白桦脂醇是羽扇豆烷型五环三萜类化合物，分子式为C₃₀H₅₀O₂，相对分子质量为442.72，呈白色针状结晶，不溶于水，微溶于乙酸乙酯、乙醇、甲醇等中等极性溶剂，易溶于氯仿等低极性溶剂^[1]。其广泛存在于白桦树皮、酸枣仁、石榴树皮等物质中^[2]，其中在干燥的白桦树树皮中含量较高^[3]。研究表明白桦脂醇具有抗肿瘤、机体免疫调节、抗炎及护肝等药理作用^[4-8]，特别是在抗肿瘤和抗人类免疫缺陷病毒（HIV）等方面展现出巨大的潜能^[9-11]，而有关肿瘤的靶向治疗更是医学领域的研究热点。

但因白桦脂醇水溶性差、在体内的稳定性低以致生物利用度低，限制了在临床的应用。而纳米乳作为一种优秀的药物载体，是为临床和治疗应用而设计的重要工具。与传统剂型相比，纳米乳具有颗粒小、表面积大的特性，可以显著增加难溶药物的溶解度、提高其生物利用度以提升抗肿瘤效果^[12]。同时纳米乳表面还具有活性中心多、反应活性高、吸附性强和催化率高的特性，使得药物更容易进入肿瘤细胞实现靶向性^[13-15]。

本课题组实验研究表明经腹腔注射途径给药的白桦脂醇纳米乳对S180荷瘤小鼠模型有显著的抑瘤活性和靶向性^[16]。将白桦脂醇做成纳米乳，不仅解决了白桦脂醇水溶性差的问题，还进一步提高了抗肿瘤的有效性。因此课题组决定对白桦脂醇纳米乳的处方和工艺进一步优化，以全面提升白桦脂醇对肿瘤的治疗效果，同时拓展了白桦脂醇剂型，对白桦脂醇的应用具有现实意义。

1 实验材料 1.1 仪器

AS3120A超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；LE204E/02电子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；高效液相色谱仪、Chromeleon色谱工作站、UltiMate3000紫外检测器、P680A四元泵（美国Dionex公司）；Welchrom C₁₈色谱柱（上海月旭科技有限公司）；DF-101S集热恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；HH-2数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；LitesizerTM500纳米粒度电位仪（奥地利Anton Paar公司）；QL-861涡旋器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；SHA-CA水浴恒温振荡器（金坛市城东新瑞仪器厂）。

1.2 试剂与药物

白桦脂醇标准品（纯度≥99.5%）（天津市天力化学试剂有限公司20200319）；白桦脂醇（含量>98%，西安西海生物科技有限公司XH20201101）；甲醇（色谱纯，德国，Merck公司）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；娃哈哈纯净水（娃哈哈集团有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯（IPM）、蓖麻油、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚（RH-40）、二乙二醇乙醚（上海阿拉丁试剂有限公司）；吐温80（Tween-80，天津百伦斯生物技术有限公司）；蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40，山东优索化工科技有限公司）；1，2-丙二醇（天津市巴斯夫化工有限公司）；丙三醇（天津市天力化学试剂有限公司）；双蒸水（自制）。

2 方法与结果 2.1 白桦脂醇纳米乳的制备方法

在油相和表面活性剂中加入过量的白桦脂醇后密封。涡旋混合后，以37 ℃、100 r/min在恒温振荡器中震荡48 h。取出后离心5 min（5 000 r/min，离心半径5.96 cm），吸取上清液，作为载药油相和表面活性剂。精密量取载药表面活性剂与助表面活性剂混合，作为混合表面活性剂。精密量取载药油相，与混合表面活性剂混匀，在25 ℃、1 000 r/min的转速下进行磁力搅拌，逐滴加入蒸馏水，至溶液由浑浊变得透明时即得白桦脂醇纳米乳。

2.2 粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位的测定方法

取适量白桦脂醇纳米乳，蒸馏水稀释100倍后超声震荡处理10 min，使其分散完全，取1 mL于比色皿中，在25 ℃，用激光粒度仪测定白桦脂醇纳米乳的平均粒径、PDI值和Zeta电位。

2.3 白桦脂醇纳米乳液结构类型的鉴别方法

采用染色法对白桦脂醇纳米乳液的结构类型进行鉴别。取同一批次相同体积的两份白桦脂醇纳米乳液置于样本瓶中，同时分别滴加苏丹红Ⅲ及亚甲基蓝染料溶液各1滴，静止放置，观察红色和蓝色两种染料在纳米乳液中扩散速度及外观的变化。

2.4 载药量的测定方法 2.4.1 色谱条件

色谱柱：Welchrom C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μL）；流动相：甲醇：0.2%甲酸（80∶20）；流速：1 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.4.2 对照品溶液储备液的配制

精密称取适量白桦脂醇标准品于25 mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声波震荡5 min，即得浓度为400 μg/mL的标准储备液。用封口膜密封后，保存在4 ℃冰箱中，备用。

2.4.3 供试品溶液的配制

制备3批白桦脂醇纳米乳，加入100 mL甲醇破乳，精密称定质量后超声1 h，充分溶解后用甲醇补足放冷后的损失，混匀后过滤，取续滤液经0.45 μm滤膜过滤后用封口膜密封，保存在4 ℃冰箱中，备用。

2.4.4 专属性实验

量取一定量的空白纳米乳，记溶液A；量取一定量对照品储备液得溶液B；称取供试品液，稀释成一定浓度得溶液C。过0.45 μm微孔滤膜后，依照“2.4.1”项下色谱条件进样，比较色谱峰，结果表明空白纳米乳在210 nm处无吸收，供试品与对照品在相应位置上存在相同峰，对白桦脂醇的测定无干扰，该方法专属性强。

2.4.5 标准曲线的建立

精密吸取白桦脂醇对照品的储备液1.0、1.5、2.5、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至容量瓶刻度线，超声5 min溶解，配制成40、60、100、120、160、200 μg/mL系列浓度的对照液。按“2.4.1”项下色谱条件进样，以色谱峰峰面积平均值Y为纵坐标，白桦脂醇标准溶液浓度X（mg/mL）为横坐标进行线性回归，得到白桦脂醇对照品回归方程Y=0.096 4X-1.296 3，R²=0.999 9。实验结果表明，说明白桦脂醇的浓度在40~200 μg/mL范围内标准曲线线性关系良好，可以用于白桦脂醇样品的测定。

2.4.6 精密度实验

分别精密量取对照品储备液，用甲醇配成浓度为100、120、160 μg/mL的溶液。按“2.4.1”项下色谱条件进样，分别在1 d内进行重复测量3次，重复测量3 d，计算日内和日间精密度，根据实验数据结果，不同浓度对照品储备液的日内和日间精密度的峰面积（RSD）值分别为0.20、0.41、1.79和1.52、1.33、0.70均小于2%，精密度良好。

2.4.7 重复性实验

精密量取白桦脂醇纳米乳，按供试品溶液制备方法制备6份。按“2.4.1”项下色谱条件进样记录峰面积并计算浓度和RSD值。RSD值为0.21%，表明重复性良好。

2.4.8 稳定性实验

精密量取白桦脂醇纳米乳，按供试品溶液制备方法制备。按“2.4.1”项下色谱条件进样，根据峰面积计算RSD值。记录样品静置0、1、2、4、6、8 h的峰面积，计算RSD值为0.93%，表明供试品稳定性良好。

2.4.9 加样回收率实验

精密量取白桦脂醇纳米乳1.0 mL 9份，分别精密加入低、中、高浓度的对照品溶液1.0 mL，按供试品溶液制备方法制备。再分别按“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，代入标准曲线，计算回收率和RSD值。平均回收率分别为97.04、102.56、100.89，均在95%~105%，RSD值分别为1.41、1.22、1.47均小于2%，表明白桦脂醇对照品的回收率良好，符合方法学要求。

2.5 白桦脂醇纳米乳的处方筛选 2.5.1 油相的筛选

分别精密量取表面活性剂（Tween-80、RH-40、EL-40）和助表面活性剂丙三醇，以质量比Km=1∶2混合，作为混合表面活性剂。精密量取油相（IPM、蓖麻油），分别与混合表面活性剂按质量比（1∶9~9∶1）混合，总质量1 g。在25 ℃，1 000 r/min转速下进行磁力搅拌，逐滴加入蒸馏水，当溶液由浑浊变得透明时制成纳米乳。记录各组溶液外观形态，见表 1。当油相为IPM时，可以与3种表面活性剂混合得到溶液外观澄清透明，流动性强且静置后不分层。处方最终选择IPM作为纳米乳的油相。

2.5.2 表面活性剂的筛选

分别将表面活性剂（Tween-80、EL-40、RH-40）与助表面活性剂丙三醇以质量比Km=1∶2混合，作为混合表面活性剂，备用。精密称取IPM，分别与混合表面活性剂以质量比（1∶9~9∶1）混合，总质量1 g。在25 ℃，1 000 r/min转速下进行磁力搅拌，逐滴加入蒸馏水，当溶液由浑浊变得透明时制成纳米乳。记录各组溶液外观形态。根据油相、水相、混合表面活性剂比例绘制伪三元相图，见表 2、图 1。表面活性剂为Tween-80时形成的伪三元相图O/W纳米乳的区域面积最大。最终制备白桦脂醇纳米乳的表面活性剂为Tween-80。

2.5.3 助表面活性剂的筛选

将筛选出的表面活性剂分别与助表面活性剂（1，2-丙二醇、丙三醇和二乙二醇乙醚）以质量比Km=1∶2混合，作为混合表面活性剂，备用。精密称取IPM，分别与混合表面活性剂质量比（1∶9~9∶1）混合，总质量1 g。在25 ℃，1 000 r/min转速下进行磁力搅拌，逐滴加入蒸馏水，当溶液由浑浊变得透明时制成纳米乳。根据油相、水相、混合表面活性剂比例绘制伪三元相图，见表 3、图 2。助表面活性剂为丙三醇时形成的伪三元相图O/W纳米乳的区域面积最大。最终制备白桦脂醇纳米乳的助表面活性剂为丙三醇。

2.5.4 Km值的筛选

将筛选出的表面活性剂Tween-80与助表面活性剂丙三醇以质量比（Km=1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）混合，作为混合表面活性剂。精密称取IPM，分别与混合表面活性剂以（1∶9~9∶1）质量比混合，总质量1 g。在25 ℃，1 000 r/min转速下进行磁力搅拌，逐滴加入蒸馏水，当溶液由浑浊变得透明时制成纳米乳。根据油相、水相、混合表面活性剂比例绘制伪三元相图，见表 4、图 3。当Km值为1∶2时，伪三元相图形成O/W纳米乳的区域面积最大。最终制备白桦脂醇纳米乳的Km值选择1∶2。

2.5.5 最优处方的确定

比较3组伪三元相图形成O/W纳米乳的区域面积。最优的处方组成为∶油相为IPM，表面活性剂为Tween-80、助表面活性剂为丙三醇，Km=1∶2。为保证空白纳米乳的载药量和稳定性，选择油相的中间比例点为作为最终处方。空白纳米乳的最终处方为：m（IPM）∶m（Tween-80）∶m（丙三醇）∶m（蒸馏水）=15.38%∶20.51%∶41.03%∶23.08%。

2.6 单因素筛选白桦脂醇纳米乳的制备工艺筛选 2.6.1 搅拌速度的考察

按照实验筛选的最佳处方，以搅拌温度50 ℃，搅拌时间5 min进行磁力搅拌，分别考察500、1 000、1 500 r/min的搅拌速度对纳米乳制备的影响，以纳米乳的粒径、PDI、Zeta电位、载药量作为评价指标，测定结果见表 5。结果显示，搅拌速度对纳米乳的影响显著，当搅拌速度较慢时，水相和混合溶液不能充分混合，形成的纳米乳大小不一，故载药量较低，分散指数也较大；当搅拌速度过快时，初步形成的纳米乳不够稳定会被破坏，所以载药量也比较低，粒径也较大。因此综合纳米乳的粒径、PDI、Zeta电位、载药量测定结果，确定搅拌速度为1 000 r/min。

2.6.2 搅拌温度的考察

按照实验筛选的最佳处方，以搅拌速度1 000 r/min，搅拌时间5 min进行磁力搅拌，分别考察20、35、50、65 ℃的搅拌温度对纳米乳制备的影响，以纳米乳的粒径、PDI、Zeta电位、载药量作为评价指标，测定结果见表 6。根据实验结果可知，搅拌温度对粒径的影响较大。搅拌温度的升高，会加速分子的热运动，溶液能与水相及时充分反应混合，使得粒径逐渐变小；但当搅拌温度过高，颗粒易发生聚集，粒径变大。因此综合纳米乳的粒径、PDI、Zeta电位、载药量测定结果，确定搅拌温度为50 ℃。

2.6.3 搅拌时间的考察

按照实验筛选的最佳处方，以搅拌速度1 000 r/min，搅拌温度50 ℃进行磁力搅拌，分别考察1、5、20、35、50 min的搅拌时间对纳米乳制备的影响，以纳米乳的粒径、PDI、Zeta电位、载药量作为评价指标，测定结果见表 7。实验发现，搅拌时间较短，溶液没有充分混合，纳米乳形成不完全，所以载药量较小；搅拌时间较长时，体系容易被破坏，易发生聚集，且随着搅拌时间的逐渐加长，对纳米乳的粒径、PDI、Zeta电位、载药量的影响较小，为缩短实验时间，确定搅拌时间为5 min。

2.7 星点设计响应面法优化制备工艺 2.7.1 实验方案

以单因素实验选择出的搅拌速度、温度和时间，作进一步筛选。因此，以搅拌速度（A）、搅拌温度（B）和搅拌时间（C）为影响因素，每个因素3个水平，以载药量（Y1）和粒径（Y2）为响应值进行最优工艺筛选。每个自变量的低、中、高水平设定为-1、0、+1，见表 8，实验设计及结果见表 9。

2.7.2 载药量（Y1）模型拟合和统计分析

以Design-Export 12统计软件分析，以载药量（Y1）为响应值，对搅拌速度、搅拌温度、搅拌时间3个因素进行二项式拟合，Y1=5.14+0.226 2A+0.525 0B+0.323 7C-0.400AB-0.202 5AC+0.205 0BC-1.83A²-1.01B²-0.781 3C²（R²=0.984 9）。回归模型P<0.000 1，响应值拟合良好，失拟项P>0.05，无失拟因素存在，见表 10。方程一次项A、B、C和平方项A²、B²、C²的P<0.05，说明对载药量均有显著性影响；各因素对载药量的影响从大到小依次为∶B（搅拌温度，℃）>C（搅拌时间，min）>A（搅拌速度，r/min）。残差正态分布图见图 4。残差分布趋向一条直线，表明模型的拟合效果好。

2.7.3 载药量（Y1）响应面法分析交互作用

搅拌速度（A）、搅拌温度（B）和搅拌时间（C）的交互作用对载药量Y的影响的效应面影响结果见图 5-图 7。每当控制一个工艺参数不变，随着另外两个工艺参数变化时，白桦脂醇纳米乳的载药量都呈现先增加后降低的趋势，响应面曲面都很陡峭，越陡峭表明两种因素的交互作用越明显。等高线图皆为闭合曲线，表明3个因素两两之间交互作用明显并且存在最大值，说明模型拟合准确可靠。

2.7.4 粒径（Y2）模型拟合和统计分析

以Design-Export 12统计软件分析，以粒径（Y2）为响应值，分别对搅拌速度、搅拌温度、搅拌时间3个因素进行二项式拟合，Y2=34.83-1.28A-1.000 0B+2.19C-0.825 0AB-0.387 5AC+0.985 0BC+5.76A²+4.97B²+4.33C²（R²=0.981 6）。回归模型P<0.000 1，响应值拟合良好，失拟项P>0.05，无失拟因素存在，说明方程拟合性良好，见表 11。方程一次项A、B、C和平方项A²、B²、C²的P<0.05，说明对粒径均有显著性影响；各因素对粒径的影响从大到小依次为：C（搅拌时间，min）>A（搅拌速度，r/min）>B（搅拌温度，℃）。残差正态分布图见图 8。残差分布趋向一条直线，表明模型的拟合效果好。

2.7.5 粒径（Y2）响应面法分析交互作用

搅拌速度（A）、搅拌温度（B）和搅拌时间（C）的交互作用对粒径Y2的影响的效应面影响结果见图 9-图 11。每当控制一个工艺参数不变，随着另外两个工艺参数变化时，白桦脂醇纳米乳的粒径都呈现先降低后增加的趋势，响应面曲面都很陡峭，越陡峭表明两种因素的交互作用越明显。等高线图皆为闭合曲线，表明3个因素两两之间交互作用明显并且存在最大值，说明模型拟合准确可靠。

2.7.6 最优处方及验证实验

以载药量和粒径为响应值，考察搅拌速度、搅拌温度、搅拌时间之间交互作用对载药量的影响，确定白桦脂醇纳米乳的最佳制备工艺为：搅拌速度1 050 r/min，搅拌温度53 ℃，搅拌时间6.2 min，响应面法所得最佳处方的载药量为5.26 mg/mL，最佳粒径为34.41 nm。对该工艺进行验证实验结果见表 12。预测值与实测值RSD<2%，说明建立的制备工艺准确可靠。

2.7.7 白桦脂醇纳米乳外观描述及结构类型鉴别

最佳处方及工艺制备的白桦脂醇纳米乳呈淡黄色，外观均一、半透明且有淡蓝色乳光，此特征是纳米乳制备成功的标志之一，符合实验方案设计要求。

白桦脂醇纳米乳液的结构类型鉴别结果如图 12所示。苏丹红Ⅲ染料为油溶性染料，易在油相中扩散；亚甲基蓝染料为水溶性染料，易在水溶液中扩散。如果红色的扩散速度大于蓝色的扩散速度，则为W/O型纳米乳，相反则为O/W型纳米乳。两种染色剂同时滴入样品后扩散情况不同，其中蓝色的扩散速度大于红色的扩散速度，表明所制备的白桦脂醇纳米乳液的结构类型为O/W型纳米乳。

3 讨论

笔者课题组查阅大量文献未发现国内外有关白桦脂醇纳米乳的报道，没有前研究可进行比较优化，因此参考已成功制备纳米乳的文献^[17-18]进行白桦脂醇纳米乳的研究。

本研究在预实验中通过溶解度实验和配伍实验对油相、表面活性剂、助表面活性剂进行了初步确定。通常油相选择短链（碳链<8）或中长链（碳链为8~14）的试剂，表面活性剂选用HLB值在8~18范围的非离子型表面活性剂，助表面活性剂选择具有增溶效果、可以改善表面活性剂HLB值的试剂。基于以上条件，本实验油相选择油酸乙酯、IPM、辛酸/癸酸三酰甘油（GTCC）、三乙酸甘油酯、蓖麻油，表面活性剂选择司盘20（Span-20）、Tween-80、RH-40、EL-40，助表面活性剂选择聚乙二醇400（PEG-400）、二乙二醇乙醚、1，2-丙二醇、丙三醇进行实验。

溶解度实验结果显示油相中的三乙酸甘油酯和表面活性剂中的司盘20在室温下黏度高，离心后无法与白桦脂醇分离，不利于含量测定和纳米乳的制备。因此油相初步确定为IPM、GTCC、蓖麻油。表面活性剂初步确定为Tween-80、RH-40、EL-40。助表面活性剂初步确定为1，2-丙二醇、丙三醇和二乙二醇乙醚。最后油相和表面活性剂的配伍实验结果显示，IPM与三种表面活性剂混合都无分层，蓖麻油与EL-40混合无分层，能够配伍。GTCC与3种表面活性剂都配伍失败，混合后静置溶液分层。最终根据溶液外观情况，选择IPM与3种表面活性剂、蓖麻油与EL-40的组合进一步筛选。

综上，本实验确定的白桦脂醇纳米乳处方工艺稳定简便，重复性好，制得的纳米乳载药量较高，届时可根据具体治疗需求，制备为口服、注射和外用等不同的给药方式或凝胶、喷雾剂型等不同剂型，为白桦脂醇纳米乳制剂的开发和应用提供理论依据和技术支持。