溃疡性结肠炎(UC)是一种病变部位在结直肠的炎性肠病, 以腹泻、腹痛、便脓血等为主要临床特征, 表现出反复发作、迁延难愈的特点, 影响患者生活质量, 且具有一定的癌变风险^[1]。目前研究认为炎症、氧化应激及肠上皮细胞过度凋亡是UC的重要推动因素^[2-3], 而Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路在炎症、氧化应激和细胞凋亡的病理机制中发挥作用^[4-5]。近年来病理学研究证实, TLR4/NF-κB信号通路在肠道损伤过程中处于异常高度活化状态, 与UC疾病进展关系密切^[6]。马齿苋多糖(POP)为中药马齿苋的主要活性成分之一, 研究证实, POP对UC动物模型炎症具有一定的抑制作用^[7], 但其作用机制尚未阐明。本研究旨在探讨POP调节TLR4/NF-κB信号通路对UC大鼠结肠组织损伤的影响, 以期为POP治疗UC提供参考。

1 材料与方法 1.1 动物

通过河北省实验动物中心[SCXK(冀)2021-002]购买40只7周龄雄性SD大鼠, 200~240 g, 在通风良好、恒温恒湿、模拟自然光照周期的清洁级动物房饲养, 进食饮水不限。本研究经邯郸市第一医院伦理委员会审批通过[审批号: HDYYLL(K)2022-019]。

1.2 药物与试剂

POP(货号WKQ-0029205, 纯度≥ 90%)、TLR4抑制剂瑞沙托维(TAK-242, 货号WKQ-0020021)、TLR4激动剂脂多糖(LPS, 货号WKQ-0003274)购自四川维克奇公司; 葡聚糖硫酸钠(货号MB5535-1)、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(货号MA0152)、增强化学发光试剂(ECL, 货号MA0186)和苏木精-伊红(HE)染色(货号MB9898-2)、原位末端标记法(TUNEL)染色(货号MA0223-1)试剂盒购自大连美仑生物技术公司; 干扰素(IFN)-γ(货号JM-01605R2)、白细胞介素(IL)-1β(货号JM-01454R1)、IL-10(货号JM-01602R1)、丙二醛(MDA, 货号JM-10323R1)、超氧化物歧化酶(SOD, 货号JM-01793R2)、过氧化氢酶(CAT, 货号JM-10334R2)试剂盒购自江苏晶美生物科技公司; 活性氧(ROS, 批号20220413)试剂盒购自上海恒斐生物公司; 肿瘤坏死因子(TNF)-α(货号SEKR-0009)、髓过氧化物酶(MPO, 货号SEKR-0073)购自北京索莱宝公司; 二奎磷甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒、RNA提取液(货号G3013)、一步法实时聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒(货号G3335)购自武汉赛维尔生物科技公司; TLR4(货号bs-1021R)、NF-κB p65(货号bs-23216R)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax, 货号bs-28034R)、β-肌动蛋白(β-actin, bs-0061R)抗体和免疫球蛋白(Ig)G二抗购自北京博奥森生物技术公司; Bcl-2(货号ab194583)抗体购自英国Abcam公司; 剪切型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗体(货号AF7022)购自美国Affinity公司。

1.3 仪器

KD型石蜡包埋机(浙江金华科迪仪器公司); HM325型石蜡组织切片机、MFC型酶标仪(美国Thermo Fisher公司); YD-AB型摊烤片机(浙江益迪设备公司); DS-Qi2型荧光显微镜(日本尼康公司); S1010E型高速低温离心机(美国Scilogex公司); Mini型电泳仪和转印槽(美国Bio-Rad公司); AlphaEaseFC型蛋白条带灰度分析系统(美国Alphalnnotech公司); RS232C型核酸测定仪、Realplex2型RT-PCR仪(德国Eppendorf公司)。

1.4 分组与造模

按随机数字表法, 将饲养7 d后的大鼠随机分为正常(Normal)组、模型(Model)组、POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组, 每组8只。除Normal组外, 其他4组参照文献^[8]报道的方法连续7 d自由饮用5%葡聚糖硫酸钠溶液以制备UC动物模型。

1.5 给药治疗

POP组灌胃10 mg/kg POP^[7]和腹腔注射生理盐水, POP+TAK-242组灌胃10 mg/kg POP和腹腔注射3 mg/kg TAK-242^[9], POP+LPS组灌注10 mg/kg POP和腹腔注射0.4 mg/kg LPS^[10], Normal组和Model组灌胃生理盐水和腹腔注射生理盐水, 灌胃和腹腔注射体积均为5 mL/kg, 1次/d给药连续治疗2周。

1.6 大鼠一般状态观察及疾病活动指数(DAI)评分

治疗完成后, 观察大鼠毛发、精神状态、饮食、大便状况、便血情况、体质量变化等一般状态。从体质量、大便状况、便血情况3个方面进行DAI评分^[11]: 1)体质量持续升高或无下降, 记0分; 体质量下降率≤ 5%、5%~10%、10%~15%、≥ 15%, 分别记1、2、3、4分。2)大便形态正常, 记0分; 大便松散, 记1分; 大便呈糊状, 记2分; 稀便, 记3分; 水样便, 记4分。3)大便潜血阴性, 记0分; 大便潜血阳性, 记2分; 便血, 记4分。DAI评分=(体质量评分+大便状况评分+便血情况评分)/3。

1.7 结肠长度测量及结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分

腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后颈椎脱臼处死大鼠, 开腹取结肠、测量其长度。纵向剖开肠管, 清除结肠内容物, 用生理盐水冲洗干净。CMDI评分标准^[11]: 未见损伤, 记0分; 结肠黏膜水肿, 肠壁未见溃疡, 记1分; 结肠肠壁变厚, 肠壁未见溃疡, 记2分; 结肠肠壁出现直径≤ 1 cm, 记3分; 结肠肠壁出现直径1~2 cm溃疡灶, 结肠与周边无粘连时记4分、有粘连时记5分。

1.8 HE、TUNEL染色观察结肠组织病理变化和细胞凋亡

将部分结肠组织置于福尔马林溶液固定72 h, 经脱水、石蜡包埋、切片、展片、烤片等步骤处理后, 分别按试剂盒说明行HE染色和TUNEL染色并观察肠组织病理变化。计数TUNEL染色切片中细胞总数和凋亡细胞数, 凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.9 酶联免疫吸附法(ELISA)检测结肠组织中炎症因子水平和氧化应激指标

取部分结肠组织按1:9(质量体积比)加入4℃生理盐水, 研磨匀浆, 离心半径10 cm, 3 500 r/min离心10 min, 取上清液, 通过酶标仪检测结肠组织炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-10、MPO水平和氧化应激指标(ROS、MDA水平和SOD、CAT活性)。

1.10 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测结肠组织中TLR4、NF-κB p65、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达

取100 mg结肠组织, 加RIPA裂解液提取总蛋白、BCA法测定浓度、95℃水浴10 min变性, 依次通过电泳分离、湿法转至PVDF膜、蛋白封闭液室温封闭60 min处理后, 加TLR4(1:1 000)、NF-κB p65(1:1 000)、Bcl-2(1:1 000)、Bax(1:1 000)、Cleaved Caspase-3(1:800)、β-actin(1:2 000)抗体稀释液4℃孵育过夜, 加IgG二抗(1:4 000)稀释液室温孵育90 min, ECL显色后分析蛋白条带灰度值, 以β-actin为内参对目标蛋白进行半定量分析。

1.11 RT-PCR法检测结肠组织中TLR4、NF-κB p65、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA表达

取50 mg结肠组织, 加RNA提取液提取总RNA, 通过核酸测定仪检测总RNA纯度后, 通过一步法RT-PCR试剂盒逆转录为cDNA, RT-PCR扩增反应: 95℃预变性2 min一次; 95℃变性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s, 循环40次。然后以β-actin为内参, 运用2^-ΔΔCt公式计算目标基因表达量。引物序列见表 1。

1.12 统计学处理

运用SPSS 20.0进行数据统计学分析, 计量资料符合正态分布以均数±标准差(x±s)表示, 多组间比较采用one-way ANOVA, 组间多重比较采用LSD-t检验, P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 POP对UC大鼠状态和DAI评分的影响

Normal组大鼠毛发滑顺、有光泽, 反应灵敏, 摄食量正常, 大便形态正常, 潜血阴性, 体质量持续升高。Model组大鼠毛发粗糙、污浊、无光泽, 反应迟钝, 摄食量明显减少, 大便稀溏、不同程度便血, 肛周有稀便黏连, 体质量降低。与Model组比较, POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组大鼠一般状态呈不同程度改善, 改善效果POP+TAK-242组 > POP组 > POP+LPS组。与Normal组比较, Model组DAI评分明显升高(P < 0.05);与Model组比较, POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组DAI评分明显降低(P < 0.05);与POP组比较, POP+TAK-242组DAI评分明显降低, POP+LPS组DAI评分明显升高(P < 0.05)。见图 1。

2.2 POP对UC大鼠结肠长度和CMDI评分的影响

与Normal组比较, Model组结肠长度明显降低, CMDI评分明显升高(P < 0.05)。与Model组比较, POP组和POP+TAK-242组结肠长度明显升高(P <0.05), POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组CMDI评分明显降低(P < 0.05)。与POP组比较, POP+TAK-242组结肠长度明显升高, CMDI评分明显降低(P < 0.05);POP+LPS组结肠长度明显降低, CMDI评分明显升高(P < 0.05)。见图 2。

2.3 POP对UC大鼠结肠组织病理变化的影响

Normal组大鼠结肠组织层次清晰, 结构完整, 腺体丰富, 肠黏膜绒毛排列整齐。Model组结肠组织层次不清, 肠黏膜水肿, 上皮成块状脱落, 绒毛变短或消失, 腺体数量减少, 大量炎性细胞浸润, 黏膜层可见溃疡面, 损及肌层。与Model组比较, POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组结肠组织上述病理变化不同程度改善, 改善效果POP+TAK-242组 > POP组 > POP+LPS组。见图 3。

2.4 POP对UC大鼠结肠细胞凋亡的影响

与Normal组比较, Model组结肠细胞凋亡数量明显增多, 凋亡指数明显升高(P < 0.05)。与Model组比较, POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组结肠细胞凋亡数量不同程度减少, 凋亡指数均明显降低(P < 0.05)。与POP组比较, POP+TAK-242组凋亡指数明显降低, POP+LPS组凋亡指数明显升高(P < 0.05)。见图 4、图 5。

2.5 POP对UC大鼠结肠组织中炎症因子水平的影响

与Normal组比较, Model组结肠组织中炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、MPO水平明显升高, IL-10水平明显降低(P < 0.05)。与Model组比较, POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β(POP+LPS组除外)、MPO水平明显降低, IL-10水平明显升高(P < 0.05)。与POP组比较, POP+TAK-242组结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、MPO水平明显降低, IL-10水平明显升高(P < 0.05);POP+LPS组结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、MPO水平明显升高, IL-10水平明显降低(P < 0.05)。见图 6。

2.6 POP对UC大鼠结肠组织氧化应激指标的影响

与Normal组比较, Model组结肠组织ROS、MDA水平明显升高, SOD、CAT活性明显降低(P < 0.05)。与Model组比较, POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组结肠组织中ROS、MDA水平明显降低, SOD(POP+LPS组除外)、CAT(POP+LPS组除外)活性明显升高(P < 0.05)。与POP组比较, POP+TAK-242组结肠组织中ROS、MDA水平明显降低, SOD、CAT活性明显升高(P < 0.05);POP+LPS组结肠组织中ROS、MDA水平明显升高, SOD、CAT活性明显降低(P < 0.05)。见图 7。

2.7 POP对UC大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响

与Normal组比较, Model组TLR4、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高, Bcl-2表达水平明显降低(P < 0.05)。与Model组比较, POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组TLR4(POP+LPS组除外)、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平明显降低, Bcl-2表达水平明显升高(P < 0.05)。与POP组比较, POP+TAK-242组TLR4、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平明显降低, Bcl-2表达水平明显升高(P < 0.05);POP+LPS组TLR4、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3表达水平明显升高, Bcl-2表达水平明显降低(P < 0.05)。见图 8、图 9。

2.8 POP对UC大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA表达的影响

与Normal组比较, Model组结肠组织TLR4、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA表达水平明显升高, Bcl-2 mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)。与Model组比较, POP组、POP+TAK-242组和POP+LPS组结肠组织TLR4(POP+LPS组除外)、NF-κB p65(POP+LPS组除外)、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA表达水平明显降低, Bcl-2 mRNA表达水平明显升高(P < 0.05)。与POP组比较, POP+TAK-242组TLR4、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA表达水平明显降低, Bcl-2 mRNA表达水平明显升高(P < 0.05);POP+LPS组TLR4、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3 mRNA表达水平明显升高, Bcl-2 mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)。见图 10。

3 讨论

UC是一种较常见的慢性、弥漫性炎性肠病, 在中国发病率超过2/10万, 且呈现逐年上升趋势, 发病机制复杂、治疗周期漫长, 多发于20~30岁和50~70岁两个年龄段, 不但影响患者生活质量, 更为严重的是UC将显著增加患癌风险, 是医药工作者关注的热点之一^[12]。目前, 临床上主要采取氨基水杨酸类药物、免疫抑制剂、抗菌药物、糖皮质激素等一种或多种药物联合治疗, 但免疫抑制剂、糖皮质激素等药物长期应用往往引发广泛的毒副作用, 且长期疗效并不理想。因此, 寻找疗效确切且毒副作用小的UC新型治疗药物具有重要的临床意义。

中医将UC归属于"泄泻""痢疾""肠癖""久痢"等范畴, 其病位在肠腑, 脾胃虚弱、气机壅滞、湿热浊毒内蕴为其主要病机, 可分为大肠湿热型、脾虚湿蕴型、热毒炽盛型、寒热错杂型、肝郁脾虚型、脾肾阳虚型等, 其中大肠湿热型较为多见^[13-14]。马齿苋取自马齿苋科植物马齿苋的干燥地上部分入药, 首载于《本草经集注》, 现为《中国药典(一部)》收录中药品种, 味酸性寒, 归脾经、大肠经, 具有清热利湿、解毒消肿、凉血止血、止痢等功效。良好的动物模型是病理生理学、药理学等研究的基础, UC动物模型制备方法主要有诱导法(化学试剂诱导、微生物诱导、食物诱导等)、基因敲除法(屏障蛋白基因敲除、抗炎因子基因敲除等)、联合法等, 其中化学试剂诱导法是最经典、最常用的UC动物模型制备方法, 该方法具有操作简便、复制性强、与人类病理特点近似等优势, 其中葡聚糖硫酸钠是最常用的化学诱导试剂, 葡聚糖硫酸钠诱导法也是中医学大肠湿热型UC动物模型制备的常用方法^[14-15]。本实验采用连续7 d自由饮用5%葡聚糖硫酸钠溶液的方法制备UC大鼠模型, 结果显示, UC模型大鼠表现出毛发无光泽、反应迟钝、摄食量减少、大便稀溏、便血、体质量降低等状态, 结肠长度明显降低, DAI评分和CMDI评分明显升高; 结肠组织呈现组织层次不清, 肠黏膜水肿, 上皮成块状脱落, 绒毛变短或消失, 腺体数量减少, 大量炎性细胞浸润, 黏膜层可见溃疡面等病理变化, 这与王小天等^[16]报道相似。经POP治疗可明显改善UC大鼠一般状态, 提高结肠长度, 降低DAI评分和CMDI评分, 减轻结肠组织病变, 提示POP具有减轻UC大鼠结肠组织损伤的作用。

POP能够减轻UC大鼠结肠组织损伤可能与下列因素有关, 1)UC疾病使肠黏膜免疫系统受损失衡导致促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β分泌并抑制抑炎因子IL-10分泌, 并且TNF-α和IL-1β具有炎性趋化属性, 促进中性粒细胞等白细胞向受损部位聚集并进一步释放促炎因子, 从而加重炎症反应并促进炎性浸润^[17-18]。MPO为中性粒细胞分泌的一种过氧化物酶, 其水平能够反映炎性浸润程度, 研究发现UC患者病情程度与MPO水平呈正相关。Wu等^[19]报道通过药物抑制炎症反应可有效减轻UC大鼠结肠组织损伤。本研究发现, UC模型大鼠结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平和MPO活性明显升高, IL-10水平明显降低, 说明UC大鼠出现较强的炎症反应。POP抗炎作用良好, 可明显降低UC大鼠结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平和MPO活性并明显提高IL-10水平, 提示POP可能通过抑制炎症反应减轻UC大鼠结肠组织损伤。2)UC发生发展过程中, 持续的炎性环境导致结肠组织血管异常收缩, 致使肠黏膜缺氧缺血而过度生成ROS, 超过SOD(将ROS转化为H₂O₂和O₂)、CAT(将转化H₂O₂为H₂O)等内源性抗氧化酶还原清除ROS能力, 过剩的ROS将损伤生物分子膜、蛋白质、核酸等(氧化应激损伤), 并且其终产物之一的MDA具有生物毒性^[20]。本研究发现, UC模型大鼠结肠组织中ROS、MDA水平明显升高, SOD、CAT活性明显降低, 说明UC大鼠出现氧化应激损伤。POP具有抗氧化作用, 可明显降低UC大鼠结肠组织ROS、MDA水平, 明显提高SOD和CAT活性, 提示POP可能通过抑制氧化应激损伤减轻UC大鼠结肠组织损伤。3)肠上皮细胞过度凋亡是UC进展的重要原因, Cleaved Caspase-3可诱导细胞结构蛋白、功能蛋白、核酸等生物大分子降解而促使细胞凋亡, 被认为是细胞凋亡的关键启动因子^[21]。本研究发现, UC模型大鼠结肠细胞凋亡指数和结肠组织中Cleaved Caspase-3蛋白、mRNA表达水平明显升高。POP有抑制细胞凋亡作用, 可明显降低UC大鼠结肠细胞凋亡指数和结肠组织中Cleaved Caspase-3蛋白、mRNA表达水平, 提示POP可能通过抑制结肠细胞凋亡减轻UC大鼠结肠组织损伤。与潘中武等^[22]报道相似。

TLR4是Toll样受体(TLRs)家族蛋白中研究最为广泛的亚型之一, 在先天免疫系统中作用明显, 能够被多种病原分子模式识别并直接或间接诱导促炎因子表达, 进而促进炎症反应^[23]。体外细胞实验、动物体内实验和临床研究结果均表明UC疾病过程大量病原体入侵刺激TLR4高表达并高度活化, 并诱导下游靶蛋白NF-κB表达上调与活化^[24-26]。NF-κB以p65亚基和p50亚基二聚体形式存在, 活化NF-κB入核后p65亚基与DNA顺式反应元件κB序列结合而诱导促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β等表达, 从而加重炎症损伤^[27]。Bax和Bcl-2通过影响线粒体膜孔道通透性而参与细胞线粒体凋亡途径的调节, 病理状态下二者由细胞质移位至线粒体膜, Bax能够形成同源二聚体"Bax-Bax"或与Bcl-2形成异源二聚体"Bax-Bcl-2", "Bax-Bax"可在线粒体膜形成高通透性孔道, 导致线粒体内容物细胞色素C等由线粒体进入细胞质, 细胞色素C诱导Caspase-3活化进而启动细胞凋亡程序; 而"Bax-Bcl-2"则不具备上述活性, 所以Bcl-2具有抑制细胞凋亡的生物学作用^[28]。本研究发现, UC模型大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白和mRNA表达水平明显升高, Bcl-2蛋白和mRNA表达水平明显降低; 经POP治疗可明显降低UC大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白和mRNA表达水平, 明显升高Bcl-2蛋白和mRNA表达水平, 说明下调TLR4/NF-κB信号通路可能是POP减轻UC大鼠结肠组织损伤的重要分子机制。本研究还发现, POP+TAK-242组对UC大鼠一般状态、DAI评分、结肠长度、CMDI评分、炎症因子水平、氧化应激指标、结肠组织病理变化、细胞凋亡、TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白和mRNA表达的作用明显强于POP组, POP+LPS组对各项指标的作用则明显弱于POP组, 从而进一步证实了POP减轻UC大鼠结肠组织损伤的作用机制与下调TLR4/NF-κB信号通路有关。

综上所述, POP具有减轻UC大鼠结肠组织损伤的作用, 可能与下调TLR4/NF-κB信号通路通路, 进而抑制炎症、氧化应激和细胞凋亡有关。本研究结果为UC(尤其是中医学大肠湿热型UC)的临床治疗及新药研发提供了新的思路。但本研究尚存在一些局限性, 首先未设置阳性药物组和POP药物梯度, 未能阐明POP最佳药物剂量; 其次未能阐明POP是否适合中医学所有类型的UC。课题组下一步将针对上述不足之处开展后续研究。