2025, Vol. 42文章信息
- 高薇薇, 高万朋, 关鹏.
- GAO Weiwei, GAO Wanpeng, GUAN Peng.
- 基于cGAS-STING通路探讨增液通腑逐瘀方治疗脓毒症大鼠肠屏障功能障碍的机制
- Exploring the mechanism of intestinal barrier dysfunction in septic rats treated with Zengye Tongfu Zhuyu Formula based on cGAS-STING pathway
- 天津中医药, 2025, 42(4): 504-510
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(4): 504-510
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.04.15
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文章历史
- 收稿日期: 2024-12-26
脓毒症是指因感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1]，而肠道被描述为脓毒症和器官衰竭的“发动机”[2]。肠道的屏障功能在其中起着关键的作用，隔肠腔内物质，阻止致病病原体侵袭，由肠上皮细胞（IECs）、细胞间的紧密连接（TJs）及其分泌物、肠相关免疫细胞、肠内正常菌群组成，主要包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障。IECs细胞凋亡被认为是肠道屏障功能障碍的关键加速剂之一，TJs蛋白在调节上皮细胞通透性中发挥着重要作用[3]。因此，IECs及其TJs决定了肠道通透性及肠屏障功能的完整，而在脓毒症状态下，炎症因子释放、组织细胞缺血缺氧，最终导致IECs的死亡及TJS的破坏，造成肠道通透性增高，肠屏障功能障碍。细胞死亡被分为不受调节的形式，如坏死和程序性死亡，后者包括细胞凋亡和坏死性凋亡等。肠通透性的增加与IECs死亡高度相关。不适当的IECs细胞凋亡会促进肠道损伤、肠道屏障功能障碍和细菌易位，从而导致慢性胃肠道疾病，其中适当的细胞凋亡是维持正常状态下肠上皮功能的重要事件。因此，IECs细胞的死亡是肠道炎症的一个标志。
近年来研究发现[4]，在脓毒症肠道损伤过程中，环鸟苷酸腺苷酸合酶（cGAS）-干扰素基因的刺激因子（STING）通路的激活与脓毒症肠道细胞死亡以及肠道稳态改变密切相关，因此深入了解脓毒症发生时cGAS-STING信号通路激活及作用机制及中药对其调控和作用靶点，对于防治脓毒症肠屏障功能障碍具有重要意义。本研究旨在探索增液通腑逐瘀方抑制cGAS-STING通路对脓毒症大鼠IECs损伤的改善作用为脓毒症肠道屏障功能损伤救治提供实验依据。
1 材料 1.1 实验动物健康SPF级雄性SD大鼠36只，8~10周龄，体质量（200±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物许可证号：SCXK（京）2023-0024]，实验期间喂养于天津中医药大学实验动物中心，保持环境恒温（22±2）℃，恒湿（70%），自由饮水，饲料固定，适应性喂养1周。该研究已被天津中医药大学第二附属医院伦理委员会批准（伦理批号：ZYEFY2022-KY-012）。
1.2 实验药物增液通腑逐瘀方制剂购药物组成为：玄参20 g（批号A1086331）、麦冬20 g（批号2301954101）、生地20 g（批号21036131）、生大黄15 g（后入）（批号2204039101）、芒硝10 g（冲）（批号23023503）、红藤30 g（批号230449101）、败酱草30 g（批号21034921），均购入于天津中医药大学第二附属医院饮片药房。将除大黄、芒硝外的药物以水浸泡0.5 h，武火急煎至水开，文火煎45 min，加大黄，再煎15 min，加入芒硝搅匀后冷却至室温，将汤液滤出，分别制成含药0.5 g/mL（低剂量）及1 g/mL（高剂量）的药液。
1.3 主要试剂苏木素染液（武汉塞维尔生物科技，货号：G1002）、伊红染液（武汉塞维尔生物科技，货号：G1003）、PBS缓冲液（武汉塞维尔生物科技，货号：G0001）、cGAS（索莱宝，型号：Q8N884）、Sting（武汉塞维尔生物科技，型号：GB111415）、GAPDH（戴格，货号：db106）、TBK1、pIRF3、pMLKL（美国，Abcam公司，货号：ab40676、ab32536、ab156034）、BCA蛋白定量试剂盒（武汉塞维尔生物科技，货号G2026-200T）、5×蛋白上样缓冲液（武汉塞维尔生物科技，货号：G2075）、SDS-PAGE凝胶试剂盒（诺唯赞，货号：E302-01）、蛋白Marker（雅酶，货号：WJ101）、PVDF膜0.45 μm（武汉塞维尔生物科技，货号：G6015）、ECL显影试剂（武汉塞维尔生物科技，货号：G2020）、电镜固定液（武汉塞维尔生物科技，货号：G1102）、丙酮（国药集团化学试剂有限公司，货号：10000418）、812包埋剂（SPI，型号：90529-77-4）、锇酸（美国，Ted Pella Inc，货号：18456）、醋酸铀（美国，SPI，货号：02624-AB）、柠檬酸三钠（国药集团化学试剂有限公司，货号：10019408）、硝酸铅（美国，Sigma，货号：203580）。
1.4 主要实验仪器4 ℃离心机（湘仪，型号：TGL-16M）、台式低速离心机（博科，型号：TD-4C）、灰度分析软件（美国，NIOH，型号ImageJ）、倒置荧光显微镜（明美，型号：MF52-N）、微量分光光度计（赛默，型号：6MGJ4EVT）、化学发光（申花，型号：SH-compact523）、电泳系统（伯乐，型号：165-8001）、转膜系统（伯乐，型号：1703930）、透射电子显微镜（HITACHI，型号：HT7800/HT7700）。
2 实验方法 2.1 实验分组采用随机数字表法将36只SPF级雄性SD大鼠分为假手术组，模型组，增液通腑逐瘀方低、高剂量组（以下分别简称低剂量组、高剂量组），每组9只。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）造模：大鼠经2%戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉后，采取前腹正中切口，从腹腔中取出盲肠，使用4号丝线在距离盲肠末端1.5 cm处进行结扎，用18号针头在盲肠结扎处远端穿透3次，挤出肠管内排泄物少许，并留置橡皮引流条以防针孔闭合，然后回纳腹腔，逐层关腹。假手术组仅开腹取出盲肠翻动后再次还纳腹腔，不进行结扎和穿刺。
2.2 干预措施增液通腑逐瘀方[玄参20 g，麦冬20 g，生地黄20 g，生大黄15 g（后入），芒硝10 g（冲），红藤30 g，败酱草30 g]，该药物用量为临床治疗有效剂量，根据《中药药理研究方法学》确定给药量计算公式为临床用量×等效剂量系数（按体表面积计算），故给药剂量为低剂量每日12 g/kg（按所含原药材量计算），高剂量每日24 g/kg（按所含原药材量计算），分别制成含药0.5 g/mL（低剂量）及1 g/mL（高剂量）的混悬液低剂量组、高剂量组大鼠术前及术后24 h以5 mL/kg的剂量分别予低、高剂量增液通腑逐瘀方灌胃，模型组及假手术组给予同体积生理盐水灌胃。各组给药按照每天2次，连续给药3 d。给药期间观察大鼠一般状态。
2.3 取材术后48 h统一处死的动物，留取回肠组织标本，常规制备石蜡切片，室温保存备用。另取部分回肠组织进行盐水充分洗涤，装置于-80 ℃存储，用于后续检测。
2.4 观察指标 2.4.1 大鼠肠黏膜形态学检测采用苏木精-伊红（HE）染色法：将制备好的病理学切片（厚度4 μm），脱蜡、复水、苏木素核染，予分化、蓝化后行伊红染色，最后进行脱水、封片，显微镜镜下观察肠黏膜形态学改变，采用Chiu’s评分判定肠组织损伤程度。
2.4.2 回肠组织超微结构检测取出回肠组织，切成1 mm3小块，2.5%戊二醛进行前固定，1%锇酸后固定，乙醇梯度脱水，Epon 812包埋，制备超薄切片（60~80 nm），透射电子显微镜下观察各组回肠细胞及细胞间紧密连接变化。
2.4.3肠道cGAS、STING、TANK结合激酶1（TBK1）、磷酸化干扰素调节因子3（pIRF3）及磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白（pMLKL）检测。
采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）：将取出的样本切成100 mg大小的小块，经盐水充分洗涤后吸干水分，经裂解研磨后离心，12 000 r/min，离心半径13 cm，4 ℃，离心10 min，提取上清液，测定待测样品的蛋白质量浓度。变性还原后，经SDS-PAGE电泳分离，PVDF膜转膜，PBST洗膜3次，每次10 min，于摇床上利用快速封闭液封闭15 min左右；按照抗体说明书，利用一抗稀释液进行一抗稀释（1∶1 500），配制好后，弃去封闭液，PBST洗膜3次，每次5 min，加入配制好的一抗，4 ℃孵育过夜（摇床慢摇）；回收一抗，PBST洗膜3次，每次10 min；利用TBST将二抗按照1∶1 000的比例稀释，后将膜于摇床上室温下二抗孵育60 min；PBST洗膜，每次10 min，洗3次。蛋白条带经ECL化学发光检测试剂避光孵育后，凝胶成像系统采集目标蛋白及内参蛋白的条带，用Image J分析软件测定上述蛋白条带的灰度值。以各组目标蛋白条带灰度值与相应内参条带灰度值的比值来判定分析目的蛋白灰度值。
2.4.4 肠道细胞凋亡率检测按照原位缺口末端染色（TUNEL）试剂盒操作步骤，检测细胞凋亡，将病理学切片经脱蜡、复水，滴加100 μL不含DNA的蛋白酶K于组织切片上修复，后破膜，并予阻断内源性过氧化物酶，经室温平衡后加反应液，再予DAB显色、苏木素复染，水洗，返蓝再水洗后，脱水封片。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出来的阳性凋亡细胞核为棕黄色。应用荧光显微镜采集图像并进行半定量分析。
2.5 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行数据分析，本实验所有研究均符合正态分布，GraphPad Prism 9.0软件进行柱状图制作，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LST-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 各组大鼠肠黏膜形态学的比较假手术组可见致密紧凑的小肠黏膜绒毛，无绒毛脱落和倒伏。模型组可见部分绒毛脱落以及倒伏，固有层部分脱落，可及裸露的毛细血管扩张，甚至固有层蜕变或被消化，出血及溃疡形成。低剂量组和高剂量组对于固有层脱落及绒毛倒伏较模型组均有改善作用，其中高剂量组改善更明显。与假手术组比较，模型组大鼠肠Chiu’s评分显著升高（P<0.01）。与模型组比较，增液通腑逐瘀方低、高剂量组大鼠Chiu’s评分显著降低（P<0.01）。说明增液通腑逐瘀方对于脓毒症大鼠肠黏膜损伤具有修复作用。见图 1、2。
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| 图 1 肠黏膜HE染色（×100） Fig. 1 HE staining of the intestinal mucosa(×100) |
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| 注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。 图 2 各组肠道Chiu’s评分比较 Fig. 2 Comparison of intestinal Chiu's score in each group |
透射电镜可见假手术组IECs形态结构正常，微绒毛结构完整，排列整齐，高度一致，细胞间紧密连接清楚，无损伤；模型组吸收上皮细胞的微绒毛稀疏、缺损，细胞间隙增宽，细胞间连接装置损坏；低、高剂量组肠道结构受损情况均有不同程度改善，见图 3。
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| 图 3 各组电镜下肠道超微结构表现（×8 000） Fig. 3 Ultrastructural findings of each group under electron microscope(×8 000) |
与假手术组相比，模型组cGAS及STING相对表达量均升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，低剂量组cGAS及STING相对表达量均有所下降，但差异无统计学意义（P>0.05），而高剂量组cGAS及STING相对表达量均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见图 4。与假手术组相比，模型组TBK1、pIRF3及pMLKL相对表达量均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比，低剂量组TBK1、pIRF3相对表达量降低，差异有统计学意义（P<0.05），而pMLKL相对表达量差异无统计学意义（P>0.05），高剂量组上述指标相对表达量降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见图 5。
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| 注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。 图 4 各组cGAS、STING相对表达量比较 Fig. 4 Comparison of the relative expression levels of cGAS and STING in each group |
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| 图 5 各组TBK1、pIRF3、pMLKL相对表达量比较 Fig. 5 Comparison of the relative expression levels of TBK 1, pIRF 3, and pMLKL in each group |
与假手术组相比，模型组凋亡率升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，低剂量组凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05），高剂量组凋亡率下降，差异有统计学意义（P<0.01）。见图 6、7。
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| 注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。 图 6 各组凋亡率比较 Fig. 6 Comparison of the apoptosis rates in each |
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| 注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。 图 7 各组凋亡相关蛋白表现（×200） Fig. 7 Performance of apoptosis-related proteins in each group(×200) |
“血液瘀滞，津亏气弱，热结腑实”是脓毒症肠屏障损伤的病机关键。而活血化瘀贯穿始终，兼以养阴增液、通腑泻热是脓毒症肠屏障功能损伤的主要治则。使用活血化瘀、养阴增液及通腑泻热的治法，打破瘀毒互结，瘀滞渐化，养津生液，疏通腑气，可以及时调整胃肠功能，适时阻断炎性反应的恶性循环，最终改善肠屏障功能障碍。增液通腑逐瘀方在增液承气汤基础上加味而成，该方由玄参、麦冬、生地、生大黄、芒硝、红藤、败酱草组成，具有益气养阴、通腑泻热、活血化瘀的功效。方中大黄性寒味苦，具有通腑、泄热、逐瘀等功效；现代药理研究发现，大黄具有促进大肠蠕动，加快毒素排泄，减少肠道菌群移位，维护胃肠屏障功能[5]。近年来相关临床研究证实了大黄素可以抑制脂多糖（LPS）诱导的心肌细胞的炎症反应及凋亡[6]，其抗炎作用是由抑制核因子-κB（NF-κB）信号传导途径引起的，而cGAS-STING信号通路可以磷酸化NF-κB。芒硝为中国传统中药，性苦，味寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、清利湿热的功效[7]。大黄与芒硝共为君药，起到消除积滞、润肠通便、通腑泻浊之功，是全方“治肠”理念的最好体现。玄参滋阴润燥，润肠通便，麦冬滋阴润肺，益胃生津，助玄参“通二便”之用，生地黄清胃热，养胃阴，生津液，与麦冬相伍可以“补肺阴，壮肾水，使金水相生，津自充而肠自润”。诸药合用，养阴增液，使肠得润，热得除而便自通。在原方基础上，加入了红藤、败酱草，红藤活血通络，败毒散，够发挥广谱抗菌功能，对消除病原微生物有重要作用[8]。败酱草清热解毒，消痈排脓，活血行瘀。败酱草中有良好治疗作用的是木犀、草素、槲皮素、山奈酚等。现代研究表明，三者均可减少诸多炎性因子，如促炎因子白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和环氧化酶-2（COX-2），具有明显的抗菌消炎作用；败酱草还能增强网状细胞和白细胞的吞噬能力，提高机体的抗感染力，促进抗体形成，从而达到抗菌消炎的目的[9-11]。
细胞死亡被认为是脓毒症期间维持肠上皮重要稳态和致病机制[12]。既往研究表明STING信号的增加与肠道炎症的升高和诱导人肠道IECs凋亡有关[13]。STING基因促进了脂多糖（LPS）诱导的IECs凋亡，增加炎症反应，提示STING信号是IECs凋亡、肠道稳态的重要介质，是脓毒症重要调节因子。
STING是一种参与对细菌产物先天免疫应答的适配器蛋白，除了微生物感应之外，STING也能被宿主自身DNA激活[4]并被cGAS及其第二信使-环鸟苷酸腺苷酸（cGAMP）识别[14]，随后招募TANK结合激酶1（TBK1），并磷酸化干扰素调节因子3（IRF3）和NF-κB，诱导先天免疫基因转录，有助于最终产生Ⅰ型干扰素和许多其他炎性细胞因子，如IL-6和TNF-α，从而导致过度的回肠炎症和广泛的上皮细胞坏死。STING通过促进多种转录因子的磷酸化来调控基因表达，如STAT3、STAT6、IRF3和NF-κB[15-16]。IRF3是一个研究充分的靶点，它在CLP诱导的脓毒症中起着有害的作用[17]。STING，TBK1，和磷酸化的IRF3蛋白也增加在脓毒症组[18]，因此，cGAS-STING信号及其TBK1及IRF3表达可能是脓毒症期间细胞死亡上调的罪魁祸首。
坏死性凋亡是一种细胞死亡方式，是一种程序性细胞死亡机制的炎症形式，具有坏死表型特征，但不是凋亡[19]。STING信号通路通过磷酸化机制驱动坏死性凋亡。这种死亡最初被报道与受体相互作用蛋白激酶（RIPK）-1和RIPK3有关。刺激后，RIPK1和RIPK3被坏死体复合体中的自身磷酸化激活。随后，混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）被招募并被RIPK3磷酸化，导致MLKL寡聚。寡聚MLKL转运到细胞膜上，促进质膜通透性，从而引发坏死性凋亡。因此MLKL目前被认为是介导这种形式死亡的主要靶点，可能作为肠道损伤的生物标志物[20]。这些发现可以指导肠屏障功能障碍的治疗。
在本次研究发现脓毒症发生时，肠黏膜完整性被破坏，超微结构下肠绒毛及TJs受损，肠屏障功能障碍，而cGAS-STING通路及其下游相关蛋白酶和调节因子表达增强，证实了肠黏膜完整性改变与该通路相关，不仅如此，模型组肠道细胞凋亡率显著增加，且坏死性凋亡的标志蛋白pMLKL显著增加，说明cGAS-STING通路不仅诱导了炎症反应，还诱导了肠道细胞的凋亡及坏死性凋亡，最终导致了肠道完整性受损，肠道稳态改变，造成肠屏障功能障碍。而增液通腑逐瘀方低剂量和高剂量组干预下，脓毒症大鼠肠道细胞受损明显减轻，病理学评分减低，电镜下肠道微结构均有不同程度改善，cGAS、STING、TBK1及pIRF3表达均不同程度减少，说明增液通腑逐瘀方对cGAS-STING通路可以起到抑制效果，并且还可抑制下游关键蛋白酶和相关调节因子磷酸化，减轻肠道炎症反应。不仅如此，通过TUNEL凋亡检测和pMLKL相对表达量检测，增液通腑逐瘀方可以抑制肠道细胞的凋亡以及坏死性凋亡过程中关键蛋白的磷酸化过程，最终减少肠道损伤，维持肠道完整性和稳态，改善脓毒症肠屏障功能障碍，其机制考虑与该方抑制cGAS-STING通路表达进而抑制了关键蛋白的磷酸化过程，最终减少了细胞死亡（包括凋亡和坏死性凋亡）发生相关。
综上所述，增液通腑逐瘀方可以抑制脓毒症时cGAS-STING通路被激活，抑制关键蛋白酶的表达和调节因子的磷酸化过程，减少肠道炎症反应，进而减少肠道细胞的凋亡和坏死性凋亡，最终维持肠黏膜屏障完整性和肠道稳态。这对于揭示脓毒症肠屏障功能障碍的病生理机制及中药对其防治作用和靶点，具有重要的意义。本次研究中增液通腑逐瘀方抑制cGAS-STING信号通路的具体作用靶点以及如何调控下游关键蛋白和细胞因子的转录、表达仍有待于进一步研究，在后续的研究中对其机制进行进一步阐述。
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