2025, Vol. 42文章信息
- 俞斯嘉, 葛栩涛, 盛洪达, 等.
- YU Sijia, GE Xutao, SHENG Hongda, et al.
- 宣肺败毒方活性组分对新型冠状病毒刺突蛋白诱导炎症及嗅觉损伤的影响
- Effects of the active fraction of Xuanfei Baidu Formula on inflammation and olfactory impairment induced by SARS-CoV-2 spike protein
- 天津中医药, 2025, 42(11): 1444-1451
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(11): 1444-1451
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.11.13
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文章历史
- 收稿日期: 2025-06-28
引用本文 |
2. 天津中医药大学中医药研究院, 天津 301617;
3. 浙江大学智能创新药物研究院, 杭州 310018
2019冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的全球性大流行病，虽然近年来其感染率和病死率逐渐趋于平稳，但其传播速度仍保持较高的水平，而且演化出了多种变异亚型，有大量人群发生反复感染、“长新冠”后遗症等症状，仍是影响全人类健康的一大危险因素[1]。嗅觉功能障碍是COVID-19患者最常见的症状之一，多篇流行病学研究均报道大约25%~70%的感染患者会出现嗅觉丧失或嗅觉减退等症状[2-5]，而在感染后4周以上的人群中也有约12%仍表现出嗅觉异常的“长新冠”症状[6-7]。对临床样本的研究表明新型冠状病毒颗粒在经鼻腔进入人体时会附着在鼻黏膜组织上，感染面向鼻腔的嗅上皮细胞[8]，并且引起巨噬细胞、中性粒细胞等多种免疫细胞的聚集，在中枢神经系统中诱发大量免疫激活和神经炎症，导致嗅球损伤[9]，这提示了SARS-CoV-2感染引起的炎症和嗅觉损伤之间的密切联系。刺突蛋白（S蛋白）作为新型冠状病毒主要结构蛋白，在病毒入侵和宿主免疫应答的过程中发挥重要作用，且其本身被证明可以不依赖于其他病毒成分引起多种细胞的免疫信号激活[10]。因此，S蛋白引起的免疫激活和炎症反应可能是新型冠状病毒感染导致嗅觉失常的潜在病理机制之一，抑制炎症反应可能有利于治疗病毒感染诱发的嗅觉损伤。
中草药具有广谱抗病毒、抗炎等多重活性，是开发COVID-19治疗方法的宝贵资源。目前临床多采用直接抗病毒药物或糖皮质激素、嗅觉训练等治疗病毒感染导致的嗅觉障碍[11-12]，也有研究报道了清肺排毒汤等中药复方治疗新型冠状病毒感染患者嗅觉失常的临床有效性[13]，但是中药或天然化合物治疗嗅觉失常的潜力还有待发掘。宣肺败毒方是张伯礼院士及刘清泉教授等专家通过辨证论治在经典方剂基础上针对“湿毒疫”优化设计得到的中药处方，由多个经典名方加减化裁而来，共由13味中药组成，化学成分复杂，在中国抗击新型冠状病毒感染的临床前线取得了良好的疗效[14-15]。临床前研究表明，宣肺败毒方主要含有黄酮类、三萜类等物质，全方及其含有的木犀草素、异甘草素等化合物均表现出抗炎和抗病毒活性[16-18]，这提示了宣肺败毒方及其中的活性组分可能具有抑制新型冠状病毒刺突蛋白诱导的炎症反应以及嗅觉损伤的潜力。
课题组在前期研究中制备得到了宣肺败毒方的多糖、酚类、生物碱等大类组分，其中大类组分C在体外实验中显示出良好的抗天然免疫细胞介导的炎症反应活性。本研究在体外通过新型冠状病毒刺突蛋白刺激构建了巨噬细胞炎症模型，并通过在斑马鱼幼鱼的单侧嗅基板（Olfactory placode）显微注射新型冠状病毒刺突蛋白的S1亚基构建了斑马鱼嗅觉损伤模型，在体内和体外评价宣肺败毒方活性组分C（XFBD-C）对于刺突蛋白诱导的炎症和嗅觉损伤的治疗效果，以期为宣肺败毒方的活性组分辨析及其治疗嗅觉功能障碍的应用潜力提供科学证据。
1 材料与方法 1.1 动物与细胞小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系（RAW264.7）和人单核细胞白血病细胞系（THP-1）均来源于中国科学院细胞库（中国上海）。细胞于37 ℃、5% CO2培养箱培养。Tg（lyz：egfp）品系[19]和Tg（gad1b：mcherry）品系[20]转基因斑马鱼均获取自浙江大学实验动物中心。斑马鱼胚胎通过成鱼在水中自然交配繁殖获得，在含有亚甲基蓝和苯基硫脲（PTU，0.2 mmol/L）的E3培养基（0.29 g/L NaCl，0.013 g/L KCl，0.048 g/L CaCl2·2H2O，0.082 g/L MgCl2·6H2O，pH 7.2）中培养胚胎。所有斑马鱼实验均按照浙江大学实验动物中心动物伦理委员会指导原则（ZJU20241040，2024年12月17日）进行。
1.2 药物与试剂宣肺败毒全方提取物由天津现代创新中药科技有限公司提供。SARS-CoV-2 S1和S2蛋白（美国Ray Biotech公司）；RNA快速提取试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司）；高效逆转录试剂盒（浙江易思得生物科技有限公司）；ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。人源以及鼠源白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国Invitrogen公司）。
1.3 仪器皮升显微注射泵（Warner公司）；斑马鱼行为学系统DanioVision（荷兰诺达思公司）。体式荧光显微镜Nikon SMZ18（Nikon公司）；倒置相差显微镜（Leica公司）。480Ⅱ荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（Roche公司）。Infinite M1000Pro多功能酶标仪（TECAN公司）。
1.4 XFBD-C的制备称取一定量宣肺败毒方总提取物于10倍质量的纯净水中，加热回流溶解，冷却后4 000 r/min离心10 min（离心半径16 cm），上清液缓缓上样至HPD-100型大孔树脂吸附柱中，依次加入2倍柱体积的0.01%盐酸水-30%乙醇-70%乙醇-95%乙醇进行分段洗脱，收集70%乙醇的洗脱液。经减压浓缩至适量，采用冷冻干燥法制成XFBD-C粉末。冻干粉末溶于二甲基亚砜（DMSO）配制成100 mg/mL的药液，储存于-20 ℃保存。
1.5 巨噬细胞炎症模型的构建与给药取对数生长期的巨噬细胞系传代种板。RAW264.7细胞用胰酶消化后计数种板，贴壁24 h；THP-1细胞计数后向细胞悬液中加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）至终浓度100 ng/mL，贴壁48 h。细胞贴壁后利用新冠病毒S1或S2蛋白刺激24 h，诱导体外巨噬细胞炎症模型，并同时用50 μg/mL XFBD-C干预给药组细胞。
1.6 斑马鱼嗅神经损伤模型的构建与给药使用Tg（gad1b：mcherry）红色荧光标记GABA能神经元和Tg（lyz：egfp）绿色荧光标记中性粒细胞杂交的转基因斑马鱼胚胎进行实验。收取胚胎前1 d，将成鱼按照Tg（gad1b：mcherry）雌鱼×Tg（lyz：egfp）雄鱼，或Tg（lyz：egfp）雌鱼×Tg（gad1b：mcherry）雄鱼配对，放置于交配缸中。次日收集胚胎并清洗，去除发育不良的胚胎，将胚胎转移至含有亚甲基蓝以及PTU的E3培养基置于28.5 ℃培养箱培养。隔日去除不良胚胎并更换E3培养基，并于出生后5 d（5 dpf）之前挑选出同时表达红+绿荧光的胚胎，继续在28.5 ℃培养箱中孵育至6~7 dpf。
将幼鱼麻醉后置于琼脂胶上。造模组和给药组每条幼鱼均对单侧嗅基板显微注射新冠病毒S1蛋白2 ng（500 μg/mL×4 nL），另一侧不注射作对比观察；对照组用无菌磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行同样体积的单侧显微注射。注射结束后将鱼转入不含麻醉剂的E3培养基中复苏并置于恒温培养箱培养。
注射后3 h（3 hpi）时在体式荧光显微镜下挑选造模成功（单侧嗅神经荧光减弱）的斑马鱼随机分为造模组（Model组）和XFBD-C给药组，对照组仅排除注射后状态不佳的幼鱼，保证每组10~15只幼鱼。在6 hpi时对照组和造模组更换新的E3培养基，给药组给予含20 μg/mL XFBD-C的E3培养基。
1.7 斑马鱼运动及食物感知行为学评价给药24 h（30 hpi）后，将各组幼鱼分入48孔板，每孔1条鱼。使用斑马鱼行为学系统Danio Vision评估斑马鱼运动及食物感知能力。将含有斑马鱼幼鱼的孔板放入行为学系统后避光预适应10 min，随后进行10 min行为学拍摄，结束后每孔立刻加入等量斑马鱼幼鱼饲料，再次进行10 min行为学拍摄。拍摄结束后使用Etho Vision XT 15软件自动追踪定位斑马鱼，绘制移动轨迹并统计移动距离。
1.8 斑马鱼荧光成像给药24 h（30 hpi）后，将各组幼鱼分入透明96孔板，每孔1条鱼。使用倒置相差显微镜采集每条幼鱼头部的荧光显微图像。拍摄结束后使用Image J软件分析显微注射一侧嗅神经处30×30像素点区域内的平均荧光强度变化，并统计显微注射侧嗅神经附近200×200像素点区域内的中性粒细胞个数。
1.9 实时荧光定量PCR检测炎症因子和趋化因子的表达RAW264.7细胞和THP-1细胞在刺激给药24 h后分别使用RNA快速提取试剂盒收集各组细胞总RNA，测定其纯度和浓度后将总RNA逆转录为cDNA；斑马鱼幼鱼给药24 h（30 hpi）后，分别收集各组幼鱼，使用RNA快速提取试剂盒提取全鱼的总RNA，测定其纯度和浓度后将总RNA逆转录为cDNA。细胞样本以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达水平作为内参，斑马鱼样本以延伸因子1-alpha（EF1A）表达水平作为内参，均通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表 1。
| 基因名称 | 种属 | 引物序列(5’-3’) |
| IL-6 | 小鼠 | Forward: TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC Reverse: TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC |
| IL-1β | 小鼠 | Forward: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT Reverse: ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT |
| MCP-1 | 小鼠 | Forward: TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA Reverse: GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT |
| GAPDH | 小鼠 | Forward: AGGTCGGTGTGAACGGATTTG Reverse: TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA |
| IL-6 | 人 | Forward: GTAGCCGCCCCACACAGA Reverse: CATGTCTCCTTTCTCAGGGCTG |
| IL-1β | 人 | Forward: TGCTCAAGTGTCTGAAGCAG Reverse: TGGTGGTCGGAGATTCGTAG |
| MCP-1 | 人 | Forward: CAGCCAGATGCAATCAATGCC Reverse: TGGAATCCTGAACCCACTTCT |
| GAPDH | 人 | Forward: GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT Reverse: GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| IL-1β | 斑马鱼 | Forward: TGTGTGTTTGGGAATCTCCA Reverse: CTGATAAACCAACCGGGACA |
| EF1A | 斑马鱼 | Forward: AGAAGGCTGCCAAGACCAAG Reverse: AGAGGTTGGGAAGAACACGC |
| 注：IL-6, 白细胞介素-6;IL-1β, 白细胞介素-1β; MCP-1, 单核细胞趋化蛋白-1;GAPDH, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶; EF1A, 真核翻译延伸因子1α。 | ||
RAW264.7细胞和THP-1细胞在刺激给药24 h后收集上清液，按ELISA试剂盒说明书操作，测定刺激和给药后巨噬细胞培养上清液中IL-6的分泌水平。
1.11 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行作图和统计学分析，所有数据采用均数±标准差（x±s）进行计算。组间比较采用双尾非配对t检验，P < 0.05表示有统计学意义。
2 实验结果 2.1 新型冠状病毒刺突蛋白在体外诱导的巨噬细胞炎症反应首先，为了评价新型冠状病毒刺突蛋白对固有免疫细胞的影响以及XFBD-C对其炎症反应的调控作用，在RAW264.7细胞系中构建了刺突蛋白S1或S2亚基刺激诱导的巨噬细胞炎症模型。见图 1。从胞外IL-6的分泌量变化可以发现，S1和S2蛋白的浓度越高，RAW264.7细胞分泌的IL-6细胞因子越多，且均以500 ng/mL浓度刺激时细胞炎症反应最强，证明了S蛋白对巨噬细胞炎症反应的诱导作用。
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| 注：Control组为对照组。与Control组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 1 新型冠状病毒刺突蛋白在体外诱导巨噬细胞IL-6的分泌 Fig. 1 Secretion of IL-6 by macrophages stimulated with SARS-CoV-2 spike protein in vitro |
接下来，在鼠源和人源两种不同来源的巨噬细胞系中均评价了XFBD-C对炎症反应的调控作用。ELISA结果以及实时荧光定量PCR结果显示，在S1蛋白刺激的RAW264.7与THP-1细胞中，与模型组相比，XFBD-C均可以显著降低IL-6的mRNA表达以及分泌。见图 2A和图 2B。在S2蛋白刺激的RAW264.7细胞中，IL-6 mRNA表达和分泌均被XFBD-C抑制。见图 2C。而在S2蛋白刺激的THP-1细胞中，XFBD-C给药后IL-6 mRNA表达有一定下降，但分泌量无显著降低。见图 2D。此外，XFBD-C均可以显著下调4种巨噬细胞模型中IL-1β以及MCP-1的mRNA表达量。以上结果提示了XFBD-C对刺突蛋白引起的炎症和免疫细胞趋化的抑制作用。
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| 注：图A为S1蛋白刺激的RAW264.7细胞模型，图B为S1蛋白刺激的THP-1细胞模型，图C为S2蛋白刺激的RAW264.7细胞模型，图D为S2蛋白刺激的THP-1细胞模型。Control组为对照组。与Control组比较，**P < 0.01；与S1或S2造模组比较，##P < 0.01。 图 2 XFBD-C对新型冠状病毒刺突蛋白诱导的巨噬细胞炎症反应的调控作用 Fig. 2 Regulatory effects of XFBD-C on macrophages inflammatory response induced by SARS-CoV-2 spike protein in vitro |
为进一步评价其药理作用，应用斑马鱼幼鱼嗅觉损伤模型对XFBD-C进行研究。通过在斑马鱼单侧嗅基板部位注射S蛋白构建模型，筛选造模成功的斑马鱼进行XFBD-C给药药效实验。在造模30 hpi时对各实验组全鱼的IL-1β mRNA表达水平进行检测，实时荧光定量PCR结果显示，模型组IL-1β mRNA表达水平显著升高（P < 0.01）；而与模型组比较，XFBD-C能够显著降低斑马鱼炎症状态下的IL-1β表达（P < 0.01）。见图 3。由此可证明S1蛋白局部注射造模引起了斑马鱼体内的炎症反应，且XFBD-C对其可能具有调控作用。
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| 注：Control组为对照组，Model组为模型组，XF-C组为XFBD-C组。与Control组比较，**P < 0.01；与Model组比较，##P < 0.01。 图 3 XFBD-C对局部注射S1蛋白的斑马鱼体内IL-1β表达的影响 Fig. 3 Effects of XFBD-C on IL-1β expression in zebrafish injected with S1 protein |
进食行为是最常被用于表征嗅觉功能指标。当暴露于与食物相关的气味物质时，斑马鱼会表现出食欲异味的嗅觉行为，例如游泳速度和频繁转弯（>90 °）的移动距离增加，以便将自己定位到气味物质的来源[21-22]。本研究同样用进食行为表征斑马鱼嗅觉功能。使用S1蛋白在斑马鱼幼鱼嗅基板部位显微注射进行感染造模后，通过喂食前后幼鱼的运动状态变化可以评价其觅食活跃程度，进而推断其嗅觉灵敏程度。见图 4。各实验组斑马鱼在喂食前0.5 h内运动距离相似，而在给予幼鱼饲料后，各组的运动距离均有一定的增加，符合文献中描述的斑马鱼对食欲异味的嗅觉行为[21-22]，表明斑马鱼定向摄食的激活。值得注意的是，从统计结果来看，对照组幼鱼喂食后移动距离显著增加（P < 0.01），但模型组幼鱼喂食前后的移动距离失去了这种统计学差异，而XFBD-C给药则挽救了这一现象，喂食后幼鱼移动距离显著增加（P < 0.05）。
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| 注：Control组为对照组，Model组为模型组，XF-C为XFBD-C组。组内喂食前后比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 4 XFBD-C对斑马鱼幼鱼觅食活跃程度的影响 Fig. 4 Effects of XFBD-C on food perception activity of zebrafish larvae |
为了可视化评价XFBD-C对斑马鱼嗅基板神经元损伤及炎症挽救情况，使用Tg（gad1b：mcherry）品系（红色荧光标记GABA能神经元）和Tg（lyz：egfp）品系（绿色荧光标记中性粒细胞）杂交的转基因斑马鱼幼鱼，通过相同的注射条件进行感染造模。注射30 h后（即XFBD-C给药24 h后），拍摄了各组转基因斑马鱼显微注射区域的荧光图像。见图 5A。定量统计斑马鱼损伤区域的嗅神经荧光强度以及中性粒细胞个数可得，模型组斑马鱼感染侧GABA能嗅神经平均荧光强度明显减弱（P < 0.01）。见图 4B和图 4C。此外，S1蛋白感染侧出现明显的中性粒细胞聚集增多的现象（P < 0.01），表明造模后的嗅基板出现了明显的嗅神经损伤及炎症浸润。在XFBD-C干预后，观察到与模型组相比，GABA能神经荧光强度显著回调（P < 0.01），中性粒细胞浸润数也有所下降（P < 0.05）。上述实验表明S1蛋白引起了斑马鱼幼鱼嗅神经损伤并伴随免疫炎症浸润，且XFBD-C给药一定程度挽救炎症浸润以及嗅神经损伤。
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| 注：Control组为对照组，Model组为模型组，XF-C为XFBD-C组。与Control组比较，**P < 0.01；与Model组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 图 5 XFBD-C对新型冠状病毒刺突蛋白诱导的嗅神经损伤和中性粒细胞趋化的影响 Fig. 5 Effects of XFBD-C on olfactory nerve injury and innate immune cell chemotaxis induced by SARS-CoV-2 |
斑马鱼作为新兴的模式生物，与传统的整体动物模型相比具有繁殖迅速、幼体全身透明、遗传学上易于编辑等优势。此外，斑马鱼的免疫系统也与人类高度相似，例如经典炎性细胞因子[白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6]以及Ⅰ型干扰素（IFN）的直系同源物均在斑马鱼中发现[23]。有越来越多研究使用斑马鱼作为研究新型冠状病毒及其结构蛋白与宿主互作的体内模型，例如Choi等[24]使用SARS-CoV-2假病毒感染斑马鱼幼鱼，证明了外周感觉器官是病毒入侵宿主的可能位点，并探究了病毒在组织和器官中传播的关键步骤。斑马鱼嗅觉系统与人类具有很大程度的分子和解剖学保守性[25]，研究表明SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白）刺激能够引起成年斑马鱼的嗅觉损伤，导致嗅觉器官的水肿、出血、纤毛丢失甚至坏死，直到2周后逐渐恢复正常[26]。在斑马鱼模型中观察到的现象与叙利亚金仓鼠感染模型以及临床患者表型十分相似[2, 27-28]。这表明在模式生物斑马鱼模型中研究S蛋白引起嗅觉损伤的合理性。然而，成鱼实验在实验周期以及药物用量上对比认可度更高的仓鼠模型并未有明显的优势。斑马鱼幼鱼具有高产、发育迅速以及便于活体动态观察的优势，因此利用斑马鱼幼鱼构建嗅觉损伤模型对于评价药物具有重要意义。因此，本研究采用对斑马鱼幼鱼单侧嗅基板显微注射SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基的方式构建模型，通过定量测量各实验组喂食前后的运动轨迹距离评估幼鱼的嗅觉灵敏程度，结果表明模型组的运动及食物感知能力与对照组幼鱼相比明显减弱，说明刺突蛋白局部刺激后能够诱发嗅觉损伤。
病理学研究提出新型冠状病毒感染引起的病毒性嗅觉功能障碍的病理机制可能包括嗅上皮细胞和嗅球周细胞等非神经元细胞的病毒感染[29]、免疫细胞趋化和炎症因子大量分泌[30-31]、嗅黏膜损伤和纤毛丧失[27, 32]等等。但是目前，针对COVID-19引起的嗅觉功能障碍可用药物尚不明确，文献报道多采用直接抗病毒药物、抗炎药物、非新型冠状病毒感染时治疗嗅觉失常的鼻腔用药等。例如鼻内胰岛素给药作为促进嗅黏膜再生的常用治疗方法被应用于新型冠状病毒感染患者嗅觉失常治疗[33]，皮质类固醇口服或鼻内治疗也被用于控制感染初期的疾病进展并预防嗅觉系统的炎症[11, 34]。因此，研究尝试在巨噬细胞炎症模型以及刺突蛋白局部注射构建的斑马鱼模型中评价XFBD-C对刺突蛋白诱导的炎症及嗅觉损伤调控作用。本研究对各实验组斑马鱼进行RT-qPCR检测和注射区域的荧光图像采集，证明了XFBD-C可以有效抑制斑马鱼体内的IL-1β表达和刺突蛋白局部刺激区域内的免疫细胞趋化，与体外模型中XFBD-C抗炎症因子和趋化因子表达的药效作用相符合，证实了XFBD-C可以有效抑制新型冠状病毒刺突蛋白引起的炎症和趋化反应。同时，在斑马鱼模型中XFBD-C的抗炎和抗趋化作用伴随着嗅觉灵敏程度的提高和局部刺激区域内嗅神经荧光强度的提高，证明了XFBD-C挽救新型冠状病毒刺突蛋白引起的嗅觉损伤的作用，并提示了XFBD-C可能可以通过调控炎症反应缓解SARS-CoV-2刺突蛋白引起的嗅觉损伤。
宣肺败毒方的抗炎和抗新型冠状病毒作用已经被大量文献和临床研究证明，而解析其药效物质基础成为推进中药现代化研究的关键环节。课题组前期研究中对XFBD和XFBD-C的化学组成均进行了系统性表征[16]。超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用分析表明，XFBD-C作为宣肺败毒方的主要活性组分，保留了马鞭草苷、甘草苷等大量黄酮类化合物。对其进一步的定量核磁分析表明，大黄素、虎杖苷、甘草苷、甘草酸和柚皮苷是XFBD-C中含量最高的化学成分。值得注意的是，这些主要成分可能与其药理活性密切相关，例如大黄素被大量报道可以通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）信号通路减少促炎因子的释放[35]，虎杖苷则被证实具有调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化的作用[36]。而在课题组前期研究中发现，以上5种主要化合物的配伍组合物同样可以调控疾病状态下的NLRP3信号通路，阻断NLRP3/凋亡相关斑点样蛋白（ASC）/前体半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1（pro-Caspase-1）复合物的组装，从而抑制IL-1β的成熟与分泌。这提示了XFBD-C可能通过多成分、多靶点协同作用发挥抗炎效应，且这些分子事件的综合作用可能通过减轻嗅觉微环境中的炎症应激，从而改善嗅觉传导通路的功能完整性。本研究初步揭示了在新型冠状病毒刺突蛋白XFBD-C的抗炎和抗嗅觉损伤药理作用，但对于新型冠状病毒刺突蛋白诱导的炎症反应与嗅觉损伤之间的联系、以及XFBD-C在该过程中起效的药效物质基础仍需深入探究。
综上所述，本研究首次在模式动物斑马鱼的幼鱼中建立了新型冠状病毒刺突蛋白诱导的嗅觉损伤模型，证明了S蛋白刺激可以诱导固有免疫细胞炎症反应以及嗅觉损伤的现象。此外，在体内外多个模型中进行药效评价，初步揭示了XFBD-C作为该方的活性组分可以抑制固有免疫细胞对损伤区域的趋化和炎症反应，缓解新型冠状病毒刺突蛋白诱导的嗅觉损伤，为其临床应用及其组分中药研究提供了实验依据。然而，本研究尚有不足之处，例如后期可以进一步开展更深入的免疫细胞-嗅神经元相互作用的分子机制探索以及活性成分的辨析，为宣肺败毒方治疗病毒性嗅觉损伤提供更全面的实验室依据。
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2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
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