2025, Vol. 42文章信息
- 马耀磊, 周凤洁, 李霄, 等.
- MA Yaolei, ZHOU Fengjie, LI Xiao, et al.
- 丹参酚酸改善心肌纤维化的潜在机制研究
- Mechanism research of salvianolic acids treating myocardial fibrosis
- 天津中医药, 2025, 42(5): 621-629
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(5): 621-629
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.05.13
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文章历史
- 收稿日期: 2025-01-13
2. 天津中医药大学组分中药国家重点实验室, 天津 301617;
3. 天津中医药大学现代中药创制全国重点实验室, 天津 301617;
4. 河北大学药学院, 保定 071002
《中国心血管健康与疾病报告2022》指出，当前中国心血管疾病发病率呈持续增长趋势[1]。据预测，到2030年，中国心血管病患者人数将达到2 130万，死亡人数将上升至770万[2]。心肌纤维化是心肌炎、心肌梗死以及心力衰竭等心血管疾病发展过程中普遍存在的病理变化过程，主要表现为心肌成纤维细胞大量增殖、活化，细胞外基质代谢紊乱导致沉积，形成瘢痕组织，由此产生心脏结构改变、心肌收缩及舒张功能障碍，最终导致心力衰竭和死亡等严重后果[3-4]。由于心肌纤维化的诱因多样、生物信号网络复杂，并且缺乏有效的干预药物和治疗手段，改善心肌纤维化已成为心脏疾病临床预防与治疗的瓶颈问题。
心肌纤维化是多种心血管疾病发展过程中的共同病理表现，缺血、压力负荷过重和代谢紊乱等变化刺激静息状态的心肌成纤维细胞发生增殖、迁移、转分化为肌成纤维细胞，表达收缩型蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），同时产生大量的Ⅰ型胶原蛋白（COLI）和Ⅲ型胶原蛋白（COLⅢ），导致胶原结构失衡和紊乱[5]。在心肌成纤维细胞发生表型转化时，分泌大量胞外因子和炎症因子，导致心肌细胞的胶原表达异常、内皮细胞和免疫细胞活化等[6]。现有的心血管疾病治疗药物如血管紧张素转换酶抑制剂或矿化皮质激素受体拮抗剂，虽然对心肌纤维化过程表现出了一定的改善作用，但其特异性和有效性仍不能满足对心肌纤维化的治疗效果[7]。
中医将心肌纤维化归属于“胸痹、真心痛、心悸、怔忡”等范畴，认为其核心病机是气虚血瘀，因此中医治疗以益气温阳、活血化瘀为主[8]。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦等功效，丹参酚酸（SAs）是丹参发挥药效的重要活性组分[9]。现代药理学研究显示SAs在改善肿瘤、心脏缺血性损伤和纤维化疾病等方面发挥了明显的临床前疗效[10-11]。笔者课题组前期研究显示SAs中重要活性成分丹参素可以直接靶向细胞外信号调节激酶2（ERK2）蛋白，破坏ERK2二聚体形成以及188位苏氨酸的磷酸化，从而改善了缺血导致的心脏结构重塑[12]。基于前期研究基础，在本研究中笔者结合LC-MS成分表征和网络药理学研究方法，对SAs改善心肌纤维化的作用机制进行研究，为SAs治疗心肌纤维化的应用提供研究支撑。
1 材料和方法 1.1 实验药材和试剂转化生长因子-β1（TGF-β1，货号80116-RNAH）购自北京义翘神州科技股份有限公司，BCA蛋白定量试剂盒（货号23225）购自美国THERMOFISHER公司，胶原蛋白1A1（COL1A1）抗体（货号ab34710）、胶原蛋白3A1（COL3A1）抗体（货号ab7778）购自美国Abcam公司，基质金属蛋白酶2（MMP2）抗体（货号A6247）、基质金属蛋白酶9（MMP9）抗体（货号A11147）、山羊抗兔-辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（货号AS014）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ，货号HY-13948）购自MedChemExpress生物科技公司。细胞培养耗材均购自Gibco BRL生物技术公司。其他化学试剂均为分析级。SAs来源于天津天士力药业股份有限公司（Z20110011）。
1.2 细胞培养大鼠心肌H9c2细胞和大鼠心肌成纤维细胞购自青旗（上海）生物技术发展有限公司。DMEM培养基加入100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和10%胎牛血清。将生长状态良好的H9c2细胞消化重悬后，以密度5×104个/mL，每孔2 mL均匀接种于6孔板内，再加入0.5 mL完全培养基，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。
1.3 CCK-8细胞活力检测使用DMEM培养基将SAs稀释为500、250、100、50、25、0 μg/mL，处理后的H9c2细胞和大鼠心肌成纤维细胞置于5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养24 h。按照说明书配置CCK-8工作液，DMEM培养基：CCK8原液=9∶1。吸弃96孔板培养基，每孔加入CCK-8工作液100 μL，在37 ℃孵箱孵育1 h，用酶标仪测定450 nm处吸光度。
1.4 细胞处理和分组大鼠心肌成纤维细胞表型转化模型：空白组（Con），使用DMEM培养基培养细胞；模型组（Mod），使用含10 ng/mL TGF-β1的DMEM培养基培养细胞；SAs低、中、高剂量组，使用含10 ng/mL TGF-β1，同时分别含有25、50、100 μg/mL SAs的DMEM培养基培养细胞，给药处理后的细胞置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。
H9c2细胞模型：空白组（Con），使用DMEM培养基培养细胞；模型组（Mod），使用含10 μmol/L Ang Ⅱ的DMEM培养基培养细胞；SAs低、中、高剂量组，使用含10 μmol/L Ang Ⅱ，同时分别含有25、50、100 μg/mL SAs的DMEM培养基培养细胞，处理后的细胞置于5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养24 h。
1.5 实时聚合酶链锁反应（q-PCR）检测收集心肌成纤维细胞加入TRizol裂解液提取总RNA，使细胞总RNA的OD260/OD280为1.8~2.0，按照Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR说明书进行逆转录，按照Hieff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix说明书进行扩增，反应条件：预变性95 ℃，2 min，1个循环，变性95 ℃，10 s，退火60 ℃，30 s，40个循环，用GAPDH为RNA内参基因，采用2-ΔΔCt计算RNA的相对含量，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列见表 1。
向H9c2心肌细胞培养皿中加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，根据BCA蛋白定量的结果，加入5×上样缓冲液，98 ℃金属浴加热5 min，获得蛋白样品。制备8%或12%聚丙烯酰胺凝胶，并将蛋白样品加载到凝胶上进行分离，电泳分离后半干转置到聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉配置一抗溶液，分别加入一抗COL1A1（1∶1 000）、COL3A1（1∶1 000）、MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）孵育蛋白条带，4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶2 000）室温孵育1 h，用ECL发光液浸泡的条带，在显微成像仪器中曝光，采用Image J软件测定灰度值分析各组蛋白的表达水平。
1.7 LC-MS分析精密称取SAs冻干粉10 mg置于1.5 mL微型离心管中，加入1 mL超纯水超声溶解，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得10 mg/mL供试品溶液。
UPLC色谱仪（型号1290，德国Agilent公司），流动相A为体积分数0.2%甲酸水溶液，流动相B为体积分数2%甲醇乙腈溶液，采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）柱梯度洗脱，洗脱程序见表 2，流速为0.3 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长分别为280 nm和330 nm。
QTOF质谱仪（型号6520德国Agilent公司）利用控制软件（Xcalibur，Thermo Fisher Scientific）基于FullScan-ddMS2功能进行一、二级质谱数据采集。条件为：ESI负离子模式扫描，雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；碰撞能量6 eV；扫描范围m/z：100~1 200；MSE梯度裂解能量20~40 eV。
1.8 网络药理学分析 1.8.1 小分子靶点预测使用TCMSP数据库（https://tcmsp-e.com/）检索SAs的活性成分及靶点。以口服生物利用度（OB）≥ 30%、类药性（DL）≥ 0.18来筛选SAs的成分[13]。获取活性化合物对应的靶点，并删除无效重复靶点。通过Uniprot（https://www.uniprot.org/）校准靶点得到标准化的基因名。
1.8.2 抗心肌纤维化核心靶点预测以Myocardial fibrosis（MF）为关键词，使用OMIM、GeneCards、和DisGeNET等数据库挖掘心肌纤维化疾病的靶标基因。对疾病靶基因进行去重筛选并得到疾病相关靶标集合。心肌纤维化相关的作用靶点与SAs的作用靶点进行关联分析，利用Venn分析获得SAs作用靶点与心肌纤维化疾病靶点的交集靶点。
使用STRING数据库构建SAs成分抗心肌纤维化的蛋白-蛋白互作（PPI）网络图，交互作用评分设为0.7，生物体填选“Homo”，下载保存PPI.tsv数据。借助Cytoscape 3.7.1软件绘制构建“靶点蛋白相互作用”关系网络，同时利用该软件中CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑分析，以介度中心性、对接中心性、度自由性和Degree值等为筛选标准，筛选评分靠前的30个靶点作为SAs抗心肌纤维化核心靶点[14]。
1.8.3 生物通路富集使用DAVID数据库将交集靶点进行GO生物过程和KEGG通路富集分析，得到通路富集文件，以P≤0.05为标准进行筛选，借助微生信工具平台进行可视化分析，得到GO柱状图和KEGG气泡图。
1.9 统计学分析实验数据采用SPSS 26.0或者GraphPad Prism 9统计软件处理分析，计量资料呈正态分布，以均数±标准差（x±s）表示；对符合正态分布和方差齐性数据采用单因素方差分析，多个样本均数间的多重比较采用LSD-t检验。如不能满足正态性或方差齐性，采用非参数检验方法如Mann Whitney检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 SAs细胞活力分析H9c2心肌细胞和心肌成纤维细胞的CCK-8细胞活力实验说明，100 μg/mL及以下浓度SAs对于两种细胞活力没有明显影响，500 μg/mL的SAs对于两种细胞具有明显细胞毒性（P < 0.001），见图 1。因此本研究选择25、50、100 μg/mL剂量作为低、中、高剂量进行后续研究。
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| 注：与0 μg/mLSAs给药相比，***P＜0.001，n=8。 图 1 不同浓度SAs对H9c2和心肌成纤维细胞活力的影响 Fig. 1 Effects of different concentrations of SAs on H9c2 and cardiac fibroblast viability |
COLⅢ、COLI和α-SMA是心肌纤维化的重要指标因子，TGF-β1刺激导致了心肌成纤维细胞高表达COLⅢ、COLI和α-SMA，说明心肌成纤维细胞发生了向肌成纤维细胞的表型转化，SAs可以剂量依赖性地减少COLⅢ、COLI和α-SMA表达（图 2）。由此说明SAs抑制了TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞表型转化。
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| 注：与Con相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与MOD相比，#P＜0.05，##P＜0.01，n=6。 图 2 SAs对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞中COLⅢ、COLI和α-SMA表达的影响 Fig. 2 Effects of SAs on COLⅢ, COLI and α-SMA expression in TGF-β 1-induced cardiac fibroblasts |
心肌纤维化中过度沉积的胞外基质主要为交联的Ⅰ型胶原纤维和Ⅲ型胶原纤维，SAs有效减少了胶原纤维的含量；MMP主要作用为维持胶原纤维生成和降解的平衡，过度产生的MMP损坏心肌正常纤维组织，并促进正常基质胶原向过度交联的Ⅰ型胶原纤维和Ⅲ型胶原纤维转变，SAs给药改善这一情况。结果如图所示，与Con相比，Mod的MMP2、MMP9、COL1A1、COL3A1蛋白表达水平升高；SAs给药后MMP9、COL1A1、COL3A1蛋白表达水平有明显下调趋势，且成浓度依赖性。MMP2蛋白水平呈现下调趋势，但差异无统计学意义（图 3）。以上结果表明，SAs给药能减少H9c2的胶原含量并抑制MMP9的高表达，体现了抗纤维化的药理作用。
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| 注：与Con相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与MOD相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，n=3。 图 3 SAs对TGF-β1诱导的H9c2细胞COLIA1、COL3A1、MMP2和MMP9表达的影响 Fig. 3 Effects of SAs on the expression of COLIA1, COL3A1, MMP2 and MMP9 in H9c2 cells induced by TGF-β1 |
结果如图所示，与Con相比，Mod的MMP2、MMP9、COL1A1、COL3A1蛋白表达水平升高；SAs给药后，MMP2、MMP9、COL1A1蛋白表达明显受到抑制，COL3A1蛋白水平呈现下调趋势，以上结果表明，SAs能改善H9c2的胶原异常沉积情况并有效抑制Ang Ⅱ诱导的MMP高表达，具有抗纤维化药理作用。见图 4。
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| 注：与Con相比，*P＜0.05；与Mod相比，#P＜0.05，##P＜0.01，n=3。 图 4 SAs对AngⅡ诱导的H9c2细胞COLIA1、COL3A1、MMP2和MMP9表达的影响 Fig. 4 Effects of SAs on the expression of COLIA1, COL3A1, MMP2 and MMP9 in H9c2 cells induced by AngⅡ |
采用UPLC-Q-TOF-MS对SAs进行定性分析，得到SAs负离子模式下的总离子流图（图 5）。将色谱图中的分子离子峰及二级碎片离子信息进行分析，共鉴定出24个化合物，结果见表 3。这24个化学成分中，有15个成分为丹参素和丹参酚酸A衍生的酚酸类化合物。
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| 图 5 SAs的UPLC-Q-TOF-MS负离子模式下的质谱总离子流图 Fig. 5 Mass spectrometry total ion chromatogram of SAs in UPLC-Q-TOF-MS negative ion mode |
使用UPLC-Q-TOF-MS技术对SAs化学成分进行研究，共鉴定出24个化学成分，主要包括丹参酚酸A、丹参素、丹参酚酸B、迷迭香酸等。这些酚酸类成分是SAs防治心肌纤维化的药效物质基础。
2.6.1 药物活性成分筛选及作用靶点预测基于UPLC-Q-TOF-MS技术对SAs化学成分进行表征，得到24个化学成分，利用Swiss Target Prediction、TCMSP数据平台，共有14个化学成分成功预测到潜在作用靶点，共得到SAs潜在作用靶点480个。
2.6.2 心肌纤维化潜在作用靶点筛选及SAs抗心肌纤维化作用靶点获取通过OMIM、GeneCards及DisGeNET数据库检索心肌纤维化疾病靶点9 116个，将心肌纤维化疾病靶点与SAs成分作用靶点关联分析得到交集靶点359个，绘制Venn（图 6A）。
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| 图 6 核心治疗靶点蛋白互作关系网络图 Fig. 6 Network diagram of protein-protein interactions of core therapeutic targets |
将得到的359个交集靶点转化输入Cytoscape 3.7.1软件中，用CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑分析，并进一步筛选出评分最靠前的30个靶点作为核心靶点。构建蛋白互作网络图，如图 6B。以上实验结果说明，SAs抗心肌纤维化的药效可能与调控STAT3、PPARG、MMP9、TNF等靶基因有关。
2.6.4 GO生物过程和KEGG通路富集分析通过DAVID数据库对SAs-心肌纤维化交集靶点进行GO生物功能富集分析。根据P < 0.05选择分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组分（CC）富集前10条目进行可视化，如图 7，生物过程主要涉及心肌纤维化炎症（inflammatory response）、缺氧（response to hypoxia）、细胞外基质（extracellular matrix）分解等，细胞成分涉及细胞膜（plasma membrane）、线粒体（mitochondrium）等，分子过程则主要集中在蛋白激酶结合（protein kinase binding）、蛋白丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶活性（protein serine/threoine/tyrosine kinase activity）方面。进一步通过DAVID数据库对SAs防治心肌纤维化的作用靶点进行KEGG通路富集分析（P < 0.05），发现其功能主要富集在调控脂质和动脉硬化过程、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信号通路、HIF-1信号通路等生物过程中KEGG富集分析气泡图见开放科学OSID标识码。
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| 图 7 GO功能注释条形图 Fig. 7 GO function annotation bar chart |
心肌纤维化指间质性心肌胶原网络因全身性疾病、心脏缺血性损伤或其他影响循环系统的有害刺激而发生的各种组织病理变化。心肌纤维化破坏心肌结构，引起心律失常、导致心功能不全，最终影响心力衰竭患者的临床病程和预后[15]。心肌纤维化的严重程度与心脏病患者（尤其是心力衰竭患者）的病死率呈正相关[16]。心肌纤维化可分为间质性（弥漫性）纤维化和替代性纤维化（瘢痕纤维化）两类[17]。弥漫性纤维化常发生于高血压、主动脉瓣狭窄和心肌病等心脏病中，其特征是细胞外胶原弥漫性扩散而无心肌细胞坏死。替代性纤维化是心肌梗死后心肌成纤维细胞代偿增殖，用瘢痕代替正常心肌组织，进而促进心功能不全发展，从而引起心力衰竭的过程[18]。
前人研究发现，哺乳动物心脏间质中的心肌成纤维细胞、心肌细胞、内皮细胞和免疫细胞等均参与了心肌纤维化的病理发展过程，其中心肌成纤维细胞在心肌纤维化过程中处于核心地位。在正常生理条件下，心肌成纤维细胞分泌低水平的胞外基质。然而，在缺血、压力负荷等病理刺激下，心肌成纤维细胞被激活，发生异常增殖、迁移并分化为肌成纤维细胞，表达α-SMA（表型转化的特异性标志物），同时产生高水平的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖，并分泌MMPs及其抑制剂，参与心肌纤维化重塑的发生、发展[5, 19]。研究显示，大约有85%的心肌成纤维细胞来源于心外膜细胞，而另外15%来自内皮细胞[20]。在此过程中，心肌细胞通过向心脏间质和血管周围分泌过多的COL Ⅰ、α-SMA以及波形蛋白，导致胶原蛋白过度沉积，推动心肌纤维化的发展[21]。同时，内皮细胞还可分泌促纤维因子内皮素1，促进心肌细胞的增殖、分化和胞外基质的异常沉积[22]。此外，已有研究表明免疫细胞也参与了心肌纤维化的发生和调控，当心脏损伤发生时，巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞等通过分泌大量的成纤维介质，包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6、TGF-β和血小板衍生生长因子，促进心肌成纤维细胞表型转化和胞外基质合成[23]。
SAs改善心肌纤维化的作用已被多项研究证实。Qiu等[24]研究证实丹参多酚酸盐可显著减轻左前降支冠状动脉结扎引起的大鼠心功能障碍，抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路介导的胶原沉积，预防心房间质纤维化的发生。马丽霞等[25]发现丹参多酚酸可显著改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能，降低胶原容积分数和羟脯氨酸含量，减少COLⅠ、COL Ⅲ等纤维化相关指标在左心室梗死区域表达，抑制心力衰竭大鼠心肌纤维化。贺欣等[26]采用异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化模型，发现丹参多酚酸盐能降低心脏指数、羟脯氨酸含量和胶原容积分数，改善心肌的组织病理学改变，抑制异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化。
本研究结果显示，在TGF-β1刺激下，SAs可以剂量依赖性地减少COLⅢ、COLI和α-SMA表达，抑制心肌成纤维细胞的表型转化。此外，SAs还能够抑制由TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞中COLIA1、COL3A1、MMP2和MMP9高表达，改善由Ang Ⅱ刺激产生的H9c2细胞中COLIA1、MMP2和MMP9高表达。
为了探究SAs改善心肌纤维化的潜在机制，笔者通过UPLC-Q-TOF-MS技术对SAs化学成分进行表征并结合网络药理学分析SAs抗心肌纤维化的药效物质和潜在作用靶点以及生物途径。本研究通过Venn图分析发现，SAs与心肌纤维化存在359个交集靶点基因，筛选出STAT3、PPARG、MMP9、TNF等30个核心靶点基因；基于这30个核心靶点，GO功能分析显示，SAs发挥抗心肌纤维化作用主要涉及心肌纤维化炎症、细胞外基质分解等生物过程；KEGG富集结果表明，SAs与心肌纤维化相关的靶基因主要富集在脂质和动脉硬化过程、PI3K-AKT信号通路。STAT3是一种信号传导及转录激活蛋白，可增加炎症介质的表达，促进细胞的增殖及迁移。有研究显示，STAT信号通路参与糖尿病大鼠心肌纤维化过程[27]。PPARG是一种核受体，属于过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）家族的一员。研究表明，PPARG在肝脏、肾脏等多种器官纤维化中表现出抗纤维化作用[28]。MMP9作为基质金属蛋白酶家族的一员，具有降解细胞外基质中多种成分的能力，包括胶原纤维。在心肌纤维化过程中，MMP9的过度表达或活性增强可能导致正常的心肌胶原纤维被过度降解，从而破坏心肌组织的正常结构[29]。TNF是一种重要的炎症因子，通过诱导心肌成纤维细胞增殖、促进细胞外基质沉积和参与炎症反应等方式参与心肌纤维化的形成和发展过程[30]。
综上，本研究发现SAs可以剂量依赖性地抑制心肌成纤维细胞表型转化过程，并能够改善H9c2心肌细胞中COLIA1、COL3A1、MMP2和MMP9高表达。SAs化学成分复杂，主要包括丹参酚酸A、丹参素、丹参酚酸B、迷迭香酸等，其发挥抗纤维化过程与调控STAT3、PPARG、MMP9、TNF等靶基因和动脉硬化过程、PI3K-AKT信号通路密切相关。目前，尚无美国食品药品监督管理局（FDA）批准的可用于治疗心肌纤维化的生物或化学药物，且对于心血管疾病患者的心肌纤维化尚无特异性的治疗方法，本研究说明SAs对心肌纤维化发挥了有效的保护作用，为心肌纤维化的防治提供新的思路和研究方向。
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4. College of Pharmaceutical Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China