2025, Vol. 42文章信息
- 徐亚洁, 杜岩, 方步武.
- XU Yajie, DU Yan, FANG Buwu.
- 酸性鞘磷脂酶-神经酰胺-ERK1/2信号通路在青蒿琥酯抗肝纤维化中的作用
- Artesunate inhibits liver fiber generation through the acid sphingomyelinase-ceramide-ERK1/2 signal pathway
- 天津中医药, 2025, 42(5): 630-637
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(5): 630-637
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.05.14
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文章历史
- 收稿日期: 2025-01-13
2. 天津市蓟州区人民医院药剂科, 天津 301900;
3. 天津医科大学药理学教研室, 天津 300070
肝脏疾病的发生发展模式一般是“肝炎-肝纤维化-肝硬化/肝癌”[1]。目前研究认为肝纤维化是一个中间阶段，可以逆转[2]，故研究其发病机制，寻找可能防治其的新途径及药物具有重要意义。肝纤维化是肝脏对多种因素如病毒、乙醇、胆汁淤积、药物等导致的重复性肝损伤和炎症的创伤愈合反应，其病理特征是细胞外基质在肝内大量沉积，其发生机制主要涉及肝细胞损伤、炎症反应、肝星状细胞（HSCs）激活和细胞外基质沉积等[3]，其中HSCs的激活是其发生的细胞学基础[4]。鉴于肝纤维化发生病因及发生机制复杂，到目前为止，尚未有高效、不良反应小的可预防或逆转其的药物被批准用于临床[5]。
近年来，中药因其疗效显著、多靶点、多通路的独特优势，在肝纤维化的防治研究中日显优势[6-7]。青蒿琥酯（Art）是青蒿素的半合成衍生物之一，早已被广泛用于治疗疟疾，现越来越多的研究表明其还具有抗病毒、抗肿瘤、抗风湿、调节免疫等作用。笔者课题组首次提出了Art的抗肝纤维化作用[8]，近年来国内外学者也进行了有关Art对肝脏作用的研究，发现其具有抗肝癌、抗肝炎病毒、保护肝细胞、抗肝纤维化等作用。笔者课题组前期研究发现Art能治疗和预防四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化[8]及牛血清白蛋白诱导的免疫性大鼠肝纤维化[9-10]，并可抑制大鼠原代HSCs的增殖来发挥抗肝纤维化作用[11-12]，但Art对人源HSCs的作用未见报道。
近年来，鞘脂组学的研究成为热点，神经酰胺（Cer）是鞘脂生物合成的中心脂质，由长链鞘胺醇通过酰胺键与脂肪酸共价结合而成，按其脂肪酸饱和度和羟基含量被分为不同亚型。其作为重要的脂质第二信使分子，是细胞分化、生长抑制和凋亡的诱导剂，在许多疾病如癌症、心脏病、肥胖、纤维化疾病等中具有重要作用[13]，尤其是在调控肿瘤细胞凋亡方面已进行了较多研究，但其在肝纤维化中的作用鲜有报道。目前已有极少量研究者关注到了鞘脂及Cer与肝脏疾病的关系[14-16]，探索了其在酒精性肝病、非酒精性肝病等肝脏疾病中的作用，笔者课题组前期研究亦发现：外源性及内源性Cer均具有抗肝纤维化作用[17-18]。但Art发挥抗肝纤维化作用，是否与Cer有关，目前未见报道。
Cer在生物体内的合成代谢途径主要包括在内质网中发生的饱和脂肪酸从头合成途径[19]、通过鞘磷脂酶将存在于细胞膜中的鞘磷脂转化为Cer的鞘磷脂水解途径[13]和溶酶体中的补救回收途径[20]。鞘磷脂酶按照最适宜pH环境可分为酸性、中性及碱性鞘磷脂酶。其中酸性鞘磷脂酶（ASMase）生物学活性占鞘磷脂酶总活性的90%，是目前调节Cer生成研究中重要的靶点。近年来，ASMase-Cer通路在动脉粥样硬化、神经系统变性等疾病中进行了研究[21]，但该通路在肝纤维化中的作用未见报道。
Cer可通过激活一系列蛋白激酶[22]，启动细胞内磷酸化过程，发挥促细胞凋亡、促炎症和抗细胞增殖等作用。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛参与细胞基因表达、增殖、凋亡、分化等过程的调节，该信号通路在肝纤维化的发生和发展中所起到的调节作用受到越来越多的关注[23]。Cer在细胞生长中的抑制作用包括抑制细胞外信号调节激酶（ERK）的活性[24]。笔者课题组前期已证实Art抗肝纤维化作用与其抑制ERK1/2磷酸化蛋白的表达有关[25]，但该信号转导的级别通路是否与Cer有关，目前尚未有研究。
有研究表明[26]，UVA诱导的淋巴母细胞凋亡是通过激活ASMase，产生Cer，Cer再抑制ERK通路完成，说明该条通路在细胞凋亡方面可发挥作用。该条通路是否在Art抗肝纤维化中发挥作用，将是本研究的重点。
1 实验材料 1.1 细胞株人源HSCs株LX-2细胞，由北京市地坛医院提供。
1.2 主要实验仪器HEPA class 100 CO2培养箱：Thermo Electron Corporation；VIS-7220紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；680酶标仪：美国BIO-RAD公司；高效液相色谱仪（LC-6A泵，SCL-6B系统控制箱，RF-535荧光检测器，Anastar色谱工作站）：日本岛津；MSB010.CX2.5型台式高速离心机：SANYO。
1.3 主要实验试剂Art，由广西桂林南药股份有限公司提供，用5% NaHCO3溶解；MTT购自联星生物；油酰乙醇胺（NOE）购自Adamas试剂有限公司，用1%乙醇溶解；丙米嗪、邻苯二甲醛、β-巯基乙醇（色谱纯）购自Sigma-aldrich公司，丙咪嗪用1‰ DMSO溶解；羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成试剂公司；红色荧光ASMase测定试剂盒购自AAT Bioquest公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、β-actin抗体、p-ERK1/2抗体等均购自碧云天生物技术研究所。
2 实验材料 2.1 实验分组情况第1组实验分组情况：细胞对照组、Art 250 μmol/L组、Art 350 μmol/L组、Art 450 μmol/L组、1‰ DMSO组、溶酶组（1‰ DMSO预处理30 min后，加入5% NaHCO3）、丙米嗪（imipramine，Imi）10 μmol/L组、Imi 30 μmol/L组、Imi 10 μmol/L+Art 450 μmol/L组（加入Art 450 μmol/L 30 min前加入Imi 10 μmol/L）、Imi 30 μmol/L+Art 450 μmol/L组（加入Art 450 μmol/L 30 min前加入Imi 30 μmol/L）。第2组实验分组情况：细胞对照组、Imi 10 μmol/L组、Imi 30 μmol/L组、NOE 50 μmol/L组、PD98059 100 μmol/L组、Imi 10 μmol/L+Art 450 μmol/L组、Imi 30 μmol/L+Art 450 μmol/L组、Art 450 μmol/L组。
2.2 MTT法检测LX-2细胞的增殖情况取处于对数生长期的LX-2细胞，以2×104/mL密度接种于96孔培养板，每孔100 μL，继续放入孵箱内培养72 h后进行实验，实验分组同2.1第1组，每组设6个复孔。Art组孵育24 h、48 h、72 h，其余实验组孵育6 h、12 h、24 h后，每孔加入MTT 10 μL，作用4 h后，每孔加入二甲基亚砜200 μL，于酶标仪上测定，在570 nm处测定吸光度，选定630 nm作为参考波长进行双波长测定。按以下公式计算细胞抑制率（IR），IR（%）=[（对照组A值-实验组A值）/对照组A值]×100%。
2.3 LX-2细胞培养上清液中乳酸脱氢酶活性的测定取对数期生长的LX-2细胞接种于96孔板，实验分组同2.1第1组中的Art组，孵育24 h后，按照碧云天生物技术研究所提供的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒说明书进行操作。计算公式：细胞培养上清中乳酸脱氢酶活性=（样品孔吸光度-背景空白对照孔吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×标准品浓度（mU/mL）。
2.4 测定LX-2细胞培养上清液中Cer含量前期实验步骤及实验分组同2.1第1组，作用24 h后收集细胞上清液，测定方法完全按照笔者课题组前期建立的HPLC-FLD法[27]。取100 μL细胞培养上清液，加入等量的乙腈，涡旋振荡混合均匀后离心（13 000 r/min，3 min，离心半径=10 cm），吸取上清液置于反应管中，加入1 mol/L KOH的乙醇溶液500 μL，混匀。在沸水浴反应2 h，待冷却后用1 mol/L盐酸乙醇溶液调节pH至中性，用等体积的氯仿和氯化钠溶液萃取，取下层，氮气吹干。用50 mL甲醇复溶，加入等体积的50 mL OPA衍生试剂，充分混匀，离心（13 000 r/min，3 min，离心半径=10 cm），进样。参照空白样品与标准品的药物峰保留时间，确定生物样本中Cer峰的保留时间及出峰位置，对样品中的Cer进行定性，采用系统自动积分和手动积两种方式对测定样品的药物峰数据进行处理，用外标一点法推算出对应的待测物药物浓度。
2.5 测定LX-2细胞培养上清液中羟脯氨酸含量前期实验步骤及实验分组同2.1第1组，培养24 h后收集细胞上清液，按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书进行操作。计算公式：羟脯氨酸浓度（μg/mL）=[（测定管吸光度-空白管吸光度）]×标准管浓度（5 μg/mL）×稀释倍数。
2.6 ASMase活性的测定取对数生长的LX-2细胞，接种于6孔板中，实验分组情况同2.1第1组。作用24 h后，6孔板去除培养液，用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗1遍，0.25%胰酶消化，按照实验分组收集到50 mL离心管中离心（1 500 r/min，5 min，离心半径=10 cm）。按照6孔板每孔加入100~200 μL NP40裂解液的比例加入裂解液，涡旋，将微型离心管置于4 ℃摇床平台上，温和震荡15 min，充分裂解后，4 ℃离心（12 000 r/min，25 min，离心半径=10 cm），吸取上清液，后按照碧云天研究所提供的BCA试剂盒进行蛋白定量。按照AAT Bioquest公司提供的红色荧光ASMase测定试剂盒进行ASMase活性的测定。
2.7 Western blot法测定ASMase蛋白表达取对数期生长的LX-2细胞，实验分组情况同2.1第1组。细胞蛋白提取及定量同2.6，取30 μg总蛋白进行上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h进行蛋白分离后，将其转至PVDF膜，转膜条件：4 ℃，350 mA，2 h。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，封闭后用TBST洗膜5 min×4次，一抗ASMase抗体（1∶500）、β-actin抗体（1∶1 000），4 ℃摇床过夜。二抗室温摇床孵育2 h，TBST洗膜10 min×4次，ECL发光液显色之后曝光。用Umax2100XL扫描仪以及Quantity One软件对不同条带进行光密度分析。
2.8 Western blot法测定ERK1/2磷酸化蛋白的表达取对数生长期的LX-2细胞，实验分组同2.1实验分组第2组。除采用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白分离，一抗为p-ERK1/2抗体外，其余实验步骤同2.7。
2.9 统计学方法利用SPSS 23.0软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P < 0.05为差异具有统计学意义。
3 实验结果 3.1 MTT法检测不同浓度的Art对LX-2细胞增殖的影响如表 1所示，与细胞对照组比较，Art实验组可显著抑制LX-2细胞的增殖（P < 0.05）且该抑制作用呈剂量依赖性及时间依赖性。
如表 2所示，Imi仅在浓度为30 μmol/L，作用时间为24 h，与DMSO组比较，可促进LX-2细胞的增殖（P < 0.05）。与Art 450 μmol/L比较，Imi 10 μmol/L预处理组无明显减弱Art对LX-2细胞增殖的抑制作用（P > 0.05），但Imi 30 μmol/L则明显减弱Art对HSCs增殖的抑制作用（P < 0.05）。
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如表 3所示，Art作用24 h后，Art各浓度组LX-2细胞培养上清液中乳酸脱氢酶活性无明显变化，与对照组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。
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Art各浓度组作用24 h后，LX-2细胞分泌羟脯氨酸水平降低（P < 0.01）。单纯Imi处理，仅在浓度为30 μmol/L，可提高LX-2细胞上清液中羟脯氨酸含量（P < 0.05）。与Art 450 μmol/L组比较，Imi 30 μmol/L预处理组可明显减弱Art对LX-2细胞培养上清液中羟脯氨酸含量的降低作用（P < 0.05）。见表 4。
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Art各浓度组相对于细胞对照组，LX-2细胞培养上清液中Cer含量显著升高（P < 0.05）；Imi 30 μmol/L可显著降低LX-2细胞培养上清液中的Cer含量（P < 0.05）；与Art 450 μmol/L组比较，Imi 30 μmol/L预处理组明显减弱Art对LX-2细胞培养上清液中Cer含量的升高作用（P < 0.05）。见表 5。
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与细胞对照组比较，Art 450 μmol/L组可明显提高LX-2细胞内ASMase的活性（P < 0.01）。单纯Imi 30 μmol/L作用24 h后，可抑制ASMase的活性（P < 0.01）。与Art 450 μmol/L比较，Imi 30 μmol/L预处理组可明显减弱Art 450 μmol/L对ASMase活性的升高作用（P < 0.01）。见表 6。
与细胞对照组比较，Imi 30 μmol/L可抑制LX-2细胞中ASMase蛋白的表达（P < 0.01），Art 450 μmol/L可明显促进ASMase蛋白的表达（P < 0.01）。与Art 450 μmol/L比较，Imi 30 μmol/L预处理组可减弱Art对ASMase蛋白表达的促进作用（P < 0.01）。见图 1。
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| 注：两组间比较，*P＜0.01。 图 1 各药物组对ASMase蛋白表达的影响 Fig. 1 Effect on the expression of ASMase of different drug groups |
Art 450 μmol/L、NOE 50 μmol/L、PD98059 100 μmol/L均能够抑制ERK1/2磷酸化蛋白的表达（P < 0.05），Imi 30 μmol/L能够促进ERK1/2磷酸化蛋白的表达（P < 0.05）。与Art 450 μmol/L比较，Imi 30 μmol/L预处理组可减弱Art对ERK1/2磷酸化蛋白表达的抑制作用（P < 0.05）。见图 2。
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| 注：两组比较，*P＜0.05。 图 2 各药物组对ERK1/2磷酸化蛋白表达的影响 Fig. 2 Effect on the expression of p-ERK1/2 of different drug groups |
目前，肝纤维化的防治策略主要包括两个方面：一是抑制HSCs的活化和（或）促进其凋亡，二是减少细胞外基质的合成并促进其降解。此外，还有其他策略，如去除病因、保护肝细胞、抑制炎症反应和免疫应答、抗氧化损伤等。细胞外基质主要包括胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖和蛋白聚糖，羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，大部分存在于胶原蛋白中，且其含量恒定，其含量能客观地反映细胞外基质的程度和演变过程。乳酸脱氢酶是一种极为稳定的胞质酶，通过测量该指标可估计细胞膜完整性，从而反映药物的细胞毒性。笔者研究实验结果表明Art可抑制LX-2细胞的增殖，且Art各实验组乳酸脱氢酶活性虽略有升高，但其差异无统计学意义（P > 0.05），说明Art对LX-2细胞增殖的抑制作用不是非特异性细胞毒性所致。同时Art可降低LX-2细胞内羟脯氨酸的含量，说明Art可通过抑制HSCs细胞的增殖、减少胶原蛋白的合成来发挥抗肝纤维化作用。笔者课题组前期研究已证实内源性Cer亦是通过这两方面作用来抗肝纤维化[17]，结合本研究的研究结果：Art可提高LX-2细胞中Cer含量，说明Art可能是通过提高LX-2细胞内Cer的含量来发挥抗纤维化作用的。有研究表明，HSCs内总Cer积累可改善早期非酒精性脂肪性肝纤维化[15-16]，但亦有研究表明[14]，在非酒精性脂肪性肝病中，使用肉豆蔻（可抑制Cer合成），降低大鼠体内Cer的积累，可改善纤维化。有研究者认为，这两种相反的结果可能与Cer通过不同通路调控HSCs凋亡及活性有关[28]，但笔者认为，这两种相反的结果也可能是因为不同的Cer亚型在不同的细胞或不同的动物模型中，对肝纤维化发挥的作用不同[29]。有研究表明，在非酒精性脂肪性肝炎中，其疾病的发生发展伴随着Cer C14、C16、C18、C20的增加和C24的减少[30-31]，在乙型病毒性肝炎患者中，C16和C24：1含量增加，而C18含量降低[32]。长链Cer C16-C20诱导细胞凋亡和氧化应激，而超长链Cer C22-C24具有相反的活性[33]。笔者课题组建立的测定Cer含量的方法，所测的是C2的含量[27]，故本实验结果初步说明了C2可发挥抑制肝纤维化的作用。
丙咪嗪是公认的ASMase抑制剂，其是通过促进ASMase降解，进而减少细胞内ASMase活性[34]，本实验结果显示：Imi 30 μmol/L预处理组可减弱Art发挥抗肝纤维化的作用，同时亦减弱Art对ASMase活性的提高作用及对ASMase蛋白表达的促进作用。这些结果均提示Art发挥抗肝纤维作用可能与ASMase-Cer通路有关。同时也提示了Art可能通过对ASMase蛋白表达量的影响，进而影响其活性。有研究表明[35]：Imi或阿米替林抑制ASMase活性，下调组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的表达，最终导致LX-2细胞增殖减少，进而发挥抗肝纤维化的作用。本实验前期Imi浓度探索过程中，发现经30 μmol/L以上的Imi刺激24 h后，或者经30 μmol/L以下的Imi刺激36 h后，均可使HSCs内Cer含量升高，进而抑制HSCs的增殖，发挥抗肝纤维化作用，与该研究最终结论一致，笔者认为是ASMase-Cer通路的抑制，导致其他途径的Cer量代偿性增高导致的该结果。
生物膜中的脂筏是指脂膜双层内含有特殊脂质及蛋白质的一种液态有序相微区，富含胆固醇和鞘磷脂及信号蛋白，信号蛋白主要包括G蛋白、Ras蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）、几种PKC同种型、Fas和肿瘤坏死因子-α受体等。鞘磷脂水解途径通过鞘磷脂酶将鞘磷脂水解成Cer和胆碱，释放的Cer进入脂筏中，改变脂筏的动力学，导致脂筏微结构域的局部变化，进一步改变细胞表面蛋白的信号转导过程。ERK通路是经典的MAPK信号通路，活化的ERK通路可促进细胞增长并抑制其凋亡，其活化途径为三磷酸鸟苷（GTP）酶依赖性的Ras蛋白或PKC酶活化，激活快速增殖肉瘤激酶-1（Raf-1），其可磷酸化下游的丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），进而激活下游的MAPK。MEK主要成员有MEK1/2、MEK3/6等，它们分别激活MAPK家族的不同成员、MEK1/2通过磷酸化并激活ERK1/2。PD98059是作用于ERK/MAPK信号通路的一种特异性阻断剂，本实验中采用100 μmol/L PD98059，可完全抑制ERK1/2磷酸化蛋白的活性[26]。NOE为Cer代谢酶抑制剂，可提高LX-2细胞内Cer含量，Imi可减少LX-2细胞内Cer含量。该实验结果提示：LX-2细胞内Cer含量增加，可抑制ERK1/2磷酸化蛋白的表达，Cer含量减少，可促进ERK1/2蛋白磷酸化的表达，说明内源性Cer可通过抑制ERK1/2磷酸化蛋白的表达来发挥抗肝纤维的作用。Cer可能通过多种机制来抑制ERK通路[14]：其可通过直接抑制PKC-ε的激活或其与Raf-1结合，导致Raf-1形成无活性的Ras-Raf-1复合物[23]，进而抑制ERK通路的激活。与Art 450 μmol/L比较，Imi 30 μmol/L预处理组可减弱Art对ERK1/2磷酸化蛋白的抑制作用。由此得知，Art可能通过ASMase-Cer-ERK1/2通路发挥抗肝纤维化作用。
肝纤维化的发生发展是一个多因素逐渐演变的复杂过程，从目前的研究可以看出，不同的Cer亚型对肝脏疾病及肝纤维化的作用及机制可能不同。进一步研究Cer不同亚型在肝纤维化中的作用及机制，可能使其成为抗肝纤维化的一个新靶点。笔者课题组初步探讨了Cer C2在肝纤维化中的作用，今后可继续探讨其他Cer亚型及Cer通路在Art改善肝纤维化中的作用。
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2. Department of Pharmacy, Tianjin Jizhou District People's Hospital, Tianjin 301900, China;
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