TNF-α可间接激活TGF-β通路。IL-1β和TNF-α可诱导TGF-β受体Ⅱ（TβRII）表达，提高HSC对TGF-β的敏感性，增强TGF-β的纤维化效应。因此，检测COX2、IL-1β和TNF-α含量在一定程度上可反映肝纤维化程度。
TGF-β/Smad信号传导在纤维化中起重要作用[22-26]。TGF-β可以调节多种细胞（如巨噬细胞、活化的T和B细胞、未成熟造血细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞）的增殖、分化、凋亡、黏附和迁移[27-28]。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3种亚型。TGF-β1可以影响细胞生长、凋亡和分化，增加ECM产生，维持成纤维细胞活力，抑制金属蛋白酶产生[29]。TGF-β/Smad级联反应则是由TGF-β1与转化生长因子β受体Ⅱ相互作用激活的3元信号复合物组成TGF-βRII磷酸化转化生长因子β受体I（TGFβRI），继而磷酸化细胞质介质Smad 2和/或Smad 3，并且与易位到细胞核中的Smad 4形成异源三聚体复合物，结合共有序列，并调节基因转录[24]。
实验发现，TGF-β1刺激HSC-LX2细胞活化增殖，检测到活化的肝星状细胞中Smad 2和Smad 3的蛋白表达含量增加，而TGP可以下调活化HSC-LX2细胞中TGF-β1的表达，从而起到抑制包括Smad 2和Smad 3在内的下游介质发挥其病理性效应的作用[24, 30]。以上表明TGP抗肝纤维化的机制可能是通过抑制TGF-β1的表达从而下调包括Smad 2和Smad 3在内的下游介质，以此实现抑制TIMP1激活，促进MMP1表达分解ECM的目的，从而起到影响活化HSC-LX2细胞的生长、增殖和分化的作用。
肝损伤肝纤维化进程中往往伴随着过度的组织修复，这种修复对恢复肝脏功能带来不利影响。因此，抑制这种组织细胞错误地增殖和诱导其凋亡就成了抑制肝纤维化的一种重要途径。在细胞凋亡的起始中首次描述的最突出的死亡结构域复合物之一是由跨膜受体Fas、胞质衔接蛋白FADD和Caspase-8形成，并且被称为Fas/FADD/Caspase-8死亡诱导信号传导复合物（DISC）[31]。Fas受体是一种典型的死亡受体，而具有死亡结构域的Fas相关蛋白（FADD）是支持Fas受体活性所需的关键衔接蛋白；Fas-FADD相互作用构成生物系统中最终诱导细胞凋亡或程序性细胞死亡的重要信号传导途径[32]。Fas配体（Fas L）与Fas共同激活其死亡结构域和下游蛋白FADD，并在释放Caspase-8前体后与细胞质中的FADD联合以激活Caspase-8，从而促使Caspase-3蛋白的再激活并诱导凋亡程序[33]。
肝损伤的特征是肝细胞凋亡和HSC活化。Fas/FADD凋亡通路在肝纤维化的发生发展中起关键作用。该通路与TGF-β/Smad通路协同发挥抗纤维化作用。Fas诱导的肝细胞凋亡可上调TGF-β1前体表达，增强TGF-β信号；FADD可与Smad 3直接结合，促进Smad 3核转位，增强TGF-β/Smad通路介导的胶原合成。抑制肝细胞凋亡的药物可能通过阻断肝细胞凋亡来减轻肝损伤和肝纤维化，或通过促进HSC活化来加重肝纤维化。有研究报道，Caspase抑制剂IDN-6556能够抑制胆管结扎小鼠的肝细胞凋亡、炎症反应、HSC的活化和肝纤维化程度，这些数据表明肝细胞凋亡开始级联反应，最终导致肝损伤和纤维化[34]。敲除Fas基因后，肝细胞凋亡和肝纤维化程度明显减少，表明抑制Fas/FADD通路介导的凋亡可能发挥抗肝纤维化作用[35]。此外，研究还发现，雄芍汤可通过调节Fas/FADD通路改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化[36]。笔者的实验结果同样发现，TGP干预可以诱导活化HSC-LX2细胞的凋亡，从而使HSC激活标志物表达下调，这可能与Fas和FADD上调激活Caspase-8、Caspase-3诱导细胞凋亡有关。
综上所述，TGP可能通过抑制TGF-β1表达，下调包括Smad 2和Smad 3在内的下游介质，以此实现抑制TIMP1激活，促进MMP1表达分解ECM的目的，从而起到影响活化HSC-LX2细胞分化的作用；而TGP抑制活化HSC-LX2细胞生长增殖，促进活化HSC-LX2细胞凋亡则可能是通过激活与Fas相关的死亡结构域复合物Fas/FADD/Caspase-8的表达，促使Caspase-3蛋白再激活并诱导细胞凋亡有关。这为揭示白芍抗肝纤维化的物质基础及其作用机制研究提供了一定的实验基础。
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2. North Sichuan Medical College, Nanchong 637100, China;
3. Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China