近年来，越来越多的证据表明肿瘤免疫疗法在延长患者总生存期以及改善预后等方面有着显著的优势^[1]。肿瘤微环境（TME）是肿瘤发生与演进的场所，与肿瘤的起始、发展和转移密切相关^[2]，除肿瘤细胞外，还包括各种细胞类型（内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞等），以及非细胞成分（细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质等），它们共同接受周围血管网的供养^[3]。TME中先天性免疫应答细胞包括巨噬细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、髓源性抑制细胞等，适应性免疫应答反应主要由T淋巴细胞和B淋巴细胞介导。这些免疫细胞不仅仅只是引发抗瘤免疫应答，相反其中一大部分会积极参与肿瘤细胞免疫逃逸，促成免疫抑制状态^[2]，使得TME中免疫细胞与抗肿瘤之间的作用关系更为复杂。

四君子汤为补气健脾经典方，由人参、白术、茯苓、甘草4味药组成。研究结果表明，人参中人参皂苷与多糖化合物、茯苓中十六萜羧酸与多糖、白术中白术内酯与多糖、甘草中黄酮类化合物与多糖是四君子汤中存在的主要有效成分^[4]。《黄帝内经》中“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”提示研究者们，恶性肿瘤（邪凑）的治疗原则是扶助正元，祛除邪气。四君子汤在以往的恶性肿瘤的临床治疗中，主要用于缓解患者术后不良消化道症状，在大量临床病例中，四君子汤对患者术后的生存率的提高以及生存质量的改善有着显著效果^[5-6]。现代医学研究发现^[7]，不同于西医辅助治疗表现出的直接杀伤作用，以四君子汤为代表的补益类方药能够正向调节肿瘤免疫微环境，例如增强免疫细胞的杀伤能力和免疫系统对肿瘤细胞的敏感性，解除免疫抑制状态，促进机体免疫活性，辅助杀伤肿瘤细胞等。免疫细胞是免疫治疗的细胞基础^[8]，在TME中，临床上应用四君子汤靶向调节TME细胞，提高免疫细胞浸润率可以帮助控制恶性肿瘤并实现积极的预后^[9]。文章将综述四君子汤及其活性成分对肿瘤免疫微环境的调节作用为促进临床转化应用提供依据。

1 四君子汤及其活性成分对TME中自然杀伤细胞的调节作用

自然杀伤细胞（NK）是人固有淋巴细胞群的亚群之一^[10]，具有细胞毒性，能够自主识别并杀死肿瘤细胞和病毒侵袭细胞^[11]。在TME中，NK细胞发挥杀伤作用是依靠打破激活、抑制性受体传递信号分子间的平衡。简单来说，就是感染状态下，激活性受体表达水平更高，从而促进NK细胞的募集、激活与增殖^[12]。活化的NK细胞释放“杀信号”，含有细胞溶解酶穿孔素和颗粒酶的细胞毒性分子会导致靶细胞的裂解死亡^[13]。研究表明^[14]，自然杀伤细胞受体家族2（NKG2A）是NK细胞表达的主要抑制性靶体之一，与其相应配体，如结直肠肿瘤表面的人白细胞抗原E（HLA-E）结合产生的抑制信号可抑制活化信号传递，从而阻止NK细胞的活化。

陈良燕等^[15]通过构建NK细胞与结肠癌细胞共培养模型来模拟结肠癌免疫微环境，检测四君子汤对NK细胞中NKG2A和人结肠癌HCT116细胞中HLA-E mRNA表达的影响。发现四君子汤组NK细胞活性和杀伤作用显著增强。其机制可能与四君子汤干预NKG2A-HLAE通路激活，同时降低微环境下结肠癌细胞中HLA-E的表达，从而恢复以及加强NK细胞抗结肠癌作用有关。朱月伊团队^[16]发现，四君子汤可以下降程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡受体-配体1（PD-L1）表达水平，影响干扰素-γ分泌，从而扭转NK细胞活性抑制状态及干预结肠癌细胞的生长。有研究者^[17]利用成球实验和软琼脂集落实验证实了四君子汤含药血清能显著降低胃癌细胞的成球能力和胃癌细胞集落形成能力。继用荧光定量聚合酶链式反应法检测，结果提示四君子汤含药血清处理能够降低人胃癌SGC7901细胞中S100A4基因的表达，从而达到抑制胃癌细胞的作用。Janf等^[18]通过实验发现人参甲醇提取物（MEGC）在不影响NK细胞数量的前提下能够显著增强NK细胞活性并抑制B16黑色素瘤细胞的增殖。Zheng等^[19]研究发现，给结肠癌小鼠腹腔注射人参皂苷Rb2能够减弱环磷酰胺（CTX）诱导的TME中的免疫抑制，增强NK活性以及巨噬细胞的活性，提高介导免疫反应的信号分子如干扰素-γ（IFN-γ），白细胞介素-2（IL-2），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和免疫球蛋白G（IgG）mRNA的表达。近年来也有学者提出茯苓多糖、金银花茯苓提取物可能是通过增加肿瘤小鼠模型的脾脏NK细胞比例及杀伤活力来发挥正向免疫调控作用^[20-21]。见表 1。

2 四君子汤及其活性成分对TME中T细胞的调节作用

T淋巴细胞是免疫微环境中重要的适应性免疫细胞，主要介导抗肿瘤作用最为突出的细胞免疫应答。TME中，抗原提呈细胞如肿瘤相关巨噬细胞等能够摄取、提呈肿瘤抗原给T细胞，T细胞活化、增殖后特异性地识别并杀死肿瘤细胞^[22]。尽管存在如此特异性免疫应答，人类肿瘤疾病仍持续存在并进展，这与癌症患者TME不断影响着T细胞的表型和功能密不可分。TME中许多分子机制促进着肿瘤免疫逃逸网络的形成^[23]。CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞作为T淋巴细胞的主要表型，相互辅助，相互影响，只有两者处于动态平衡时，才能发挥最大的免疫活性^[24]。

杨葛俊团队^[25]构建了体外T细胞-鼠源黑色素瘤细胞株（B16F10）共培养模型，分别给予不同浓度丹参-人参药物培养基，采用流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏T细胞，发现中、高剂量组丹参-人参能明显地增加脾脏CD4⁺、CD8⁺T细胞数量；并揭示鼠源黑色素瘤细胞株（B16F10）细胞的死亡与丹参-人参含药培养基呈剂量依赖性的事实；考察肺组织免疫组化结果后发现，双参能够增加B16F10肺部转移灶中CD4⁺和CD8⁺T细胞的浸润，证明双参在增加T细胞数量的同时也增强了T细胞的免疫活性。杨正丽等^[26]利用CTX建立了免疫低下的小鼠模型，通过研究发现人参果汁浓缩液能提高受环磷酰胺抑制的小鼠免疫器官中淋巴细胞亚群数量，并且部分恢复T细胞核转录因子T-box的mRNA表达水平，缓解了免疫抑制状态。有学者研究发现^[27]茯苓水提物也能够拮抗CTX诱发的T细胞各亚群比例失衡，促进小鼠脾脏CD4⁺细胞比例升高、CD8⁺细胞比例降低，从而恢复T细胞免疫活力。岳顺^[28]联合四君子汤和奥沙利铂对直肠癌术后患者进行研究性治疗，检测患者T细胞亚群中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD4⁺/CD8⁺，对比发现单纯化疗组CD4⁺/CD8⁺显著降低，而四君子汤联合奥沙利铂组的CD4⁺/CD8⁺明显提高，揭示了四君子汤通过调节T细胞亚群来逆转单纯化疗引起的免疫抑制状态。利用流式细胞术以及ELISA法，学者^[29]实验证明白术多糖可显著增加T细胞活化必需的膜抗原的表达，刺激白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-12（IL-12）、TNF-α和IFN-γ的分泌，提高淋巴细胞增殖率，诱导CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺淋巴细胞的活化。见表 2。

3 四君子汤及其活性成分对TME中B细胞的调节作用

B细胞是介导体液免疫反应的主要效应细胞，具有较强的抗体分泌活性，同时分泌各种细胞因子参与调节肿瘤免疫微环境，具有抗原呈递细胞的功能促进T细胞反应，也可以直接杀死癌细胞来抑制肿瘤的进展^[30]。另一方面，B细胞也能通过免疫抑制因子诱导肿瘤活性增加^[31]。Ig A是B淋巴细胞分泌的重要抗体，是免疫系统在黏膜表面的第一道屏障。TME中的B细胞对肿瘤细胞的生存发展以及治疗耐药性的选择均有着关键性的作用^[32]。

王瑾研究团队^[33]给予胃癌术后患者以四君子汤联合肠内营养支持治疗，通过测定免疫球蛋白A（IgA）、Ig G的水平，观察到四君子汤联合肠内营养组患者Ig A、Ig G、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺水平显著高于术前和单一肠内营养支持治疗组，进而发现四君子汤联合肠内营养支持治疗提高了患者的免疫功能，改善了胃癌术后免疫微环境。2012年，四君子汤总多糖（SJZPS）被提取利用以研究对于化疗荷瘤小鼠肠系膜淋巴结（MLNs）、派氏结（PPs）、脾脏淋巴细胞的影响，证实SJZPS能明显提高化疗荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞中B细胞比例及活化水平，降低化疗荷瘤小鼠免疫功能受损的程度^[34]。相雪莲等^[35]用环磷酰胺诱导小鼠胸腺及脾脏中的骨髓造血干细胞以及免疫细胞功能减退，分离淋巴细胞测定OD值发现灌胃白术多糖可以提高免疫抑制小鼠B细胞分泌抗体的水平和血清中IL-2含量。Sabiha实验室^[36]则针对地塞米松（Dex）诱发的小鼠免疫抑制而给药人参皂苷Rg1，观察得出人参皂苷Rg1可增加Dex免疫抑制小鼠脾脏B细胞和树突状细胞的数量，同时强化CD4⁺ T细胞和调节性T细胞的增殖力。2009年王爱云团队在探究硫酸化茯苓多糖（PS）抗肿瘤作用时，观察到体外加入PS能提高小鼠脾细胞中淋巴细胞的增殖，并以B淋巴细胞的增殖尤为显著^[37]。见表 3。

4 四君子汤及其活性成分对TME中免疫抑制细胞及因子的调节作用

骨髓单核细胞是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的主要来源^[38]。在TME中TAMs可以分化为促进肿瘤生长、增殖、转移的M2型巨噬细胞，以及具有高抗瘤活性的M1型巨噬细胞^[39-40]。TME中信号分子的类型和浓度往往决定着M1型和M2型两种表型的转换比例^[41]。上海中医药大学研究团队^[42]发现人参皂苷Rh2能降低非小细胞肺癌（NSCLC）细胞微环境中M2表面的标志物甘露糖受体1（CD206），具有将TME中的TAM向M1型极化的潜力，并促进M2型转化成抑制NSCLC转移的M1型。Zhou等^[43]使用脾移植结肠癌（CRC）细胞制备裸鼠模型，予腹腔内注射改良四君子汤，结果证实改良四君子汤以全剂量（45 g/kg）、连续3周的注射能显著增加模型小鼠脾脏中巨噬细胞的数量，并且提高其存活率，减少CRC肝转移。髓源系抑制细胞（MDSC）是TME中免疫效应细胞的主要抑制剂之一^[44]，能够分泌促炎性细胞因子、血管内皮生长因子（VEGF）等参与肿瘤的进展，同时抑制T细胞活化从而协助肿瘤细胞的免疫应答逃逸^[45]。研究发现人参提取物及酶解物均含有人参皂苷，能够有效减少CRC小鼠脾脏中MDSC比例，重塑TME，抑制免疫逃逸反应^[46]。朱鸣等^[47]将人参皂苷Rg3用于结肠癌患者，同时测定VEGF以及各型白细胞介素等水平，发现人参皂苷Rg3能够降低TME中VEGF水平，抑制肿瘤新生血管生成，增加白细胞介素-2、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α，减少白细胞介素-4、白细胞介素-6及白细胞介素-10分泌，促进免疫系统向干扰肿瘤细胞浸润生长与转移的稳态发展。李硕等^[48]实验考察18β-甘草次酸是通过参与激活Janus激酶信号传导和转录激活蛋白通路（JAK-STAT），同时增加Ⅰ型干扰素的表达，来介导肿瘤免疫调控作用，并且能与奥沙利铂协同作用，提高其化学敏感性，共同发挥抑癌效应。见表 4。

5 总结与展望

尽管在现代医学不断发展的今天，癌症仍是世界上最难治愈的疾病之一。传统的手术治疗往往根治性切除整个或部分带瘤器官，对人体造成的损伤是不可逆的。放射治疗依靠高剂量的辐射杀死癌细胞，但不可避免会涉及细胞在体内的残留与转移。化疗药物常见的如铂类化合物、蒽环类药物、喜树碱、紫杉醇等均会在不同程度上抑制免疫系统，导致患者生活质量急剧下降^[49]。因此，靶向肿瘤细胞的治疗方法仍存在较多局限。

四君子汤治疗虚损类疾病，旨在扶正^[50]，古来亦有记载，《太平惠民和剂局方》言：“四君子汤，治荣卫气虚，脏腑怯弱，心腹胀满，全不思食，肠鸣泄泻，呕秽吐逆。”在恶性肿瘤的整体治疗方面，扶正对应正向调节免疫微环境，四君子汤以及其中活性成分在TME在强化免疫细胞抑癌活性、增加免疫细胞比例、解除免疫抑制状态、介导免疫信号通路、减少癌细胞转移等方面均发挥了重要作用。笔者归纳了四君子汤对TME中肿瘤相关免疫细胞及因子的作用机制，为四君子汤在未来肿瘤治疗的应用研究提供一定参考。

但由于目前四君子汤干预TME中的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、髓源系抑制细胞的作用机制尚不完全明确，缺少足量且深入性的基础研究数据，临床应用上存在一定的限制性。主要对以下方面进行总结：1）当前四君子汤调节肿瘤免疫微环境的研究大多是对某一免疫细胞的比例、活性、分型、信号通路的影响，而针对免疫微环境中免疫细胞之间、细胞与细胞因子之间相互作用，或促进免疫效应或诱导免疫逃逸的协同网络研究甚少。因此深入实验研究微环境中各组分间相互作用是突破的关键点之一。2）目前四君子汤用于治疗恶性肿瘤多与一线化疗药物联合使用，但其在联合使用中的“角色”以及作用途径等仍有待深入研究，并且研究人员在用药途径、用药周期、用药剂量、用药频率等方面未形成统一的标准，这是亟待解决的问题。3）肿瘤细胞来源于人体自身细胞，因其生化组成差异和异常的抗原结构得以被免疫系统识别^[51]。在初始阶段，免疫细胞持续性攻击肿瘤细胞，但最终，肿瘤细胞能通过微环境中的各种机制逃逸，四君子汤主要活性成分能干预免疫抑制剂的表达，使免疫逃逸机制失能。因此，四君子汤呈现出多靶点、多通路的作用优势。4）目前的肿瘤模型仍存在单一、不规范的情况，在不同体质、不同类型瘤体微环境中，各免疫细胞表型众多，分化方向多样，作用也不尽相同，因此研究者可以着力于构建不同类型的TME模型，系统研究调控TME方向的机制。现代前沿的类器官技术，包含着代表器官的关键生理特性，打破了传统动物、细胞模型的局限，规避临床研究中可能存在的伦理问题，与源器官有更加相似的表现且遗传更为稳定^[52]，在研究中具有极大的优势。突破肿瘤类器官模型与免疫细胞共培养的技术壁垒，可以为中医药调控TME提供方法学参考。

综上所述，四君子汤及其活性成分在调控肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用，后期继续系统且深入地研究，可为四君子汤在恶性肿瘤的临床治疗中提供更全面的理论依据，具有重要意义。