2025, Vol. 45文章信息
- 马欣, 江楠, 王海叶, 等.
- MA Xin, JIANG Nan, WANG Haiye, et al.
- 穿心莲内酯通过激活NRF2/HO-1信号通路减轻膝骨关节炎大鼠软骨损伤的研究
- Andrographolide reduces cartilage damage in rats with knee osteoarthritis by activating the NRF2/HO-1 signaling pathway
- 天津中医药, 2025, 45(12): 1575-1583
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 45(12): 1575-1583
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.12.13
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文章历史
- 收稿日期: 2025-09-22
2. 邯郸市第二医院，邯郸 056001
骨关节炎主要表现为软骨退化和炎症，以膝骨关节炎（KOA）最为常见。据统计，中国KOA患病率达18%，女性（19%）高于男性（11%）；而55岁以上人群和65岁以上人群KOA影像学改变检出率分别高达60%和85%[1]。软骨组织受损是KOA主要病理特征之一，而氧化应激、炎症以及细胞凋亡是推动KOA发生发展的重要因素[2-3]。由核因子E2相关因子2（NRF2）及其下游蛋白血红素加氧酶-1（HO-1）组成的信号通路在氧化应激、炎症及细胞凋亡等病理调控机制中发挥作用，动物体内和体外细胞实验证实通过激活NRF2/HO-1信号通路可减轻KOA软骨损伤[4-5]。因此，NRF2/HO-1信号通路可作为KOA软骨损伤治疗药物的靶点。
KOA归属中医“痹证”“骨痹”“痿痹”范畴，病机在于肝肾亏虚、经络痹阻、气血凝滞、筋骨失养等，治疗当以补益肝肾、活血通络、强筋健骨为主。穿心莲为爵床科穿心莲属一年生草本植物，其药用价值首载于《岭南采药录》，味苦性寒，具有清热解毒、消炎退肿等功效。现代药理学研究发现，穿心莲具有调节免疫、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、改善血液循环等作用，有效成分包括二萜内酯类、黄酮类、生物碱类化合物，其中二萜内酯类化合物穿心莲内酯研究最深入且应用最广泛[6]。研究证实，穿心莲内酯具有促进骨折愈合、减轻骨关节炎大鼠疼痛和炎症的作用[7-8]；对NRF2/HO-1信号通路具有激活作用[9-10]。但穿心莲内酯对KOA软骨损伤是否具有保护作用尚未见文献报道。氨基葡萄糖是临床治疗KOA的一线用药，对KOA软骨损伤具有保护作用，并且能够调节NRF2/HO-1信号通路[11]。鸦胆子苦醇是从苦木科植物鸦胆子的种子中提取的一种苦木素类化合物，是NRF2特异性抑制剂，研究证实鸦胆子苦醇对骨关节炎大鼠NRF2/HO-1信号通路具有抑制作用[12]。前期预实验结果显示，穿心莲内酯对KOA大鼠行为学表现和软骨损伤具有改善作用，且该作用具有一定的剂量依赖性。本研究通过构建KOA大鼠模型，选择氨基葡萄糖作为阳性对照药物，探讨穿心莲内酯对KOA大鼠软骨损伤的影响；并通过设置穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组，探讨其作用机制与NRF2/HO-1信号通路的相关性。
1 材料 1.1 实验动物51只8周龄，体质量200~240 g的SPF级雄性SD大鼠，购自河北医科大学实验动物学部，许可证号：SCXK（冀）2022-001。在室内温度22~25 ℃、相对湿度45%~65%、每天光照12 h的控制环境中饲养，自由摄食饮水。本实验获得邯郸市中心医院伦理委员会批准[伦理批号：HDZXLL（K）2024-015]。
1.2 主要试剂与仪器穿心莲内酯（纯度≥98%，货号B20207）、氨基葡萄糖（纯度≥98%，货号S11028）、鸦胆子苦醇（NRF2抑制剂，纯度≥98%，货号B26016）、L-半胱氨酸（货号S20027），购于上海源叶公司；木瓜蛋白酶（货号G8430）和苏木精-伊红（HE，货号G1125）、番红O-固绿（货号G1371）、原位末端标记法（TUNEL，货号G4891）染色试剂盒，购于北京索莱宝公司；总超氧化物歧化酶（T-SOD，货号JM-02137R2）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，货号JM-02173R2）试剂盒，购于江苏晶美公司；过氧化氢酶（CAT，货号KS18163）、丙二醛（MDA，货号KS13297）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，货号KS13202）、白细胞介素-1β（IL-1β，货号KS10760）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1，货号KS11450）试剂盒，购于上海科顺公司；放射免疫沉淀法（RIPA）组织裂解液（货号W062-1-1），购于南京建成研究所；NRF2（货号AF0639）、HO-1（货号AF5393）、核因子-κB p65（NF-κB p65，货号AF5006）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2，货号AF6139）、Bcl-2相关X蛋白（Bax，货号AF0120）、激活型半胱氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3，货号AF7022）、β-肌动蛋白（β-actin，货号AF7018）抗体和免疫球蛋白G（IgG）二抗（货号S0001），购于美国Affinity公司。Von Frey电子测痛仪，购于中国科学院生物医学工程研究所；ZH-6C型冷热板测痛仪，购于安徽正华公司；iMark型酶标仪，购于美国Bio-Rad公司；NP80型分光光度计，购于德国Nano Photomete公司；JB-P5型石蜡包埋机，购于武汉俊杰公司；RM2235型石蜡切片机，购于上海徕卡公司；5424R型高速低温离心机，购于德国Eppendorf公司；DYY-8C型电泳仪、DYCZ-40G型转膜仪，购于北京六一公司。
2 方法 2.1 分组、造模及给药将51只大鼠随机分为正常组（8只）和造模组（43只）。造模组按照文献[13]报道的方法构建KOA大鼠模型：取浓度4%的木瓜蛋白酶溶液和浓度0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液制备混合液，按体积比2∶1的比例制备混合液，腹腔注射戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉大鼠后，剪除右膝关节部位毛发，碘伏消毒，屈曲45度以髌骨下级髌腱外缘进针向关节腔注射0.15 mL混合液，隔3 d后重复注射1次。造模完成后，出现膝关节肿胀、局部疼痛及Lequesne MG评分≥3分，则认定造模成功[14]。共造模成功41只，造模成功率为95.35%。随机去除1只成模大鼠后，将剩余40只成模大鼠随机分为5组：模型组、氨基葡萄糖组、穿心莲内酯低剂量组、穿心莲内酯高剂量组和穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组，每组8只。根据《药理实验方法学》成人等效剂量折算系数确定给药剂量，氨基葡萄糖组灌胃130 mg/kg氨基葡萄糖，穿心莲内酯低、高剂量组分别灌胃30、60 mg/kg穿心莲内酯，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组灌胃60 mg/kg穿心莲内酯和2 mg/kg鸦胆子苦醇[15-16]，正常组和模型组灌胃生理盐水，每天1次，连续治疗4周。
2.2 Lequesne MG评分评估大鼠行为学表现Lequesne MG评分为局部疼痛、步态变化、膝关节活动范围、关节肿胀状况四方面评分之和[17]。局部疼痛评分：无疼痛计0分；右后肢收缩计1分；右后肢收缩、痉挛且伴有轻度全身反应计2分；右后肢剧烈收缩，出现痉挛、挣扎并伴有异常叫声计3分。步态变化评分：步态正常计0分；轻度跛行计1分；明显跛行计2分；不能接触地面或拖地行走计3分。膝关节活动范围评分：90度以上计0分；45~90度计1分；15~45度计2分；15度以下计3分。关节肿胀状况评分：未见肿胀计0分；轻度肿胀计1分；明显肿胀计2分。Lequesne MG评分越高说明膝关节功能损伤越严重。由3名实验人员独立评分，取均值。
2.3 Von Frey实验、热板实验测定机械痛阈值（PWMT）和热痛阈值（PWTL）将大鼠放在Von Frey实验装置平台上，等待大鼠平静后，将测痛仪的纤维丝置于右后足底下方，启动仪器后纤维丝恒速前移并刺激足底，记录大鼠出现后足移动或舔足反应时的数值，即为PWMT，重复测定3次（间隔5 min），取均值。设置冷热板测痛仪温度为55 ℃，将大鼠置于热板上，记录大鼠接触热板到出现抬足或舔足反应的时间，即为PWTL，重复测定3次（间隔10 min），取均值。
2.4 酶联免疫吸附法（ELISA）检测膝关节液中T-SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA、TNF-α、IL-1β、MCP-1含量麻醉后，剪除右膝关节部位毛发，碘伏消毒，向膝关节腔内注射1 mL生理盐水并缓慢活动膝关节15次后，用注射器抽取关节液，3 500 r/min离心10 min（离心半径10 cm）分离上清液，按试剂盒说明通过酶标仪测定T-SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA、TNF-α、IL-1β、MCP-1含量。
2.5 HE、番红O-固绿染色法考察软骨组织病理学改变及Mankin’s评分颈椎脱臼法处死大鼠后，取部分右膝关节软骨组织，用10%中性甲醛固定2 d后用EDTA脱钙液处理7 d，石蜡包埋软骨组织、连续5 μm切片后进行HE染色和番红O-固绿染色，显微镜下观察软骨组织病理学改变。Mankin’s评分为软骨组织结构、潮线完整性、基质着色、软骨细胞4个方面评分之和[18]。软骨组织结构评分：表面光滑计0分，表面出现不规则裂痕计1分，裂痕深度达到移行层、辐射层、钙化层分别计2、3、4分，软骨层脱落计5分。潮线完整性评分：未见异常计0分，呈多重潮线计1分，可见软骨下血管入侵计2分，中度、重度减退分别计3、4分。基质着色评分：着色正常计0分，轻度、中度、重度减低分别计1、2、3分。软骨细胞评分：未见异常计0分，弥漫性增多计1分，出现多个簇状细胞团计2分。Mankin’s评分越高说明软骨组织病变越严重。由3名实验人员独立评分，取均值。
2.6 TUNEL染色法考察细胞凋亡情况及凋亡指数（AI）计算取“2.5”项下膝关节软骨组织石蜡切片，脱蜡处理后行TUNEL染色，显微镜下观察细胞凋亡。取5个视野内细胞数均值计算AI，AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
2.7 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测软骨组织中NRF2/HO-1信号通路相关蛋白表达取100 mg右膝关节软骨组织提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳（80 V、30 min，120 V、60 min）分离、转膜（80 V、120 min）、封闭处理后，加一抗稀释液NRF2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Cleaved Caspase-3（1∶1 000）和内参稀释液β-actin（1∶3 000）4 ℃孵育过夜，次日加二抗稀释液IgG（1∶5 000）37 ℃孵育1 h，化学发光显影后用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参进行半定量分析。
2.8 统计学方法结合课题前期预实验和样本量估算方法[19]，本实验每组纳入8只大鼠，可以满足统计效能和结果可靠性。实验数据运用SPSS 20.0进行统计分析。计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
3 结果 3.1 穿心莲内酯对KOA大鼠Lequesne MG评分和PWMT、PWTL的影响相较于正常组，模型组Lequesne MG评分升高，PWMT和PWTL降低（P < 0.05）。相较于模型组，氨基葡萄糖组和穿心莲内酯低、高剂量组Lequesne MG评分降低，PWMT和PWTL升高（P < 0.05）；穿心莲内酯高剂量组上述作用优于穿心莲内酯低剂量组（P < 0.05）。相较于氨基葡萄糖组，穿心莲内酯低剂量组Lequesne MG评分升高，PWMT和PWTL降低（P < 0.05）；穿心莲内酯高剂量组Lequesne MG评分降低，PWMT和PWTL升高（P < 0.05）。相较于穿心莲内酯高剂量组，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组Lequesne MG评分升高，PWMT和PWTL降低（P < 0.05）。见表 1。
| 组别 | 动物数 | Lequesne MG评分（分） | PWMT（g） | PWTL（s） |
| 正常组 | 8 | 0.47±0.05 | 25.08±3.13 | 13.65±1.87 |
| 模型组 | 8 | 7.62±0.94* | 6.19±0.75* | 5.38±0.70* |
| 氨基葡萄糖组 | 8 | 4.91±0.62# | 15.27±1.94# | 8.20±1.15# |
| 穿心莲内酯低剂量组 | 8 | 6.30±0.87#△ | 8.82±1.06#△ | 6.21±0.83#△ |
| 穿心莲内酯高剂量组 | 8 | 3.74±0.50#△▲ | 18.05±2.31#△▲ | 9.97±1.28#△▲ |
| 穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组 | 8 | 5.36±0.61 & | 12.93±1.58 & | 7.46±1.02 & |
| 注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与氨基葡萄糖组比较，△P < 0.05；与穿心莲内酯低剂量组比较，▲P < 0.05；与穿心莲内酯高剂量组比较，& P < 0.05。 | ||||
相较于正常组，模型组T-SOD、GSH-Px、CAT活性降低，MDA含量升高（P < 0.05）。相较于模型组，氨基葡萄糖组和穿心莲内酯低、高剂量组T-SOD、GSH-Px、CAT活性升高，MDA含量降低（P < 0.05）；穿心莲内酯高剂量组上述作用优于穿心莲内酯低剂量组（P < 0.05）。相较于氨基葡萄糖组，穿心莲内酯低剂量组T-SOD活性降低、MDA含量升高（P < 0.05），GSH-Px、CAT活性差异无统计学意义（P > 0.05）；穿心莲内酯高剂量组T-SOD、GSH-Px、CAT活性升高，MDA含量降低（P < 0.05）。相较于穿心莲内酯高剂量组，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组T-SOD、GSH-Px、CAT活性降低，MDA含量升高（P < 0.05）。见表 2。
| 组别 | 动物数 | T-SOD（U/mL） | GSH-Px（U/mL） | CAT（U/mL） | MDA（nmol/mL） |
| 正常组 | 8 | 224.71±27.09 | 156.80±20.14 | 84.69±11.25 | 1.46±0.17 |
| 模型组 | 8 | 98.35±14.27* | 72.91±10.85* | 33.24± 4.60* | 5.03±0.81* |
| 氨基葡萄糖组 | 8 | 152.49±21.62# | 94.35±12.71# | 56.38± 8.09# | 2.67±0.32# |
| 穿心莲内酯低剂量组 | 8 | 129.66±15.83#△ | 90.74±11.27# | 51.20± 6.15# | 3.45±0.41#△ |
| 穿心莲内酯高剂量组 | 8 | 201.84±28.62#△▲ | 122.76±15.94#△▲ | 73.09±10.05#△▲ | 1.76±0.23#△▲ |
| 穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组 | 8 | 165.25±23.04 & | 102.80±13.65 & | 59.47± 8.30 & | 2.40±0.29 & |
| 注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与氨基葡萄糖组比较，△P < 0.05；与穿心莲内酯低剂量组比较，▲P < 0.05；与穿心莲内酯高剂量组比较，& P < 0.05。 | |||||
相较于正常组，模型组TNF-α、IL-1β、MCP-1含量升高（P < 0.05）。相较于模型组，氨基葡萄糖组和穿心莲内酯低、高剂量组TNF-α、IL-1β、MCP-1含量降低（P < 0.05）；穿心莲内酯高剂量组上述作用优于穿心莲内酯低剂量组（P < 0.05）。相较于氨基葡萄糖组，穿心莲内酯低剂量组TNF-α、IL-1β、MCP-1含量差异无统计学意义（P > 0.05）；穿心莲内酯高剂量组TNF-α、IL-1β、MCP-1含量降低（P < 0.05）。相较于穿心莲内酯高剂量组，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组TNF-α、IL-1β、MCP-1含量升高（P < 0.05）。见表 3。
| pg/mL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | TNF-α | IL-1β | MCP-1 | |||||||||||||||||||||||||
| 正常组 | 8 | 52.04± 6.16 | 23.91±2.74 | 110.30± 9.25 | |||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 8 | 91.47±11.53* | 58.76±7.82* | 236.68±29.04* | |||||||||||||||||||||||||
| 氨基葡萄糖组 | 8 | 72.93± 8.81# | 46.14±6.59# | 193.50±24.62# | |||||||||||||||||||||||||
| 穿心莲内酯低剂量组 | 8 | 78.50± 9.37# | 49.86±6.50# | 201.57±25.31# | |||||||||||||||||||||||||
| 穿心莲内酯高剂量组 | 8 | 60.56± 7.24#△▲ | 36.94±4.81#△▲ | 154.79±19.63#△▲ | |||||||||||||||||||||||||
| 穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组 | 8 | 73.19± 8.46 & | 45.03±6.12 & | 180.42±21.89 & | |||||||||||||||||||||||||
| 注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与氨基葡萄糖组比较，△P < 0.05；与穿心莲内酯低剂量组比较，▲P < 0.05；与穿心莲内酯高剂量组比较，& P < 0.05。 | |||||||||||||||||||||||||||||
HE染色结果显示：正常组软骨组织形态结构未见异常；模型组出现软骨组织厚度变薄、表层缺损、基质着色不均匀性减低、细胞数量减少且排列失序、炎性细胞浸润等病理学改变。番红O-固绿染色结果显示：正常组软骨组织形态正常，结构清晰；模型组出现软骨层退化、番红失染面积增大（提示蛋白聚糖丢失）、潮线不清、多处断裂等病理学改变。相较于模型组，氨基葡萄糖组和穿心莲内酯低、高剂量组软骨组织上述病变不同程度减轻，穿心莲内酯高剂量组效果优于氨基葡萄糖组和穿心莲内酯低剂量组；相较于穿心莲内酯高剂量组，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组软骨组织病变程度加重。Mankin’s评分结果：相较于正常组，模型组Mankin’s评分升高（P < 0.05）；相较于模型组，氨基葡萄糖组和穿心莲内酯低、高剂量组Mankin’s评分降低（P < 0.05），穿心莲内酯高剂量组上述作用优于穿心莲内酯低剂量组（P < 0.05）；相较于氨基葡萄糖组，穿心莲内酯低剂量组Mankin’s评分升高（P < 0.05），穿心莲内酯高剂量组Mankin’s评分降低（P < 0.05）；相较于穿心莲内酯高剂量组，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组Mankin’s评分升高（P < 0.05）。见图 1、表 4。
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| 注：图A，大鼠软骨组织HE染色结果；图B，大鼠软骨组织番红O-固绿染色结果。×200，刻度尺：100 μm。 图 1 各组大鼠软骨组织病理学改变 Fig. 1 Histopathological changes in cartilage tissue of rats in each group |
| 组别 | 动物数 | Mankin’s评分（分） | AI（%） |
| 正常组 | 8 | 0.48±0.05 | 3.71±0.42 |
| 模型组 | 8 | 8.33±1.14* | 35.48±5.06* |
| 氨基葡萄糖组 | 8 | 4.19±0.60# | 13.54±1.82# |
| 穿心莲内酯低剂量组 | 8 | 6.37±0.82#△ | 27.62±4.31#△ |
| 穿心莲内酯高剂量组 | 8 | 2.97±0.43#△▲ | 10.90±1.65#△▲ |
| 穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组 | 8 | 4.50±0.67 & | 22.85±3.63 & |
| 注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与氨基葡萄糖组比较，△P < 0.05；与穿心莲内酯低剂量组比较，▲P < 0.05；与穿心莲内酯高剂量组比较，& P < 0.05。 | |||
TUNEL染色结果显示：正常组软骨组织可见极少量散在分布的凋亡细胞；相较于正常组，模型组凋亡细胞数量明显增多，AI升高（P < 0.05）。相较于模型组，氨基葡萄糖组和穿心莲内酯低、高剂量组凋亡细胞数量不同程度减少，AI降低（P < 0.05）；穿心莲内酯高剂量组上述作用优于穿心莲内酯低剂量组（P < 0.05）。相较于氨基葡萄糖组，穿心莲内酯低剂量组凋亡细胞数量明显增多，AI升高（P < 0.05）；穿心莲内酯高剂量组凋亡细胞数量明显减少，AI降低（P < 0.05）。相较于穿心莲内酯高剂量组，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组凋亡细胞数量明显增多，AI升高（P < 0.05）。见图 2、表 4。
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| 图 2 各组大鼠软骨细胞凋亡状况（TUNEL染色，×400，刻度尺：100 μm） Fig. 2 Apoptosis status of chondrocytes of rats in each group(TUNEL staining, ×400, scale: 100 μm) |
相较于正常组，模型组NRF2、HO-1、Bcl-2表达水平降低，NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2升高（P < 0.05）。相较于模型组，氨基葡萄糖组和穿心莲内酯低、高剂量组NRF2、HO-1、Bcl-2表达水平升高，NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2降低（P < 0.05）；穿心莲内酯高剂量组上述作用优于穿心莲内酯低剂量组（P < 0.05）。相较于氨基葡萄糖组，穿心莲内酯低剂量组NRF2、HO-1、Bcl-2表达水平降低，NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2升高（P < 0.05）；穿心莲内酯高剂量组NRF2、HO-1、Bcl-2表达水平升高，NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2降低（P < 0.05）。相较于穿心莲内酯高剂量组，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组NRF2、HO-1、Bcl-2表达水平降低，NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2升高（P < 0.05）。见图 3、表 5。
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| 注：A，正常组；B，模型组；C，氨基葡萄糖组；D，穿心莲内酯低剂量组；E，穿心莲内酯高剂量组；F，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组。 图 3 各组大鼠软骨组织中NRF2、HO-1、NF-κB p65、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达 Fig. 3 Expression of NRF2, HO-1, NF-κB p65, Bcl-2, Bax, Cleaved Caspase-3 proteins in cartilage tissues of rats in each group |
| 组别 | 动物数 | NRF2/β-actin | HO-1/β-actin | NF-κB p65/β-actin | Bcl-2/β-actin | Bax/β-actin | Bax/Bcl-2 | Cleaved Caspase-3/β-actin |
| 正常组 | 8 | 0.97±0.15 | 1.24±0.21 | 0.41±0.08 | 1.03±0.17 | 0.08±0.02 | 0.08±0.03 | 0.11±0.03 |
| 模型组 | 8 | 0.18±0.04* | 0.20±0.04* | 1.32±0.25* | 0.21±0.03* | 1.07±0.18* | 4.77±0.86* | 0.98±0.17* |
| 氨基葡萄糖组 | 8 | 0.57±0.10# | 0.38±0.07# | 0.74±0.13# | 0.51±0.09# | 0.71±0.12# | 1.39±0.24# | 0.53±0.10# |
| 穿心莲内酯低剂量组 | 8 | 0.31±0.05#△ | 0.28±0.05#△ | 0.96±0.14#△ | 0.26±0.04#△ | 0.86±0.14#△ | 3.56±0.71#△ | 0.79±0.12#△ |
| 穿心莲内酯高剂量组 | 8 | 0.88±0.14#△▲ | 0.98±0.17#△▲ | 0.53±0.10#△▲ | 0.82±0.15#△▲ | 0.27±0.05#△▲ | 0.33±0.07#△▲ | 0.17±0.04#△▲ |
| 穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组 | 8 | 0.50±0.10 & | 0.67±0.13 & | 0.94±0.15 & | 0.41±0.08 & | 0.35±0.06 & | 0.85±0.15 & | 0.34±0.06 & |
| 注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与氨基葡萄糖组比较，△P < 0.05；与穿心莲内酯低剂量组比较，▲P < 0.05；与穿心莲内酯高剂量组比较，& P < 0.05。 | ||||||||
软骨损伤是KOA发生和进行性加重的核心病理特征，目前临床上主要通过抗炎、消肿、止痛等方案改善患者症状，但不能有效逆转软骨损伤及KOA进展，并且长期用药还可能出现肝肾损伤、恶心呕吐、腹泻等不良反应。因此，寻找更加安全有效的KOA治疗方案具有重要临床意义。
近年来，中草药活性提取物在防治KOA方面表现出良好效果，引发广泛关注。穿心莲内酯是中药穿心莲的主要活性成分之一，属于二萜内酯类化合物。王荣亮[8]和Wang等[20]研究发现穿心莲内酯能够减轻KOA大鼠滑膜组织炎症，缓解其疼痛症状；Chen等[21]发现穿心莲内酯能够减轻KOA小鼠细胞自噬和基质降解，保持关节周围骨量。但是，穿心莲内酯是否对KOA软骨损伤具有保护作用及其机制尚未明确。因此，本研究将探讨穿心莲内酯对KOA大鼠软骨损伤的影响，并基于NRF2/HO-1信号通路探讨其潜在机制。本实验采用膝关节腔内注射木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合液的方法构建KOA大鼠模型，结果显示KOA模型大鼠Lequesne MG评分升高，PWMT和PWTL降低，软骨组织出现厚度变薄、表层缺损、细胞数量减少且排列失序、炎性细胞浸润等病理学改变，与刘杨等[17]报道一致。经穿心莲内酯或氨基葡萄糖治疗4周，能够明显降低大鼠Lequesne MG评分，升高PWMT和PWTL，明显改善软骨组织病理学改变并降低Mankin’s评分；穿心莲内酯高剂量组对Lequesne MG评分、PWMT、PWTL、软骨组织病理学改变及降低Mankin’s评分的调节作用优于穿心莲内酯低剂量组和氨基葡萄糖组。说明穿心莲内酯具有减轻KOA大鼠软骨损伤，改善膝关节行为学和疼痛症状的作用，且该作用具有一定的剂量依赖性。
KOA发病机制非常复杂，其中氧化应激、炎症及细胞凋亡与软骨损伤关系密切。研究[22]发现KOA病理状态下活性氧（ROS）大量生成，导致内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT等被过度消耗，破坏ROS动态平衡，过剩的ROS将攻击软骨组织细胞的生物膜、结构蛋白、核酸等造成氧化应激损伤，引发细胞凋亡，并且具有细胞毒性的MDA为过氧化产物之一。受损的软骨细胞等将诱导中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等聚集并大量分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1等炎症因子，这是炎症反应及KOA发生发展的重要因素。本实验结果显示，经穿心莲内酯或氨基葡萄糖治疗4周，能够明显提高KOA大鼠膝关节液中T-SOD、GSH-Px、CAT活性，明显降低MDA、TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和软骨细胞AI；穿心莲内酯高剂量组对T-SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA、TNF-α、IL-1β、MCP-1含量以及AI的调节作用优于穿心莲内酯低剂量组和氨基葡萄糖组。说明穿心莲内酯可能通过抑制氧化应激、炎症、细胞凋亡而对KOA大鼠软骨损伤起到保护作用，且上述作用具有一定的剂量依赖性。
NRF2/HO-1信号通路参与调控氧化应激、炎症、细胞凋亡等病理过程，NRF2作为细胞氧化应激反应的重要传感器，能够通过诱导SOD、GSH-Px、CAT等内源性抗氧化酶转录表达而调节氧化还原稳态；NRF2下游蛋白HO-1可催化血红素降解并生成一氧化碳、Fe2+等抗氧化剂，进而提高机体抗氧化能力[23]。NF-κB是炎症反应的关键调节因子，核转位后其p65亚基N末端的Rel同源结构域与DNA的κB位点结合可诱导TNF-α、IL-1β等炎症因子转录表达，促进炎症反应。Bcl-2蛋白家族参与调控细胞线粒体凋亡途径，受到凋亡信号刺激后，定位于细胞质的Bcl-2、Bax向线粒体外膜转移，Bax形成同源寡聚体后插入线粒体膜，导致线粒体膜通透性转运孔异常开放，使得细胞色素C释放进入细胞质后剪切活化Caspase-3，触发细胞凋亡；Bcl-2则能够与Bax免疫共沉淀而抑制Bax促凋亡活性，所以Bax/Bcl-2比值能够反映线粒体凋亡状态[24]。研究发现，NRF2/HO-1信号通路通过影响NF-κB核转位而抑制其介导的炎症反应[25]；通过上调Bcl-2表达并下调Bax表达而抑制细胞凋亡[26]。本实验结果显示，经穿心莲内酯或氨基葡萄糖治疗4周，能够明显提高KOA大鼠软骨组织中NRF2、HO-1、Bcl-2表达水平，降低NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2比值；穿心莲内酯高剂量组对NRF2、HO-1、Bcl-2、Bax、NF-κB p65、Cleaved Caspase-3表达及Bax/Bcl-2比值的调节作用优于穿心莲内酯低剂量组和氨基葡萄糖组。推断穿心莲内酯对KOA大鼠氧化应激、炎症、细胞凋亡的抑制作用可能与其激活NRF2/HO-1信号通路有关。为了验证上述推断，本实验设置了穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组，结果显示，穿心莲内酯高剂量+鸦胆子苦醇组对KOA大鼠Lequesne MG评分、PWMT、PWTL、软骨组织病理学改变、Mankin’s评分、氧化应激、炎症、细胞凋亡以及NRF2/HO-1信号通路相关蛋白表达的调节作用明显弱于穿心莲内酯高剂量组。从而进一步验证了穿心莲内酯对KOA大鼠软骨损伤的保护作用与其激活NRF2/HO-1信号通路有关的推断。
综上所述，穿心莲内酯可能通过激活NRF2/HO-1信号通路减轻氧化应激、炎症反应和细胞凋亡，对KOA大鼠软骨损伤起到保护作用。本研究结果为穿心莲内酯用作KOA治疗备选药物提供了一定的理论基础。本研究尚存在一定的局限性，本实验样本量较小、指标检测时间点单一、仅进行了动物体内实验，课题组未来将完善实验设计，扩大样本量，丰富检测时间点以探索最佳疗程，并结合体外细胞实验继续探讨穿心莲内酯对KOA的作用机制。
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