糖尿病足溃疡是指糖尿病患者由于合并神经病变及不同程度的末梢血管病变而出现足部感染、溃疡形成和（或）深部组织破坏^[1]。有数据显示，其发病率高达8.1%，年病死率高达11%，总截肢率更是高达19.03%，给患者及社会造成了沉重的负担^[2]。因此有效地防治糖尿病缺血性足溃疡的发展是当下解决临床问题的关键所在^[3]。自噬是细胞“自我分解代谢”的过程，但过度持续的自噬活动会影响创面的正常生长，研究发现腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在调控自噬和促进伤口愈合方面起着重要作用，激活AMPK/mTOR信号通路有望通过调节自噬来促进细胞清除、修复损伤，从而加速创面愈合^[4]。糖尿病缺血性足溃疡属中医“消渴脱疽”范畴，破淤汤为本院治疗糖尿病足糖尿病缺血性足溃疡（消渴脱疽）痰瘀阻络型患者的协定处方，前期在临床上疗效优势显著，能够在一定程度上改善患者的症状，促进其缺血伤口的愈合，缩短治疗的周期。本实验拟通过AMPK/mTOR信号通路探索破淤汤调节自噬的可能机制，以期为临床治疗消渴脱疽提供更多的诊疗思路。

1 实验材料与方法 1.1 实验动物

8~10周SPF级Wistar雄性大鼠60只，体质量（200±20）g，室温（22±2）℃，相对湿度55%±5%，标准饲料、自由饮水、分笼适应性饲养1周。本研究所用实验动物由[易生源基因科技（天津）有限公司]提供，动物使用许可证号为：SYXK（津）2021-0003。

1.2 主要材料和仪器

破淤汤由天津中医药研究院附属医院药剂科提供，西洛他唑片购于浙江大冢制药有限公司；链脲佐菌素（STZ），苏木精-伊红（HE）染色试剂盒，Anti-CD31抗体，辣根酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG），脱脂奶粉（BD Biosciences公司）；蛋白酶抑制剂Cocktail，磷酸酶抑制剂Cocktail（货号：BL629A，BL636A）；一抗为AMPK抗体、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）抗体、mTOR抗体、磷酸化乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）抗体（货号：AF6423，AF3423，AF6308，AF3308）；二抗为Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP（Affinity），超敏ECL化学发光即用型底物，PVDF膜。血糖仪，万能显微镜，离心机（离心半径10 cm），电泳仪，蛋白电转仪，组织研磨机，Amersham Imager 680转印系统（美国通用电器）。

1.3 动物造模与分组

糖尿病大鼠造模：造模大鼠采用高糖高脂饲料喂养8周后，以75 mg/kg STZ腹腔注射进行糖尿病诱导，并于第1周末检测空腹血糖（FBG），若FBG≥16.7 mmol/L，则视为造模成功。糖尿病大鼠及对照组大鼠均行足病造模：采用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠后，对左后肢进行消毒，并沿纵向切开约1 cm，结扎股动脉及其分支，建立后肢缺血模型。将磁片经乙醇浸泡消毒后置于双侧后肢皮下，随后缝合伤口。48 h后，待皮肤愈合，在磁片部位外贴铁片，每次施加压力导致局部缺血2 h后取下，使血流恢复30 min，每只大鼠每日重复3个循环，连续2 d，直至皮肤坏死形成溃疡。选取10只正常大鼠作为空白对照组，50只糖尿病模型大鼠通过随机数字表法分为5组，分别为糖尿病对照组、西药干预组（西洛他唑）、破淤汤低剂量组、破淤汤中剂量组和破淤汤高剂量组。

1.4 药物的制备及给药

破淤汤组成：桃仁10 g，红花10 g，半夏10 g，竹茹15 g，熟地黄10 g，当归15 g，白芍10 g，川芎15 g，枳实10 g，陈皮15 g，茯苓15 g，黄连10 g，白芷10 g，葛根10 g，桂枝15 g，牛膝10 g，甘草10 g。生药购于天津市中医药研究院附属医院药剂科，由煎药室采用煎药智能控制系统按照《中药汤剂煎煮技术规范》完成煎煮，煎煮2次，每次30 min，所得药汁以75 ℃浓缩至每日100 mL（相当于2.0 g生药/mL），以上用量为成人每日剂量，原方剂量为200 g，大鼠与人体表面积比率为0.02，经动物体表面积计算大鼠的相应给药量为10 mL/kg，此为中剂量组。低剂量组药物制备：中剂量组药物稀释至2倍（相当于1.0 g生药/mL）。高剂量组药物制备：中剂量组药物浓缩至2倍（相当于4.0 g生药/mL）。西药干预组将西洛他唑片溶解于蒸馏水中，浓度为0.002 g/mL。所有药物制备后，保存在4 ℃，观察到左后肢皮肤出现明显坏死及肉眼可见溃疡形成的48 h后，开始每日灌胃给药干预，持续4周。各组大鼠每周称体质量调整剂量，糖尿病对照组及空白对照组给予等剂量蒸馏水灌胃。

1.5 指标检测 1.5.1 一般情况以及创面愈合情况的观察

每日观察大鼠毛发、精神状态、体质量、摄食饮水以及大小便等一般情况，并观察创面伤口大小再进行测量，在造模完成后第7天和第14天对创面部位拍照并计算创面愈合率。创面愈合率（%）=（1-溃疡面积/初始面积）×100%。

1.5.2 HE染色观察创面

取大鼠新鲜创面组织浸泡在4%多聚甲醛里面固定12 h，脱水，石蜡包埋，切片HE染色，中性树胶封存固定，待切片透明后显微镜下观察溃疡创面病理学改变。

1.5.3 免疫组织化学染色法观察CD31以及自噬相关蛋白p62、微管相关蛋白轻链3（LC3）蛋白

取新鲜创面肉芽组织，固定后进行脱水、石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡和乙醇梯度脱水。使用3% 双氧水（H₂O₂）孵育10 min灭活内源酶活性，磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗后使用牛血清封闭非特异性蛋白。孵育CD31一抗（1∶200）和p62、LC3一抗（1∶200）于4 ℃过夜，第2天室温复温，加入二抗（1∶500），DAB显色，苏木素复染，脱水透明后封片，显微镜下观察并分析。

1.5.4 蛋白免疫印记法（Western blot）检测AMPK/mTOR信号通路关键蛋白表达情况

取创面肉芽组织标本，常规提取目标蛋白样品，分别加入组织溶解液，提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。取50 μg，电泳、转膜，加入脱脂奶粉封闭，根据分子量剪膜后分别加入兔抗鼠AMPK、兔抗鼠p-AMPK、mTOR、p-mTOR以及β-actin，4 ℃过夜孕育，然后加入辣根过氧化物-山羊抗兔IgG二抗，室温孕育1 h，加入ECL显影剂，以β-actin作为内参，采用Image J软件分析条带蛋白灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.5.5 统计学方法

数据采用SPSS 25.0进行统计分析。计量资料行正态性检验，正态分布资料以均数±标准差（x±s）表示。组间比较使用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠一般情况以及创面愈合情况

造模后的大鼠出现了典型“三多一少”以及毛黄杂乱、反应迟缓、活动减少等情况，未出现明显的异常行为活动。干预后的第7天和第14天后，糖尿病对照组大鼠创面愈合率均低于空白对照组（P＜0.05）；与糖尿病对照组相比，西药干预组及破淤汤低、中、高剂量干预组创面愈合率均提高（P＜0.05）；破淤汤中剂量干预组高于西药干预组及破淤汤低、高剂量干预组创面愈合率（P＜0.05）。见表 1。

2.2 各组大鼠下肢溃疡区域肉芽组织的HE病理形态观察

空白对照组见丰富的新生毛细血管，形态规则，排列紧密，未见明显炎性细胞浸润。糖尿病对照组见新生血管稀疏、形态不规则，出现明显炎性细胞的浸润。与糖尿病对照组比较，破淤汤中剂量干预组和西药干预组见大量的新生毛细血管，出现少量的炎性细胞浸润。而破淤汤低剂量和高剂量干预组见大量的炎性细胞浸润，有较少毛细血管的新生。见图 1。

2.3 各组大鼠CD31免疫组织化学染色计算微血管密度

参考Weidner方法^[5]计数大鼠肉芽组织的微血管密度：使用SlideViewer数字显微镜100倍显微镜下确定染色最高血管密度区域，然后置于400倍下，选择3个最高血管密度区，相同区域面积下进行微血管计数，然后求取其平均值作为该样本MVD值。

2.3.1 各组大鼠CD31免疫组织化学染色

糖尿病对照组标记的CD31表达少，血管形态较小且形态不规则。其余各干预组标记CD31表达多，管径较成熟，形态规整且连续。见图 2。

2.3.2 各组大鼠糖尿病足溃疡肉芽组织微血管密度

各组大鼠糖尿病足溃疡肉芽组织微血管密度（MVD）数目组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。与空白对照组相比，糖尿病对照组MVD数目较少（P＜0.05）；各药物干预组MVD数目均高于糖尿病对照组（P＜0.05）。见表 2。

2.4 各组大鼠LC3及p62蛋白表达情况及其免疫组化染色

与空白对照组相比，糖尿病对照组p62表达增强，染色加深；与糖尿病对照组相比，各药物干预组的p62阳性表达程度有所减弱，LC3表达增强，阳性颗粒增多，见图 3和图 4。糖尿病对照组LC3蛋白表达量低于空白对照组（P＜0.05）；西药干预组以及破淤汤各干预组LC3均明显高于糖尿病对照组（P＜0.05）；糖尿病对照组P62蛋白表达量低于空白对照组（P＜0.05）；西药干预组以及破淤汤各干预组P62均明显低于糖尿病对照组（P＜0.05），见图 5。

2.5 各组大鼠AMPK/mTOR信号通路关键蛋白的表达水平

糖尿病对照组p-AMPK/AMPK表达量低于空白对照组（P＜0.05）；西药干预组以及破淤汤干预组p-AMPK/AMPK均明显高于糖尿病对照组（P＜0.05）。糖尿病对照组p-mTOR/mTOR表达量低于空白对照组；西药干预组及破淤汤低、中、高剂量干预组p-mTOR/mTOR表达量低于糖尿病对照组（P＜0.05）。见图 6。

3 讨论

近年来，中医以整体观念和辨证论治为基础，在治疗消渴脱疽方面展现出显著优势。消渴脱疽多属本虚标实之证，其内因为病久伤阴，热毒亢盛壅于脉络；外因则常见感染寒湿邪气、外伤或鞋靴挤压所致^[6]。破淤汤以桃红四物汤合黄连温胆汤加减而成，清血瘀、化痰结，调气血、通脉络，祛邪而不伤正。破淤汤在治疗上兼顾活血化瘀、化痰通络与补益气血，体现攻补兼施的原则。中医“气血理论”与现代自噬机制在维持机体能量代谢方面高度相似，自噬通过动态调节机体内环境稳定，而气血“相依、相生、循环不已”的特性正与其内涵相符^[7]。已有研究表明，中医通过调气理血能够通过AMPK/mTOR通路调控自噬，而桃红四物汤、黄连温胆汤等中药方剂亦被证明具有调节自噬的作用，为治疗消渴脱疽提供了理论和实践依据^[8-12]。

已有研究表明，在慢性损伤模型中，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值下降、p62积累提示自噬受阻，而氨茶碱治疗能有效恢复LC3B-Ⅱ水平并减少p62积累，从而增强细胞自噬，减轻组织损伤^[13]。结合本研究结果，破淤汤通过调节AMPK/mTOR通路，显著促进了LC3的表达并减少了p62的积累，恢复了自噬功能。LC3的上调表明自噬体的形成和活性得到了增强，而p62的降低则表明自噬底物被有效降解，结果表明破淤汤可能通过改善糖尿病缺血性溃疡中自噬受损的状况，从而促进创面的修复和愈合。

自噬的发生与发展受到多种信号通路的调节，其中较为经典的是AMPK/mTOR信号通路，研究发现该信号通路在细胞的自噬、凋亡中等过程中发挥重要作用，调节该信号通路可增强自噬活性，抑制炎症反应，从而促进伤口愈合^[14]。本研究结果显示，与空白对照组相比，糖尿病对照组p-AMPK/AMPK蛋白表达水平降低，p-mTOR/mTOR升高，表明该信号通路受到抑制，破淤汤和西洛他唑干预后，p-AMPK/AMPK蛋白表达水平升高，p-mTOR/mTOR降低，证实破淤汤可以激活AMPK/mTOR信号通路促进自噬，从而清除细胞内的损伤成分，维持细胞的功能和代谢，促进伤口愈合，破淤汤和西洛他唑均可能改善微循环、减轻氧化应激和炎症反应^[15]，这一机制与补骨膏在KOA模型中通过AMPK/mTOR调控自噬、抑制细胞凋亡的作用路径相吻合，提示破淤汤可能通过调节自噬加速创面修复与组织再生^[16]。结合微血管密度来看，破淤汤和西洛他唑能够显著提高MVD水平，反映出其对血管新生的促进作用。此外，血管新生能够改善局部血流、氧供和营养支持，进一步促进组织修复与细胞功能恢复^[17]，进一步佐证破淤汤可能通过调控自噬与血管新生形成协同作用，加速了溃疡创面的愈合。

综上所述，破淤汤可能通过调节AMPK/mTOR信号通路，减轻炎症反应，增强自噬活性，从而促进伤口愈合，为糖尿病足的治疗提供了新的理论基础和治疗策略。未来将进一步通过蛋白定量分析、特异性通路抑制剂干预及自噬流动态监测等手段，进一步明确其作用机制是否存在剂量依赖性，并探索可能的信号通路交叉调控机制，从而更全面阐明其治疗潜力与分子基础。