糖尿病肾病（DN）是一种以持续性蛋白尿排泄、肾小球滤过率进行性下降为特征的糖尿病慢性微血管并发症^[1]。据统计，全球30%~50%的终末期肾脏病是由DN引起的^[2]。目前DN以对症治疗为主，包括降糖、降压、降尿蛋白、调脂等^[3]，然而效果并不理想。

中医在治疗DN上具有独特优势^[4]，化瘀通络中药是陈志强教授经多年临床筛选确定的作为治疗DN的基础药物，由川芎、丹参、地龙、水蛭、全蝎5味中药组成。笔者团队前期研究表明，化瘀通络方联合基础治疗可有效减轻DN患者临床症状，减少蛋白尿，延缓肾功能下降^[5]，但其作用机制还需要进一步探讨。

现代研究表明，自噬在DN的进展中起着重要作用。自噬是一种细胞内部的清理机制，通过这一过程，细胞能够对损伤的细胞器和蛋白质进行降解、回收，从而保持细胞内环境稳态。因此，提高细胞自噬水平可有效减轻糖尿病肾脏损伤^[6]。而在介导自噬的众多通路中，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素哺乳靶蛋白（mTOR）信号通路受到广泛关注。AMPK作为mTOR的上游信号分子，可通过抑制mTOR的磷酸化促进自噬发生^[7]。

基于此，本实验利用单侧肾切+链脲佐菌素腹腔注射构建DN大鼠模型，探讨化瘀通络中药对于DN大鼠的肾脏保护作用；并基于AMPK/mTOR信号通路介导的自噬探讨化瘀通络中药治疗DN的作用机制，为中药多靶点防治DN提供新的思路和科学依据。

1 材料 1.1 实验动物

6周龄SPF级健康雄性SD大鼠（体质量170~200 g），由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号SYXK（冀）2023-012，饲养环境湿度50%~70%、温度20~25 ℃，实验动物自由进食水。本研究已通过河北中医药大学动物实验伦理委员会批准（伦理编号：DWLL202401020）。

1.2 实验药物

化瘀通络中药颗粒剂：丹参15 g，川芎12 g，水蛭6 g，全蝎6 g，地龙10 g（由广东一方制药有限公司惠赠）；厄贝沙坦（产自杭州赛诺菲制药有限公司，HJ20171183）。

1.3 主要试剂

10%凝胶快速制备试剂盒（批号038612100）、蛋白酶抑制剂（批号GRF101）、磷酸酶抑制剂（批号GRF102）、RIPA蛋白裂解液（批号PC101），购于上海雅酶生物医药科技有限公司；人微管相关蛋白轻链3B（LC3B）抗体（批号ab192890）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）抗体（批号ab133448）、螯合体1（SQSTM1/p62）抗体（批号ab314504），购于美国Abcam公司；AMPK抗体（批号80209-5-RR）、磷酸化雷帕霉素哺乳靶蛋白（p-mTOR）抗体（批号6777-1-lg）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号66009-1-lg）、mTOR抗体（批号66888-1-Ig）、山羊抗兔抗体（批号SA00001-2），购于武汉三鹰生物技术有限公司；山羊抗鼠抗体（批号CR2206088），购于武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.4 主要实验仪器

7170A型全自动生化仪（日本日立公司），WIX-Ep600通用电泳仪（北京韦克斯公司），GeIVIew 6000ProII多功能图像工作站（广州博鹭腾公司），BX53F型数码显微镜（日本Olympus公司），RM2245型石蜡切片机（德国Leica公司），Centrifuge1730R型离心机（上海贝晶公司）。

2 方法 2.1 动物模型制备、分组及给药

40只健康雄性SD大鼠经1周适应性饲养后，使用随机数字表法分配10只为对照组，其余30只为造模组。所有动物经腹腔注射戊巴比妥钠（1%，45 mg/kg）麻醉，对照组进行剥离右肾周围脂肪薄膜操作，造模组则行右侧肾脏摘除术，术后恢复1周，造模组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（1%，40 mg/kg）。72 h后3次尾尖采血，若随机血糖≥16.7 mmol/L则认为DN模型构建成功^[8]，观察大鼠舌质、爪、尾静脉出现紫黯则认为瘀血阻络证型构建成功^[9]。随机数字表法将成模大鼠分为模型组、化瘀通络中药组、厄贝沙坦组各10只。体质量70 kg的成人口服药物剂量为：丹参15 g，川芎12 g，水蛭6 g，全蝎6 g，地龙10 g，参考《药理实验方法学》按成人等效剂量折算系数^[10]计算，大鼠每日给药剂量为：丹参1.35 g/kg，川芎1.08 g/kg，水蛭0.54 g/kg，全蝎0.54 g/kg，地龙0.9 g/kg，厄贝沙坦组按15 mg/kg灌胃，对照组和模型组予以同量纯水灌胃，连续给药12周。在灌胃过程中死亡2只，最终纳入研究的大鼠为对照组10只，模型组9只，化瘀通络中药组9只，厄贝沙坦组10只。

2.2 标本收集

实验结束时收集24 h尿液检测24 h尿蛋白（24 h UTP）；将大鼠禁食不禁水12 h，腹腔麻醉后腹主动脉取血，血液离心（3 000 r/min，离心半径10 cm）15 min后收集上层血清检测生化指标；摘除左肾，除去被膜，将肾脏皮质一部分冻存于-80 ℃冰箱，另一部分浸泡于4 %多聚甲醛中固定备用。

2.3 24 h尿蛋白定量分析及血液生化指标检测

离心后的上层血清、尿液上清采用全自动生化分析仪，测定糖化白蛋白（GA）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24 h UTP含量。

2.4 肾组织病理形态学观察

取部分固定完成的肾组织进行石蜡包埋、切片，分别行苏木精-伊红（HE）、高碘酸希夫（PAS）及马松（Masson）染色，光镜下行肾组织病理学检查。

2.5 蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达

在50 mg肾组织中加入RIPA混合裂解液超声匀浆，超声裂解后冰上静置30 min，离心（13 000 r/min，离心半径10 cm）后取上清进行蛋白定量，后加入上样缓冲液稀释待测样本，并将蛋白煮沸变性。凝胶电泳，转膜35 min，室温下快速封闭液封闭15 min，4 ℃下孵育一抗过夜（一抗稀释比例为：p62 1∶1 000；LC3B 1∶2 000；AMPK 1∶2 000；p-AMPK 1∶2 000；mTOR 1∶1 000；p-mTOR 1∶1 000），TBST清洗，室温孵育二抗（稀释比例为1∶5 000）1 h后洗膜，化学发光显影。使用Image J软件进行数据统计。

2.6 统计学分析

数据处理采用SPSS 23.0软件，柱状图绘制采用GraphPad Prism 8.0.2软件，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，若数据符合正态分布且方差齐，组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法。若不符合正态分布，则采用Kruskal Wallis H检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 各组大鼠糖化白蛋白、血脂比较

如表 1所示，相较于对照组，模型组大鼠GA、TC、TG水平显著升高（P < 0.01）；相较于模型组，各给药组大鼠TC、TG水平明显降低（P < 0.01或P < 0.05），GA水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 各组大鼠肾功能及24 h UTP比较

见表 2所示，相较于对照组，模型组24 h UTP、BUN水平显著升高（P < 0.01），Scr水平差异无统计学意义（P > 0.05）；相较于模型组，两个给药组24 h UTP水平均显著降低（P < 0.01），BUN水平仅化瘀通络中药组明显下降（P < 0.05），Scr水平均差异无统计学意义（P > 0.05）；相较于厄贝沙坦组，化瘀通络中药组BUN水平明显下降（P < 0.05），24 h UTP、Scr水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

3.3 各组大鼠肾组织病理改变情况

如图 1所示，相较于对照组，模型组HE染色及PAS染色显示模型组大鼠肾小球肥大，肾小球基底膜增厚，系膜细胞及基质增生，球囊粘连；Masson染色显示，肾组织胶原纤维增生。相较于模型组，各干预组大鼠肾组织病理出现不同程度好转。

3.4 各组大鼠肾组织自噬及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达情况

如图 2所示，相较于对照组，模型组大鼠肾组织p62、p-mTOR/mTOR水平显著升高（P < 0.01），人微管相关蛋白轻链3B-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）/人微管相关蛋白轻链3B-Ⅰ（LC3B-Ⅰ）、p-AMPK/AMPK水平显著降低（P < 0.01）；相较于模型组，各给药组p62、p-mTOR/mTOR水平均显著降低（P < 0.01），LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ水平明显升高（P < 0.01、P < 0.05），化瘀通络中药组p-AMPK/AMPK水平明显升高（P < 0.05），厄贝沙坦组p-AMPK/AMPK有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

4 讨论

在全球范围内，DN的治疗仍是一大挑战。现代医学针对DN尚未开发出特效药物，尽管一些常规治疗如血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素Ⅱ受体阻断剂（ARB）类降压药物在减轻蛋白尿方面展现出一定疗效，但由于应用范围相对有限，所以无法从根本上遏制DN向终末期肾病的进展。因此，传统中医药在治疗DN的前景中备受关注。中医将DN归属于“肾消”“水肿”“关格”“尿浊”等范畴，DN属本虚标实、虚实夹杂之证，由消渴病迁延所致，所谓“五脏之伤，穷必及肾”。有研究对DN最常见证型进行了统计分析^[11]，发现疾病初期以气阴两虚证为主，后期随病情进展阴阳两虚证最为常见；而辨证中瘀血证是发生率最高的，所以在“辨体-辨病-辨证”模式下提出“活血化瘀通络”的治法^[12]，选用化瘀通络中药方进行药效评价和基础研究。前期多次临床试验表明，基础治疗联合化瘀通络中药的使用能够明显改善中晚期DN患者的临床症状，减少24 h尿蛋白排泄，保护肾功能^{[5, 13]}；因此本实验根据临床常用剂量结合前期实验结果，参考《药理实验方法学》按成人等效剂量系数折算，确定大鼠每日给药剂量为：丹参1.35 g/kg，川芎1.08 g/kg，水蛭0.54 g/kg，全蝎0.54 g/kg，地龙0.9 g/kg。方中川芎行气活血，被誉为“血中之气药”，能够破宿血、生新血，疏通经脉；丹参活血化瘀、通经止痛，两者作为活血化瘀代表药物常配伍使用，现代药理研究证实川芎、丹参均有改善微循环、抗血栓的作用^[14]。然“初为气结在经，久则血伤入络”，肾络细微，交织错杂，故邪易入难出，络易滞易瘀。古人认为“以食血之虫，飞者走络中气分，走者走络中血分，可谓无微不入，无坚不破”，故虫类药相较于草木之品能够入血搜逐，通经活络，研究显示水蛭、全蝎、地龙具有改善血流动力学、抗凝、改善微循环的作用^[15]，故合用虫类药搜剔络中病邪，共奏活血化瘀通络功效。该实验采用了“病证结合”的糖尿病大鼠模型^[16]，相较于对照组，造模组大鼠出现多饮、多食、多尿、消瘦等临床表现，且舌、爪、尾静脉出现紫黯，TC、TG升高，均表明DN瘀血阻络证模型构建成功^[9]。相较于模型组，化瘀通络中药组大鼠TC、TG明显下降，提示化瘀通络中药具有调节脂代谢、改善微循环的作用，与前述研究结果一致。此外，化瘀通络中药组大鼠BUN、24 hUTP明显降低，病理结果提示肾小球基底膜增厚、系膜细胞及基质增生等情况均有所减轻，而血糖变化不明显，表明化瘀通络中药具有独立于降糖的肾脏保护作用机制。

近年研究显示，自噬是DN发生发展的重要环节^[17]。自噬是一种自我保护机制，细胞内膜包裹受损的细胞器、蛋白质及部分胞质组成自噬体，并与溶酶体结合形成自噬溶酶体，降解其内容物并重新利用，从而实现细胞内动态平衡^[18]。自噬发生时，胞质内的LC3B-Ⅰ经泛素化修饰转变为LC3B-Ⅱ，并附着于自噬体膜表面，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比例与自噬体的数量呈正相关，能够在一定程度上衡量细胞的自噬水平^[19]。此外，p62可结合LC3B及经泛素化修饰的底物进入自噬体内，随后经自噬溶酶体降解，所以p62表达水平与自噬活性呈负相关^[20]。

在高糖环境下肾组织自噬水平下降，导致受损的蛋白质、细胞器积累，加重DN进程^[21]；而提高自噬活性不仅可以减少细胞内代谢损伤产物积累，还可改善细胞外基质沉积、炎症和纤维化，以延缓DN进展^[22-23]。在本次实验中，与对照组比较，模型组中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ下降，p62表达上调，表明在DN进程中自噬水平的确受到抑制，与前述研究结果一致。同时，经化瘀通络中药干预后，大鼠肾组织中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ出现升高，p62表达有所下降，提示化瘀通络中药可以通过调控自噬相关蛋白表达，以提高自噬水平。

自噬是由多通路调控的复杂程序^[24]，其中AMPK/ mTOR信号通路受到广泛关注^[25]。mTOR在高糖环境下被激活磷酸化，p-mTOR可通过降低人自噬启动蛋白1（ULK1）的活性，阻碍自噬囊泡的形成，从而抑制细胞的自噬过程^[26]。AMPK是细胞内主要能量感受器，AMPK可以通过抑制mTOR激活促进自噬环节启动^[27]。本次研究发现，与对照组比较，模型组大鼠组织中p-AMPK/AMPK明显降低，p-mTOR/mTOR升高；与模型组比较，化瘀通络中药组大鼠组织中p-AMPK/AMPK升高，p-mTOR/mTOR降低。结果表明，化瘀通络中药可以通过调控AMPK/mTOR信号通路，促进自噬发生，发挥肾脏保护作用。

综上，化瘀通络中药可以减轻肾脏损伤，延缓肾功能下降，其潜在作用机制可能与调控AMPK/mTOR信号通路介导的自噬有关。然而本研究仍有不足之处，例如未进行体外实验、敲除实验进一步研究化瘀通络中药对DN的干预靶点；DN大鼠自噬调节涉及多种通路，本实验仅对AMPK/mTOR信号通路进行了研究，后续会进一步研究化瘀通络中药对其他自噬通路的影响。