2025, Vol. 42文章信息
- 苗耀东, 李纯, 单心觉, 等.
- MIAO Yaodong, LI Chun, SHAN Xinjue, et al.
- 糖脂清方改善胞葬过程中细胞骨架重排缓解糖尿病动脉粥样硬化的机制研究
- Mechanism research of Tangzhiqing Formula in alleviating diabetic atherosclerosis by improving cytoskeleton rearrangement in efferocytosis
- 天津中医药, 2025, 42(11): 1459-1465
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(11): 1459-1465
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.11.15
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文章历史
- 收稿日期: 2025-09-10
引用本文 |
2. 天津中医药大学中医药研究院, 天津 301617;
3. 北京中医药大学研究生院, 北京 100029;
4. 中国中医科学院广安门医院, 北京 100053;
5. 天津中医药大学第一附属医院, 国家中医针灸临床医学研究中心, 天津 300381
当前，中国正面临人口老龄化和代谢危险因素持续流行的双重压力，中国DM患者人数位居世界第一[1-2]。动脉粥样硬化（AS）是DM的血管并发症之一，研究表明，DM患者AS发病率较非DM患者高2倍，且具有更高心脏死亡风险[3]。糖尿病动脉粥样硬化（DA）已成为一个重大公共卫生问题[4]。近年来，胰高血糖素样肽-1受体激动剂和钠-葡萄糖转运体2抑制剂以其良好的降糖作用和心血管获益证据应用于临床DA治疗[5]，但同时也存在胃肠刺激、泌尿系统感染等不良反应。因此，明确DA发病机制、寻找新的DA治疗策略是当前亟待解决的问题。
凋亡细胞的清除，即胞葬，被证明在DA的发生和发展中起着至关重要的作用[6]。研究表明，DM病理状态下，巨噬细胞的细胞骨架重排受到抑制，胞葬作用减弱，无法清除斑块内的泡沫细胞[7-8]，导致DA加剧。恢复细胞骨架排列、改善胞葬作用对于减轻斑块内炎症、减少斑块内脂质积累和避免斑块中继发的巨噬细胞坏死至关重要。
中医理论认为，DA病机与湿、浊、痰、饮4种病理因素密切相关。治疗DA应以化湿降浊，理气散瘀，软癥消积为治疗原则[9]。糖脂清方（TZQ）由桑叶、荷叶、山楂叶、丹参、赤芍5味药物组成，有升清化浊、理气化瘀之效。相关实验表明，TZQ能够改善甘油磷脂代谢以调节糖脂代谢，降低血脂和血糖水平[10]；同时，TZQ对主动脉粥样硬化内皮损伤具有保护作用[11]，能够减少细胞炎症因子的释放，减缓斑块进展[12]。基于相关研究结果及DA与胞葬之间的联系，本研究拟探究TZQ对DA斑块的抑制作用及其对胞葬过程中细胞骨架重排相关因子表达的促进作用，进一步探索TZQ防治DA的可能作用机制，为其临床应用提供依据。
1 材料 1.1 动物SPF级雄性ApoE-/-小鼠48只，8周龄，体质量20~30 g，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008。动物饲养于易生源基因科技（天津）有限公司SPF级动物实验中心，室内温度20~26 ℃，湿度40%~70%，通风次数为15次/h全新风，光照为12 h明、12 h暗，实验动物使用许可证号：SYXK（津）2021-0003。本实验经易生源基因科技有限公司动物伦理委员会审批（审批号：YSY-DWLL-2022232）。
1.2 药物桑叶7.7 g（批号210901，产地四川三台）、荷叶7.7 g（批号210601，产地山东）、山楂叶7.7 g（批号210101，产地河北）、丹参9.6 g（批号210701，产地山东）、赤芍9.6 g（批号20210801，产地内蒙包头），上述中药饮片购买自安国市弘发中药材饮片有限公司，由天津中医药大学第一附属医院主管药师臧滨鉴定，符合2020年版《中华人民共和国药典》要求。药物由易生源基因科技（天津）有限公司中药制剂实验室制备成含生药浓度为0.423 g/mL的溶液。
1.3 试剂链脲佐菌素（批号：301A025，Solarbio）；柠檬酸缓冲液（批号：20110118，Solarbio）；小鼠C反应蛋白（CRP）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（批号：202302，上海科兴）；小鼠干扰素γ（IFN-γ）ELISA检测试剂盒（批号：202302，上海科兴）；小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒（批号：202302，上海科兴）；油红O染色试剂盒（批号：20230320，天津易生源生物科技有限公司）；甘油明胶封片剂（批号：20230315，北京索莱宝科技有限公司）；聚合酶链反应（PCR）引物合成（上海生物工程有限公司）；Rho相关蛋白激酶（ROCK）1抗体（货号：66782-1-1G，Proteintech）；ROCK2抗体（货号：21645-1-AP，Proteintech）；Ras同系物家族成员A（RhoA）抗体（货号：66733-1-AP，Proteintech）；小鼠β-tubulin抗体（货号：TA-10，中杉金桥）；Goat Anti-Rabbit IgG（二抗）（货号：ZB-2301，中杉金桥）；Goat Anti-Mouse IgG（二抗）（货号：ZB-2305，中杉金桥）。
1.4 仪器血糖仪（三诺，GA-3）；动物全自动生化分析仪（深圳迈瑞公司，BS-240VET）；冰冻切片机（徕卡仪器有限公司，LEICA CM1900）；紫外分光光度计（上海让奇，D8PCS）；高速低温组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司，KZ-Ⅲ-F）；电泳仪（北京六一，DYY-6C）；全自动化学/荧光/凝胶成像分析系统（北京赛智，Champchemi 610 plus）；低温高速离心机（北京北利，GTR16-2）；实时定量聚合酶链反应（PCR）仪（ThermoFisher Scientific公司，QuantStudio 1）；酶标检测仪（北京普朗科技有限公司，DNM-9602）。
2 方法 2.1 造模、分组及给药适应性喂养后，12只雄性ApoE-/-小鼠喂养普通饲料作为对照组，36只雄性ApoE-/-小鼠喂养高脂饲料两周，连续8 d腹腔注射25 mg/kg链脲佐菌素（STZ）建立糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型，采用剪尾取血方法测小鼠随机血糖值，大于16.7 mmol/L为造模成功。经检测，36只小鼠均成模，可纳入实验，将成模小鼠随机分为模型组、TZQ中剂量干预组和TZQ高剂量干预组，每组各12只。造模成功小鼠继续喂养高脂饲料。2周后，对模型组、TZQ中、高剂量干预组小鼠分别给予0.9%氯化钠溶液10 mL/（kg·d）、中剂量TZQ 4.23 g/（kg·d）、高剂量TZQ 8.46 g（kg·d）灌胃。本研究剂量选择参考《中国药典》及已有研究，其中TZQ中剂量组为临床等效剂量，TZQ高剂量组剂量为临床等效剂量2倍，由于TZQ低剂量未达到有效剂量范围，因此未纳入本次实验。药物剂量根据《药理实验方法学》[13]不同种属动物间药物等效剂量直接折算法计算。各组均每天灌胃1次，连续10周。
2.2 取材动物给药10周后取材，取材前12 h禁食不禁水，称质量后眼球取血0.5 mL，取主动脉并剥离主动脉周围组织。
2.3 检测小鼠一般生存情况每日观察小鼠精神状态、饮食、活动量、大小便等一般情况，记录各组小鼠生存情况。
2.4 检测小鼠血糖及血脂情况采用剪尾法取小鼠尾尖血并使用全自动血糖仪进行血糖测定。采用全自动生化仪检测小鼠血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。
2.5 检测斑块面积及稳定性使用油红O染色检测全主动脉斑块面积：将全主动脉置于油红O染液中染色1 h，染色结束后用1×磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3次，在显微镜下观察粥样硬化斑块的部位、数目和大小。使用油红O染色检测主动脉根部斑块面积：将主动脉根部冰冻切片，染色1 h，用1×PBS洗去多余染液，使用显微镜拍照，观察主动脉根部斑块面积及脂质沉积。使用苏木精-伊红（HE）染色检测主动脉根部斑块稳定性：将主动脉根部冰冻切片室温复温后依次经苏木素染色液、分化液、返蓝液、梯度乙醇、伊红染液、无水乙醇、二甲苯染色，使用中性树脂封片后拍照。
2.6 血清炎症标志物CRP、TNF-α、IFNγ含量检测按ELISA试剂盒说明书步骤操作，测定血清中CRP、TNF-α、IFNγ含量。
2.7 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测胞葬骨架重排相关因子RhoA、ROCK1、ROCK2的mRNA表达使用Trizol法对主动脉样品匀浆，以12 000× g离心15 min提取组织总RNA，紫外分光光度计法测定OD260，样品浓度计算公式为：RNA浓度（μg/μL）=OD260×40×稀释倍数/1 000。使用反转录试剂盒获得cDNA，计算水、SYBRmix、引物R和F用量，并分别加到EP管中混匀；在8连管加入18 μL上述混合液；再向每孔中加入2 μL cDNA，混匀、离心；将8连管放入PCR扩增仪，检测初始模板量，根据内参表达水平校准后获得相应基因表达水平。目的基因RhoA、ROCK1、ROCK2和内参基因β-actin引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。
| 名称 | 序列（5’ to 3’） | 扩增长度（bp） |
| β-actin | 正向：GTACTCTGTGTGGATCGGTGG | 141 |
| 反向：GCAGCTCAGTAACAGTCCG | ||
| RhoA | 正向：ACTGGTGATTGTTGGTGATGGA | 86 |
| 反向：GCACATAGACCTCTGGGAACTG | ||
| ROCK1 | 正向：GCCTGATAACATGCTGCTGGAT | 108 |
| 反向：CCAACTGCTGTGTCACATCGTA | ||
| ROCK2 | 正向：AACCCAGGCAGAAAGTTCCAAA | 87 |
| 反向：GCAGTCTCAAGCAGGCAGTT |
分别收集各组主动脉组织，用RIPA裂解液处理组织并提取蛋白，测量其浓度；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），通过半干转膜法将蛋白转移到NC膜；将NC膜在5% BSA室温环境下封闭1 h；加入一抗，置于摇床上室温孵育2 h；回收一抗，1×磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗膜8 min×3次；彻底吸净PBST后加入二抗，室温置于摇床孵育1 h；再用1×PBST洗膜8 min×3次；向膜上滴加ECL试剂，曝光拍照。
2.9 统计学方法采用SPSS28.0软件进行统计学分析，计量资料均符合正态分布，用均数±标准差（x±s）表示。经Levene检验，若方差齐多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；若方差不齐多组间采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Games-Howell法。P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 各组小鼠一般生存情况比较空白组小鼠精神状态良好，毛发充足且色泽良好，饮食正常，最终存活10只，死亡2只。模型组小鼠注射链脲佐菌素（STZ）造模后，出现精神萎靡、形体消瘦、气喘、行动减少、毛色黄、耳鼻唇舌颜色淡白、大便黏滞松软等表现，最终存活6只，死亡6只。与模型组比较，TZQ中、高剂量组小鼠消瘦、气喘更轻，肢体活动更自如。最终中、高剂量组均存活8只、死亡4只。模型组小鼠生存率为50.00%，空白组生存率为83.33%，中、高剂量组生存率为66.67%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
| mmol/L | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 随机血糖 | TC | TC | HDL-C | LDL-C | |||||||||||||||||||||||
| 对照组 | 11 | 7.93±0.22 | 1.84±0.13 | 8.41±0.98 | 1.04±0.04 | 5.26±0.28 | |||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 6 | 27.97±1.85** | 5.71±0.88** | 35.55±1.87** | 1.00±0.03 | 29.17±1.74** | |||||||||||||||||||||||
| 中剂量组 | 8 | 20.65±3.30**## | 4.19±0.36**## | 33.57±1.41** | 1.04±0.03 | 24.38±0.85**## | |||||||||||||||||||||||
| 高剂量组 | 8 | 18.53±1.62**## | 3.56±0.32**##△ | 28.66±1.97**##△△ | 1.05±0.01# | 17.76±1.07**##△△ | |||||||||||||||||||||||
| 注：与对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；与中剂量组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
与对照组相比，其余各组小鼠随机血糖和TG、TC、LDL-C水平均明显升高（P＜0.01）；HDL-C无明显变化（P＞0.05）。与模型组相比，TZQ中剂量组小鼠随机血糖、TG、LDL-C降低（P＜0.01）；TZQ高剂量组小鼠随机血糖、TG、TC、LDL-C降低（P＜0.01），HDL-C升高（P＜0.05）。中、高剂量组TG、TC、LDL-C差异比较具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表 2。
3.3 小鼠主动脉组织病理学形态观察结果 3.3.1 全主动脉油红O染色观察对模型组与中剂量组小鼠进行全主动脉油红O染色，发现与模型组小鼠相比，而TZQ中剂量组主动脉斑块数量和面积减小。见图 1。
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| 图 1 各组小鼠全主动脉油红O染色比较 Fig. 1 Comparison of Oil red O staining of mice in each group |
对小鼠主动脉根部进行油红O染色。发现与对照组相比，模型组小鼠出现斑块及脂质沉积的面积更大（P＜0.01）。与模型组相比，TZQ高剂量组主动脉根斑块面积及脂质沉积减少（P＜0.01）。高剂量组较中剂量组对斑块的改善作用更加显著（P＜0.05）。见图 2、表 3。
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| 图 2 各组小鼠主动脉根组织斑块及脂质沉积（油红O染色，×200） Fig. 2 Oil red O staining of aortic root of mice in each group(Oil red O staining, ×200) |
| 组别 | 动物数 | 斑块面积 |
| 对照组 | 3 | 0.00±0.00 |
| 模型组 | 3 | 1.00±0.34** |
| 中剂量组 | 3 | 0.69±0.15* |
| 高剂量组 | 3 | 0.08±0.97##△ |
| 注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，##P < 0.01；与中剂量组比较，△P < 0.05。斑块面积以对照组为标准进行均一化。 | ||
HE染色结果表明，模型组小鼠主动脉粥样斑块形成，内膜受损，有大量胆固醇结晶堆积，纤维帽下形成坏死核心，表明成功构建糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型。而与模型组相比，TZQ中、高剂量主动脉斑块及坏死核心的形成均减少。见图 3。
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| 图 3 各组小鼠主动脉根组织病理变化（HE染色，×400） Fig. 3 Histopathological morphology of aortic rootof mice in each group(HE staining, ×400) |
与对照组比较，模型组炎症因子CRP、TNF-α、IFN-γ表达水平明显上升（P＜0.01）；与模型组比较，中剂量组CRP表达水平下降（P＜0.01），高剂量组CRP、TNF-α、IFN-γ表达水平下降（P＜0.01）；与中剂量组比较，高剂量组CRP、TNF-α、IFN-γ表达水平下降明显（P＜0.05或P＜0.01）。见图 4、表 4。
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| 注：与对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，##P < 0.01。 图 4 各组小鼠血清CRP、TNF-α、IFN-γ含量（x±s） Fig. 4 Serum CRP, TNF-α and IFN-γ content of mice in each group(x±s) |
| ng/L | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | CRP | TNF-α | IFN-γ | |||||||||||||||||||||||||
| 对照组 | 11 | 646.82±28.75 | 525.43± 3.79 | 430.62± 7.08 | |||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 6 | 852.29±30.43** | 641.01±37.36** | 596.32±20.41** | |||||||||||||||||||||||||
| 中剂量组 | 8 | 757.37±57.28**## | 612.59±29.60** | 542.45±66.77** | |||||||||||||||||||||||||
| 高剂量组 | 8 | 693.07±50.01##△ | 566.11±34.36*##△△ | 466.62±54.43##△△ | |||||||||||||||||||||||||
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与中剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
与对照组相比，模型组小鼠主动脉RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达均明显升高（P＜0.01），提示胞葬过程细胞骨架重排受损；与模型组相比，中剂量组ROCK1 mRNA表达降低（P＜0.05），高剂量组RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达均降低（P＜0.01），提示TZQ对DA小鼠巨噬细胞胞葬过程细胞骨架重排具有一定的改善作用；与中剂量组相比，高剂量组ROCK2 mRNA表达明显降低（P＜0.01）。见图 5、表 5。
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| 注：与对照组比较，**P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 图 5 各组小鼠主动脉RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达比较（x±s） Fig. 5 RhoA, ROCK1 and ROCK2 mRNA expression in aortic tissue of mice in each group(x±s) |
| 组别 | 动物数 | RhoA | ROCK1 | ROCK2 |
| 对照组 | 11 | 1.001±0.025 | 1.001±0.030 | 1.000±0.016 |
| 模型组 | 6 | 4.924±1.075** | 6.700±0.675** | 3.384±0.472** |
| 中剂量组 | 8 | 4.109±0.238** | 5.576±1.392**# | 2.855±0.460** |
| 高剂量组 | 8 | 3.391±0.811**## | 4.87±0.397**## | 2.157±0.569**##△△ |
| 注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与中剂量组比较，△△P＜0.01。 | ||||
与对照组比较，模型组小鼠主动脉RhoA、ROCK1、ROCK蛋白表达均升高（P＜0.05或P＜0.01），提示胞葬过程细胞骨架重排受损；与模型组比较，中、高剂量组ROCK2蛋白表达明显降低（P＜0.01），提示TZQ对DA小鼠巨噬细胞胞葬过程细胞骨架重排具有一定的改善作用。见图 6、表 6。
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| 图 6 各组小鼠主动脉RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白电泳图 Fig. 6 Electrophoresis of RhoA, ROCK1 and ROCK2 proteins in aorta tissue of mice in each group |
| 组别 | 动物数 | RhoA | ROCK1 | ROCK2 |
| 对照组 | 11 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 |
| 模型组 | 6 | 2.729±0.100* | 3.805±0.748** | 3.089±0.016** |
| 中剂量组 | 8 | 1.614±0.537 | 2.549±0.739 | 1.737±0.062*## |
| 高剂量组 | 8 | 1.407±0.597 | 2.334±1.092 | 1.452±0.523## |
| 注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，##P < 0.01。 | ||||
由于人口老龄化、饮食高脂化等因素，DM患病人数迅速增长[14]。AS是DM患者死亡的主要原因[15]，寻找有效药物干预对于降低糖尿病患者群体急性心血管事件的发生率和病死率至关重要。DA具有本虚标实的病机特点，阴虚燥热为其病机之本，浊邪伏脉为其病机之标[16]。TZQ由桑叶、荷叶、山楂叶、丹参、赤芍5味药物组成，临床治疗DA效果确切。本研究表明，TZQ能够降低DA小鼠血糖、血脂以及血清炎症因子水平，通过改善DA小鼠糖脂代谢紊乱和抑制炎症，发挥抗DA作用。
胞葬是吞噬细胞清除凋亡细胞的生理过程[17]。DM会导致胞葬作用障碍，影响凋亡细胞清除[18]，加剧DA。恢复胞葬作用能够减少巨噬细胞坏死，减缓和逆转粥样硬化斑块的形成并减轻斑块的易损性[19]。因此，胞葬是DA的有效治疗靶点。细胞骨架重排是胞葬的重要环节，由具有抑制重排作用的RhoA及其下游ROCK1、ROCK2和具有促进重排作用的Rac1共同调节[20]。本研究表明，TZQ对RhoA、ROCK1和ROCK2细胞骨架重排相关因子具有调节作用，通过降低RhoA、ROCK1、ROCK mRNA及蛋白表达，改善胞葬作用，缓解DA。
综上所述，TZQ能在一定程度上减少DA小鼠主动脉粥样斑块形成，其作用机制可能是通过改善糖脂代谢紊乱及降低血清炎症因子水平，并下调细胞骨架重排相关因子RhoA、ROCK1和ROCK2的mRNA及蛋白表达实现的。但本研究仅设定了中、高中药浓度剂量的对比，比较不够充分；另外，本实验样本数量较少。后续将扩大样本量，深入探索这些因子之间相互影响的复杂网络关系，进一步明确TZQ调控胞葬改善DA的具体机制，寻找其缓解糖脂代谢紊乱以及治疗DA的关键效应靶点。
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2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
3. Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
4. Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China;
5. First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China