2025, Vol. 42文章信息
- 刘阳, 林文涵, 李雯雯, 等.
- LIU Yang, LIN Wenhan, LI Wenwen, et al.
- 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的冠心静化学成分分析
- Identification of chemical constituents in Guanxinjing based on UPLC-Q-TOF-MS/MS technology
- 天津中医药, 2025, 42(3): 337-342
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(3): 337-342
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.03.12
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文章历史
- 收稿日期: 2024-12-09
2. 天津中医药大学第一附属医院, 天津 300193;
3. 保定中药制药股份有限公司, 安国 071205
冠心静是临床常用的治疗冠心病的中药复方制剂, 全方由丹参、赤芍、川芎、红花、玉竹、三七、人参、苏合香和冰片9味中药组合而成, 具有通脉益气、安神定志、活血化瘀之功效[1]。长期临床实践证明其可明显改善冠心病及心绞痛的常见症状[2-5], 且临床经验表明无不良反应的发生, 用药安全。
中药复方中化学成分的复杂性是导致其药效物质基础无法被清晰阐明的重要原因[6], 故分析复杂的化学物质体系是研究复方药效物质基础的重要前提。目前, 对冠心静全方较为系统的化学成分方面的报道较少[7-8], 多以方中单一成分的研究为主[9-13], 因此, 有必要对冠心静的化学成分进行全面、系统的研究。
超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱技术凭借高灵敏度、高分辨率、快速、简便等优势已被广泛应用于复杂体系的定性分析。本研究采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法(UPLC-Q-TOF-MS/MS), 通过质谱处理、标准品比对、文献比对、谱库检索等分析过程, 对冠心静中的主要化学成分进行快速识别, 为揭示冠心静的化学物质基础提供参考。
1 材料 1.1 仪器与试剂Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司); Agilent Q-TOF 6520质谱仪(美国Agilent公司); Agilent MassHunter分析软件(美国Agilent公司); Milli-Q IQ 7005超纯水制备仪(Millipore公司); S0200涡旋混合器(美国Labnet公司); 5424 R型高速离心机(德国Eppendorf公司); ZZ-L6DT超声波清洗槽(天津知著科技有限公司); A 60/220.R2型十万分之一天平(波兰Radwag公司)。乙腈(色谱纯)购自Fisher公司; 甲酸(色谱纯)购自美国ROE公司; 超纯水由Milli-Q超纯水制备仪制备。
1.2 试药对照品人参皂苷Rb1(批号: DST180131-006, 纯度≥ 98%)、人参皂苷Rd(批号: DST190702-015, 纯度≥ 98%)、人参皂苷Re(批号: DST180226-014, 纯度≥ 99%)、三七皂苷R1(批号: DST191025-050, 纯度≥ 98%)、丹酚酸B(批号: DSTDD000903, 纯度≥ 98%)、芍药苷(批号: DSTDS007002, 纯度≥ 98%)、迷迭香酸(批号: DST202201001, 纯度≥ 98%)、绿原酸(批号: DSTDL002102, 纯度≥ 98%)、阿魏酸(批号: DSTDF008101, 纯度≥ 98%)、咖啡酸(批号: DST191030-013, 纯度≥ 98%)、肉桂酸(批号: DSTDG016802, 纯度≥ 98%)、没食子酸(批号: DSTDM000801, 纯度≥ 98%)、芦丁(批号: DST190901-017, 纯度≥ 99%)、原儿茶酸(批号: DST180428-081, 纯度≥ 98%)、原儿茶醛(批号: DST200628-080, 纯度≥ 98%)、藁本内酯(批号: DST240315-007, 纯度≥ 98%)、洋川芎内酯I(批号: DSTDY000902, 纯度≥ 98%)、欧当归内酯A(批号: DST210509-001, 纯度≥ 98%)、腺苷(批号: DSTDX004701, 纯度≥ 98%)、隐丹参酮(批号: DST190510-011, 纯度≥ 98%)、丹参酮I(批号: DST190907-013, 纯度≥ 98%)、丹参酮IIA(批号: DST180105-011, 纯度≥ 99%)、二氢丹参酮I(批号: DST230718-003, 纯度≥ 98%)购自成都德思特生物技术有限公司; 人参皂苷Rg1(批号: MUST-13041301, 纯度≥ 98%)、苯甲酰芍药苷(批号: MUST-16061803, 纯度: 99.28%)、芍药内酯苷(批号: MUST-16051601, 纯度: 99.09%)、氧化芍药苷(批号: MUST-15033010, 纯度: 99.93%)、羟基红花色素A(批号: MUST-16092910, 纯度: 99.88%)、木犀草素(批号: MUST-17102605, 纯度: 98.92%)购自成都曼思特生物科技有限公司; 丹酚酸A(批号: B20260, 纯度≥ 98%)购自上海源叶生物科技有限公司。冠心静(批号: 230605)由河北省保定中药制药有限公司提供。
2 方法 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品溶液精密称取对照品人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、丹酚酸B、丹酚酸A、紫草酸、芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、羟基红花色素A、迷迭香酸、绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、没食子酸、芦丁、木犀草素、原儿茶酸、原儿茶醛、藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ、欧当归内酯A、腺苷、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA、二氢丹参酮I适量, 加甲醇定容, 配制成1 mg/mL的对照品储备液, 置于-20℃冰箱储存备用。
分别吸取适量各个对照品储备液, 加甲醇稀释得质量浓度为10 μg/mL的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液称取冠心静粉末0.1 g, 置于具塞锥形瓶中, 加入10 mL 70%甲醇, 称质量, 超声处理(功率180 W, 频率40 kHz)30 min, 放至室温, 再次称质量, 补足失质量, 摇匀, 离心10 min(14 000 r/min, 离心半径20 cm), 用0.22 μm微孔滤膜过滤, 取续滤液, 即得供试品溶液。
2.2 色谱条件与质谱条件 2.2.1 色谱条件色谱柱: Waters ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)色谱柱。流动相: 0.1%甲酸-水溶液(A), 乙腈(B), 梯度洗脱: 0~7 min, 5%~20% B, 7~25 min, 20%~45% B; 25~33 min, 45%~90% B, 33~40 min, 90%~95% B; 流速为0.3 mL/min; 柱温: 30℃; 进样量: 5 μL。
2.2.2 质谱条件离子源: 电喷雾(ESI)离子源; 采集模式: 正、负离子模式检测; 毛细管温度: 350℃; 干燥气流速: 11 L/min; 雾化器压力: 35 psi; 碎裂电压: 135 V; 碰撞能量: 30 V, 数据采集范围: m/z 50~1 500。
2.3 方法学考察 2.3.1 精密度实验称取冠心静粉末0.1 g, 按"2.1.2"项下方法制备供试品溶液, 按上述色谱和质谱条件重复进样6次, 计算随机选取的20个色谱峰的保留时间相对标准偏差值(RSD)小于0.08%, 峰面积RSD值小于4.42%, 表明仪器精密度良好。
2.3.2 重复性实验称取冠心静粉末6份, 每份0.1 g, 按"2.1.2"项下制备供试品溶液, 分别进样, 计算随机选取的20个色谱峰的保留时间RSD值小于0.09%, 峰面积RSD值小于4.84%, 表明该方法重复性较好。
2.3.3 稳定性实验称取冠心静粉末, 每份0.1 g, 按"2.1.2"项下方法制备供试品溶液, 分别于0、2、4、8、10、12 h进样, 计算随机选取的20个色谱峰的保留时间RSD值小于0.09%, 峰面积RSD值小于4.60%, 表明供试品溶液在进样器放置12 h稳定性良好。
3 结果 3.1 定性分析取"2.1.2"项下供试品溶液, 按"2.2"项下色谱-质谱条件进样分析。采用Agilent MassHunter分析软件对冠心静供试品溶液与混合对照品溶液在正、负离子模式下获得的总离子流数据进行分析。收集中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、PubChem、MassBank和相关文献[6, 14-32]中已经鉴定的化合物信息和质谱碎片信息并汇总, 与Agilent MassHunter软件分析的数据进行对比, 从而对冠心静的成分进行指认, 另外辅以各成分二级质谱碎片对其进一步确认, 最终共鉴定出96个化合物, 包括29个萜类、29个有机酸类、11个苯酞类、13个黄酮类、14个其他类成分。其中31个成分通过与对照品比对得到进一步确认, 鉴定结果与正、负总离子流图分别见开放科学(资源服务)标识码(OSID)和图 1。
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| 注：图A，正模式；图B，负模式。 图 1 冠心静总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatogram(TIC) in Guanxinjing Capsule |
本实验从冠心静中初步鉴定出29种有机酸类化合物, 此类化合物的裂解过程以56号化合物丹酚酸B为例进行说明。化合物56在负离子扫描模式下可见m/z 717.146 1[M-H]-的准分子离子峰, 通过丢失1分子丹参素产生二级碎片离子m/z 519.093 8[M-H-C9H10O5]-, 该碎片离子可进一步丢失丹参素裂解产生m/z 321.039 9[M-H-C9H10O5-C9H10O5]-的碎片离子; 此外, m/z 519.093 8的碎片离子还易失去1分子咖啡酸产生m/z 339.050 0[M-H-C9H10O5-C9H8O4]-的碎片离子; 碎片m/z 295.060 4[M-H-C9H10O5-C9H8O4-CO2]-为碎片m/z 339.050 0失去1分子CO2所得, 该碎片继续高能碰撞裂解产生m/z 185.024 0[M-H-C9H10O5-C9H8O4-C7H6O4]-和m/z 109.029 4[M-H-C9H10O5-C9H8O4-C12H6O5]-的碎片离子。通过化合物裂解规律、文献信息[6]及对照品比对, 确认56号化合物为丹酚酸B, 其质谱裂解途径见图 2。
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| 图 2 丹酚酸B的质谱裂解途径 Fig. 2 The MS fragmentation pathways of salvianolic acid B |
本实验从冠心静中初步鉴定出29种萜类化合物, 此类化合物的裂解过程以单萜类成分芍药苷(23号化合物)为例进行说明。化合物23在负离子扫描模式下可见m/z 525.160 9[M+HCOOH-H]-的准分子离子峰; 二级碎片离子m/z 449.141 2[M-H-CH2O]-是分子离子峰m/z 479.154 8[M-H]-蒎烷骨架失去1分子CH2O产生的, 该二级碎片离子可进一步失去1分子苯甲酰基产生m/z 327.105 5[M-H-CH2O-C7H6O2]-和m/z 121.029 0[M-H-CH2O-C16H22O9]-的碎片离子; 此外, 分子离子m/z 479.154 8还易失去1分子苯甲酰基产生m/z 357.117 9[M-H-C7H6O2]-的碎片离子, 该离子可相继失去1分子葡萄糖和1分子羟甲基产生m/z 195.065 1[M-H-C7H6O2-C6H10O5]-和m/z 165.054 3[M-H-C7H6O2-C6H10O5-CH2O]-的碎片离子, 通过化合物裂解规律、文献信息[33]及对照品比对, 确认23号化合物为芍药苷, 其质谱裂解途径见图 3。
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| 图 3 芍药苷的质谱裂解途径 Fig. 3 The MS fragmentation pathways of Paeoniflorin |
本实验从冠心静中初步鉴定出11种苯酞类化合物, 此类化合物的裂解过程以76号化合物洋川芎内酯A为例进行说明。化合物76在正离子扫描模式下可见m/z 193.122 5[M+H]+的准分子离子峰; 该离子可失去一分子H2O产生m/z 175.111 6[M+H-H2O]+的碎片离子, 或失去1分子C4H8产生m/z 137.059 6[M+H-C4H8]+的碎片离子, 通过化合物裂解规律、文献信息[21]及对照品比对, 确认76号化合物为洋川芎内酯A, 其质谱裂解途径见图 4。
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| 图 4 洋川芎内酯A的质谱裂解途径 Fig. 4 The MS fragmentation pathways of Senkyunolide A |
冠心静作为上市复方制剂, 在临床已应用多年, 但全方包括多种药味, 化学成分较为复杂。为全面表征其化学成分, 研究前期对提取溶剂、流动相体系、色谱柱、采集模式、色谱及质谱条件进行了多方面的优化。结果, 共从冠心静中鉴定出96种化合物, 包括29个萜类、29个有机酸类、11个苯酞类、13个黄酮类、14个其他类成分。其中在正离子采集模式下推定化合物25种, 负离子模式下推定化合物71种, 萜类和有机酸类化合物是冠心静中的主要成分。另外发现, 黄酮类化合物在正负离子模式下均有较好响应; 萜类以及有机酸类化合物在负离子模式下响应较好; 而苯酞类化合物在正离子模式下有较强的响应, 在负离子模式下响应较低或几乎无响应。
本复方制剂中所含的一些化学成分对冠心病及其相关病症具有良好的药理活性。有机酸类化合物以丹酚酸类和绿原酸等成分为主, 主要来源于丹参和川芎, 具有抗心肌缺血及抗缺氧的作用, 如丹酚酸B可显著改善缺血再灌注所致大鼠的心功能损伤[34-35]。萜类化合物包括以人参皂苷为主的三萜类、以丹参酮为主的二萜类和以芍药苷为主的单萜类成分, 主要来源于赤芍、人参、丹参和三七。此类化合物具有较强的心血管保护作用, 如人参皂苷Rg1可改善心肌及冠状动脉的病理损伤[36-37], 芍药苷可通过抑制Caspase-3和Caspase-9的表达从而改善急性心肌梗死大鼠的心室重塑[38]。黄酮类化合物主要来源于红花, 以红花黄色素及其衍生糖苷为主, 具有扩张血管、改善血液循环等作用[22]。苯酞类化合物主要来源于川芎, 其作为川芎中的主要活性化合物, 具有调节心脑血管系统及神经系统, 舒张平滑肌的作用[21]。此外, 本研究还鉴定出其他类化合物如肉桂酸、薯蓣皂苷元等主要来自于苏合香和玉竹。这些不同种类、不同来源的活性成分配伍后通过相互协同或互补方式, 从多靶点、多通路发挥作用, 最终使冠心静发挥通脉益气、活血化瘀的功效。
冠心静是临床常用的治疗冠心病及心绞痛的处方药, 由9味中药组合而成, 所含化学成分复杂, 目前有关冠心静的研究主要集中在临床疗效方面, 为弥补现阶段对冠心静化学成分研究的不足, 本研究建立了简便灵敏的分析方法, 对冠心静中的化学成分进行了系统的定性分析, 为深入挖掘分析其药效物质奠定了基础。
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