2025, Vol. 42文章信息
- 胡营杰, 李婧, 张素玲, 等.
- HU Yingjie, LI Jing, ZHANG Suling, et al.
- 黄柏酮调控Notch1/Hes1通路对雌性大鼠真性性早熟的改善作用
- Improvement effect of obacunone on true precocious puberty in female rats by regulating the Notch1/Hes1 pathway
- 天津中医药, 2025, 42(4): 480-485
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(4): 480-485
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.04.12
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文章历史
- 收稿日期: 2024-10-16
真性性早熟（TPP）是最常见的儿科内分泌疾病之一，定义为女孩在8岁之前和男孩在9岁之前出现青春期变化，并伴有生长加速和性激素水平升高[1]。如果TPP没有得到适当的治疗，会导致患儿成年期身高矮小，以及成年期患心血管疾病、代谢性疾病和癌症的风险增加[2]。目前，促性腺激素释放激素（GnRH）类似物如亮丙瑞林，被广泛用于治疗TPP，虽然其在治疗TPP中具有很好的效果，但存在高脂血症、红斑、暂时性阴道出血等不良反应[3]。因此，亟需开发新的药物治疗TPP。已有研究报道，知柏地黄汤加减可有效降低阴虚火旺型女童特发性TPP患儿性激素水平[4]。黄柏酮（Oba）作为知柏地黄汤的主要成分黄柏中的提取物，其能否改善雌性大鼠TPP尚不清楚。相关研究显示，异常的Notch1/Hes1信号转导可能与青春期发育异常有关[5]。但Oba是否可通过调控Notch1/Hes1通路影响雌性大鼠TPP尚不可知。基于此，本实验拟通过构建TPP雌性大鼠模型，观察Oba对TPP雌性大鼠的影响并探究可能的机制。
1 实验材料 1.1 动物72只，SPF级，雌性，25日龄，体质量为50~52 g的SD大鼠购自河南省实验动物中心，生产许可证号是SCXK（豫）2022－0001。实验通过医院实验动物伦理委员会批准，伦理批准号：202303018。
1.2 试剂及仪器Oba（批号HY-N0428，纯度：99.75%，美国MCE公司）；N-甲基-DL-天冬氨酸（批号20221115，铼博上海生化科技有限公司）；亮丙瑞林（批号20221108，南京生利德生物科技有限公司）；Notch1阻断剂DAPT（批号20220918，翌圣生物科技上海股份有限公司）；大鼠促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH），酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（批号20220903、20220526、20220830，南京信帆生物技术有限公司）；兔源一抗GnRH、促性腺激素释放激素受体（GnRHR）、Notch1、GAPDH、Hes1及二抗（批号ab189878、ab183079、ab246693、ab8245、ab108937、ab6721，英国Abcam公司）。MK3酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；PX5202ZH电子天平（陕西环宇仪器设备有限公司）；CX33光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；DYCZ-24DN蛋白电泳仪（北京六一仪器厂）。
2 实验方法 2.1 TPP雌性大鼠模型的构建分别在每日14∶00和16∶00通过皮下注射40 mg/kg N-甲基-DL-天冬氨酸的方式建立TPP雌性大鼠模型，建模成功的标准为雌性大鼠阴道开口，阴道涂片显示有规则的性周期出现，且性周期的持续时间也基本相同[6]。
2.2 动物处理雌性大鼠按照随机数字表法随机分为TPP组、正常组、Oba低剂量组、Oba高剂量组、亮丙瑞林组、Oba高剂量+DAPT组，每组12只。正常组大鼠以生理盐水代替N-甲基-DL-天冬氨酸，其他操作同造模。除正常组外，其他组大鼠均需构建TPP模型。模型构建成功后，开始给药处理，Oba低剂量组、Oba高剂量组[7]大鼠分别腹腔注射1.5、6 mg/kg Oba，且均需皮下注射等量的生理盐水；亮丙瑞林组[8]大鼠皮下注射100 μg/kg亮丙瑞林，且腹腔注射等量的生理盐水；Oba高剂量+DAPT组[9]大鼠腹腔注射6 mg/kg Oba和100 mg/kg DAPT，且皮下注射等量的生理盐水；TPP组、正常组大鼠均腹腔且皮下注射等量的生理盐水。给药每日1次，持续2周。
2.3 阴道开口时间统计每日8∶00检查大鼠的阴道开口情况，记录阴道开口时间。
2.4 大鼠血清中LH、E2、FSH水平的检测麻醉所有大鼠，腹主动脉取血，经离心得血清，采用ELISA试剂盒检测血清中LH、E2、FSH水平。
2.5 卵巢系数、子宫系数的检测采集血样后，迅速从所有大鼠体内取出子宫和卵巢样本并称质量，并计算子宫和卵巢系数，子宫系数=子宫质量/体质量，卵巢系数=卵巢质量/体质量。
2.6 卵巢、子宫病理变化的苏木精-伊红（HE）染色检测卵巢系数、子宫系数检测完成后，将卵巢和子宫组织固定在4%多聚甲醛中，分别制成5 μm厚切片，并进行HE染色。观察染色后卵巢切片中卵泡生长情况、子宫切片中子宫壁厚度变化情况。
2.7 下丘脑中GnRH表达和垂体中GnRHR表达的免疫组化染色检测处死大鼠，收集大鼠的部分下丘脑组织以及垂体组织，用4%多聚甲醛固定下丘脑和垂体，经脱水、石蜡包埋后切成5 μm的厚度切片。用5%牛血清白蛋白封闭切片1 h。加入一抗GnRH（1∶500）在4 ℃下处理下丘脑组织切片过夜，加入一抗GnRHR（1∶600）在4 ℃下处理垂体组织切片过夜。随后，将下丘脑组织切片、垂体组织切片分别与二抗（1∶1 000）在室温下孵育2 h。经3，3-二氨基联苯胺染色切片后，再用苏木精复染。脱水和透明后，将切片密封在中性树脂中并在显微镜下观察。棕黄色颗粒被认为是阳性的GnRH和GnRHR表达信号。每个切片随机选取5个视野，通过ImageJ软件评估每个视野GnRH和GnRHR阳性表达的平均光密度值。
2.8 下丘脑中Notch1、Hes1蛋白表达的检测取2.7中剩余的部分下丘脑组织，使用RIPA裂解液提取大鼠下丘脑蛋白。将45 μg蛋白质样品分离至10% SDS-PAGE凝胶中。电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜封闭1 h，然后在4 ℃下与一抗Notch1（1∶3 000）、GAPDH（1∶3 000）、Hes1（1∶4 000）一起孵育过夜。接下来，将膜与相应的二抗（1∶5 000）在37 ℃下孵育1 h。通过化学发光底物对膜进行可视化。采用Image J软件对结果进行分析。以GAPDH为内参，以目的蛋白与GAPDH的灰度值比值作为蛋白表达量的分析依据。
2.9 统计学方法所有结果以均数±标准差（x±s）表示。采用单因素方差分析及事后SNK-q检验进行多组间比较。数据由GraphPad Prism 8.0软件分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果 3.1 Oba对大鼠阴道开口时间的影响与正常组相比，TPP组大鼠阴道开口时间提前（P<0.05）；与TPP组相比，Oba低剂量组、Oba高剂量组、亮丙瑞林组大鼠阴道开口时间延迟（P<0.05）；与Oba高剂量组相比，Oba高剂量+DAPT组大鼠阴道开口时间提前（P<0.05）。见表 1。
与正常组相比，TPP组大鼠血清中LH、E2、FSH水平升高（P<0.05）；与TPP组相比，Oba低剂量组、Oba高剂量组、亮丙瑞林组大鼠血清中LH、E2、FSH水平降低（P<0.05）；与Oba高剂量组相比，Oba高剂量+DAPT组大鼠血清中LH、E2、FSH水平升高（P<0.05）。见表 2。
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与正常组相比，TPP组大鼠卵巢系数、子宫系数升高（P<0.05）；与TPP组相比，Oba低剂量组、Oba高剂量组、亮丙瑞林组大鼠卵巢系数、子宫系数降低（P<0.05）；与Oba高剂量组相比，Oba高剂量+DAPT组大鼠卵巢系数、子宫系数升高（P<0.05）。见表 3。
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卵巢HE染色显示：正常组大鼠卵泡以原始卵泡、初级卵泡为主，少量为次级卵泡，未见三级卵泡；TPP组大鼠卵巢出现多个二级卵泡和三级卵泡。与TPP组相比，Oba低剂量组、Oba高剂量组、亮丙瑞林组大鼠卵巢中二级卵泡和三级卵泡数量减少；与Oba高剂量组相比，Oba高剂量+DAPT组大鼠卵巢中二级卵泡和三级卵泡数量增多。见图 1。
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| 注：→指向一级卵泡，* 指向三级卵泡，△指向子宫壁。 图 1 各组大鼠卵巢、子宫HE染色结果 Fig. 1 Results of HE staining of ovary and uterus in rats of each group |
子宫HE染色显示：正常组大鼠的子宫层次结构清晰，细胞形态正常，无明显病理变化；与正常组相比，TPP组大鼠子宫壁增厚；与TPP组相比，Oba低剂量组、Oba高剂量组、亮丙瑞林组大鼠子宫壁变薄；与Oba高剂量组相比，Oba高剂量+DAPT组大鼠子宫壁增厚。见图 1。
3.5 Oba对大鼠下丘脑中GnRH阳性表达和垂体中GnRHR阳性表达的影响与正常组相比，TPP组大鼠下丘脑中GnRH表达的平均光密度值和垂体中GnRHR表达的平均光密度值升高（P<0.05）；与TPP组相比，Oba低剂量组、Oba高剂量组、亮丙瑞林组大鼠下丘脑中GnRH表达的平均光密度值和垂体中GnRHR表达的平均光密度值降低（P<0.05）；与Oba高剂量组相比，Oba高剂量+DAPT组大鼠下丘脑中GnRH表达的平均光密度值和垂体中GnRHR表达的平均光密度值升高（P<0.05），见图 2和表 4。
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| 图 2 各组大鼠下丘脑中GnRH表达和垂体中GnRHR表达的免疫组化染色检测结果 Fig. 2 Results of immunohistochemical staining of GnRH expression in the hypothalamus and GnRHR expression in the pituitary gland in rate of each group |
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与正常组相比，TPP组大鼠下丘脑中Notch1、Hes1蛋白表达降低（P<0.05）；与TPP组相比，Oba低剂量组、Oba高剂量组、亮丙瑞林组大鼠下丘脑中Notch1、Hes1蛋白表达升高（P<0.05）；与Oba高剂量组相比，Oba高剂量+DAPT组大鼠下丘脑中Notch1、Hes1蛋白表达降低（P<0.05），见图 3和表 5。
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| 注：A，正常组；B，TPP组；C，Oba低剂量组；D，Oba高剂量组；E，亮丙瑞林组；F，Oba高剂量+DAPT组。 图 3 各组大鼠下丘脑中Notch1、Hes1蛋白表达检测 Fig. 3 Detection of Notch1 and Hes1 protein expression in rat hypothalamus of each group |
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近年来，TPP的发生率呈上升趋势，该病对儿童的生长发育和心理健康有深远的影响，也会增加与TPP相关的代谢性疾病的风险[10]。因此，实施有效的措施治疗TPP至关重要。在雌性大鼠中，阴道开口是卵巢活动的第一个外部迹象，被认为是青春期的标志，大约发生在出生后35~37 d[11]。本研究首先通过皮下注射N-甲基-DL-天冬氨酸法构建了TPP雌性大鼠模型，结果显示，与正常组相比，TPP组大鼠阴道开口时间提前，卵巢系数、子宫系数升高，卵巢出现多个二级卵泡和三级卵泡，且子宫壁增厚，符合TPP的特征。GnRH是一种小的十肽，在神经和内分泌系统之间起着重要的连接作用[12]。据报道，下丘脑中GnRH分泌的增加可以与垂体中的GnRHR结合，从而促进LH和FSH的分泌。此后，LH和FSH通过作用于性腺进一步刺激E2的合成，最终促进子宫和卵巢的发育，以及卵泡的形成和成熟等[13]。本研究对上述相应指标进行了检测，结果发现，与正常组相比，TPP组大鼠血清中LH、E2、FSH水平、下丘脑中GnRH表达的平均光密度值以及垂体中GnRHR表达的平均光密度值升高，表明下丘脑-垂体-性腺轴的激活参与了TPP的发生与进展。因此，抑制下丘脑-垂体-性腺轴的激活可能成为治疗TPP的有效策略之一。
Oba是一种广泛存在于柑橘类水果中的天然生物活性化合物，具有抗炎和抗氧化活性[14]。相关研究报道，有效成分含有黄柏的滋阴化痰方可有效降低性早熟女童血清性激素E2、FSH、LH水平[15]；黄柏是治疗TPP的关键有效成分之一[16]。本研究首次证明了提取于黄柏的Oba可通过抑制下丘脑-垂体-性腺轴的激活改善雌性大鼠TPP，且Oba剂量越高，改善作用越明显。此外，亮丙瑞林是临床上常用于治疗TPP的药物[17]，本研究以该药物为阳性药，结果发现，亮丙瑞林与高剂量Oba对TPP雌性大鼠的治疗作用比较，差异无统计学意义，提示Oba可能成为治疗TPP的潜在有效药物之一。
Notch信号通路在调节TPP中发挥重要的作用。据报道，在TPP患者中发现存在Notch相关基因突变的现象[18]；持续的Notch2表达会延迟促性腺激素的分化，进而改善TPP[19]。本研究中，与TPP组相比，Oba低剂量组、Oba高剂量组大鼠下丘脑中Notch1、Hes1蛋白表达升高，即低、高剂量Oba均上调了TPP大鼠下丘脑中Notch1、Hes1蛋白表达，且Oba剂量越高，上调作用越明显，故推测Oba改善雌性大鼠TPP的机制可能与激活Notch1/Hes1通路有关。为了验证上述推测是合理的，本研究用Notch1阻断剂DAPT进行了回复实验，结果显示，DAPT逆转了Oba对雌性大鼠TPP的改善作用。证实了推测是合理的。
综上所述，Oba可抑制下丘脑-垂体-性腺轴的激活进而改善雌性大鼠TPP，该机制可能与上调Notch1/Hes1通路有关。该研究可能为TPP的临床治疗提供新的理论依据。
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