甲状腺癌（TC）是内分泌系统常见的恶性肿瘤，近年来发病率显著增加^[1]。其中甲状腺乳头状癌（PTC）是TC最常见的病理类型^[2]。一般情况下PTC患者预后良好，但仍有部分患者存在术后复发、转移的风险。中医药已在PTC治疗中展现出其独特优势。中医辨证论治可以对患者体质和疾病特征进行全面评估，是中医治疗的基础。术前中医证型的判定有助于确定患者的体质和疾病发展阶段，从而制定个体化治疗方案。研究发现：甲状腺乳头状癌术前患者的中医证型与BRAF基因型的分布存在相关性，其中痰浊证型中BRAF基因突变率及淋巴结转移率均显著高于其他证型^[3]，所以探究PTC术前中医证型与患者临床病理特征的内在联系具有重要意义。但PTC病理因素错综复杂，辨证分型尚不统一，缺乏PTC辨证分型的客观依据，增加了中医药对PTC患者术前治疗的难度。

炎症小体是一种新的模式识别受体，介导先天性免疫及炎症反应^[4-5]，其中核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体是NLR家族中最具特征性的炎症小体之一，能够感知病原体或细胞损伤信号，在感染和肿瘤微环境的刺激下，活化的炎症小体可以诱导半胱氨酸蛋白酶-1水解，促进白细胞介素1β（IL-1β）释放，诱导细胞发生程序性的炎性坏死，激活炎症反应。近年来研究表明，NLRP3炎症小体在多种癌症的发展和进展中发挥了关键作用^[6-7]。研究发现NLRP3蛋白在PTC组织中呈高表达^[8-10]，且NLRP3表达程度与PTC肿瘤直径、局部侵犯及病理分期相关^{[8, 10]}，NLRP3可能是PTC发病及不良预后的新靶点。但目前针对PTC术前中医证型与NLRP3表达相关的研究较少，本研究通过分析PTC术前中医证型的分布差异，以及不同证型PTC患者术后病理特征和NLRP3表达的差异，初步探寻PTC中医辨证分型的客观指标，加深对疾病的认识，使中医辨证更加标准化、具体化，为中医药治疗PTC提供了新的思路。

1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2022年7月—2023年3月于南京中医药大学附属医院普外科行手术治疗190例PTC患者，男36例，平均年龄（44.53±11.79）岁；女154例，平均年龄（45.27±12.10）岁。术后病理报告均确诊为甲状腺乳头状癌；本研究通过南京中医药大学附属医院伦理委员会批准（批件号：2022NL-086-02），临床试验注册号（ChiCTR2200065338），所有患者均知情同意。

1.2 诊断标准

西医诊断参照中华人民共和国国家卫健委编写的《甲状腺癌诊疗规范（2018年版）》中的诊断标准^[11]，术后病理确诊为甲状腺乳头状癌。病理分级标准（参照《AJCC第8版》^[12-13]）。

1.3 纳入标准

1）初次接受手术治疗的原发性PTC患者。2）术前未经放化疗、激素等治疗。3）术后常规病理确诊为PTC。4）有完整的中医四诊资料及临床资料。

1.4 排除标准

1）其他病理类型的甲状腺癌。2）术前已接受放疗化疗、激素替等治疗。3）患者合并其他肿瘤。4）临床资料不完整或未能配合研究。5）患者合并冠状动脉粥样硬化、感染等对NLRP3表达有影响的疾病。

1.5 PTC患者术前中医证型判定

参照《中医外科学》（新世纪第四版）^[14]《应用德尔菲法确立甲状腺癌中医证候的调查研究》^[15]《基于文献的2 068例甲状腺癌患者中医证型研究》^[16]为基础并结合所纳入的PTC患者临床主症及次症、舌苔、脉象进行辨证分型，结果通过两名主治医师确认，分为肝郁气滞、痰瘀互结证、瘀热内结证。患者满足2个主要症状及3个次要症状即可判定该证型，见表 1。

1.6 临床资料及样本收集

收集PTC患者术后癌组织及癌旁组织病理切片和临床病理资料，主要包括：性别及发病年龄、病理分期、癌灶最大直径、癌灶数量、周围组织侵犯及淋巴转移情况。

1.7 免疫组化法检测PTC患者组织切片NLRP3表达

将石蜡切片依次浸泡于二甲苯溶液脱蜡、梯度乙醇溶液水化、煮沸的柠檬酸钠溶液中抗原修复，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗后用5%山羊血清室温封闭30 min；滴加适量的Triton溶液通透处理10 min，PBS漂洗后加入NLRP3（购自Abmart公司）一抗4 ℃孵育过夜；二抗室温孵育1 h，PBS溶液漂洗3次。标本经二氨基联苯胺（DAB）显色、苏木素复染、梯度乙醇溶液脱水后用中性树脂封片，镜下观察、拍照。请两位病理科医师对切片进行判读，主要评分标准为：显色强度和阳性细胞密度。无细胞着色为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分；结合NLRP3染色阳性细胞密度进行评分，阳性细胞数≤25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，76%~100%为4分。以两项评分的乘积判定结果。0~3分为阴性表达，4~12分为阳性表达。

1.8 统计学方法

利用SPSS 25.0软件进行统计分析。计数资料以频数和百分比[例（%）]表示。计数资料组间比较采用卡方检验，多组间计数资料的两两比较采用邦弗伦尼法。NLRP3蛋白免疫组化评分呈偏态分布，采用中位数和四分位数[M（P₂₅, P₇₅）]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 PTC患者术前中医证型分布

本研究共纳入190例PTC患者，患者术前辨证分型均为实证，包含肝郁气滞证、痰瘀互结证、瘀热内结证。各证型人数占比由高到低排列依次为：痰瘀互结证81例（42.6%）＞肝郁气滞证61例（32.1%）＞瘀热内结证48例（25.3%）。

2.2 PTC各证型患者临床病理特征分布

190例PTC患者中年龄＜45岁94例，占49.5%；年龄≥45岁96例，占50.5%；Ⅰ期患者111例，占58.4%；Ⅱ~Ⅳ期患者79例，占41.6%；有淋巴结转移患者100例，占52.6%，无淋巴结转移患者90例，占47.4%；癌灶最大直径＜0.8 cm患者90例，占47.4%；癌灶最大直径≥0.8 cm患者100例，占52.6%；有周围组织侵犯者90例，占47.4%；无侵犯者100例，占52.6%；单个癌灶者144例，占75.8%；多个癌灶者46例，占24.2%。PTC各中医证型患者在性别、年龄、癌灶数量及是否存在周围组织侵犯情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。病理分期上，肝郁气滞证多为Ⅰ期，瘀热内结证多为Ⅱ~Ⅳ期，组间相比，Ⅰ期中肝郁气滞证患者比例、Ⅱ~Ⅳ期中瘀热内结证患者比例均高于痰瘀互结证，差异有统计学意义（P＜0.05）；淋巴结转移情况上，瘀热内结证中淋巴结转移的患者比例高于其他证型，差异有统计学意义（P＜0.05）；与痰瘀互结证相比，肝郁气滞证患者癌灶最大直径多＜0.8 cm，瘀热内结证患者癌灶最大直径多≥0.8 cm（P＜0.05）。见表 2。

2.3 PTC各证型患者癌组织中NLRP3蛋白的表达情况

190例PTC患者中，NLRP3阳性表达122例，占64.2%，阴性表达68例，占35.8%。经χ²检验比较，PTC各证型患者癌组织中NLRP3蛋白的表达情况比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。但痰热互结证患者的PTC组织中观察到较高的NLRP3的阳性表达，提示该证型可能与NLRP3相关的炎症反应活化有关，见表 3。阳性表达与阴性表达代表图见图 1。

2.4 PTC各证型中NLRP3蛋白免疫组化评分差异

经非参数秩和检验分析，NLRP3蛋白免疫组化评分在各证型中表达存在差异（P＜0.05）；进一步两两比较发现瘀热内结证患者癌组织中NLRP3蛋白免疫组化评分显著高于其他两种证型，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 4。

2.5 各证型中不同临床病理特征的PTC患者癌组织NLRP3蛋白表达情况

各证型中，不同性别、年龄、癌灶数量、病理分期患者PTC组织中NLRP3蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。肝郁气滞证中及痰瘀互结中有无周围组织侵犯及癌灶最大直径是否超过0.8 cm的患者间NLRP3表达差异有统计学意义（P＜0.05）；瘀热内结证中，有无淋巴结转移及有无周围组织侵犯的患者间NLRP3表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 5。

3 讨论

中医认为，甲状腺乳头状癌应属“瘿病”的范畴，气滞、血瘀、痰凝是PTC形成的主要病机。肝气郁结致脾失健运，脾脏运化失调，则生水湿，水湿积聚则生痰，痰邪重着黏腻，易与瘀血胶结，痰瘀胶结则肿块坚硬如石。“炎-癌转化”理论认为“癌毒”病机理论与西医学的慢性炎症有类似的致病特点，常与“热”“瘀”“痰湿”等病理因素相互胶结，打破人体气血阴阳平衡，是恶性肿瘤形成的关键病机^[17]。本研究发现PTC患者术前主要为肝郁气滞、痰瘀互结证、瘀热内结证3种证型，均为实证，其中痰瘀互结证占比最高，其次为肝郁气滞证，这与既往报道的甲状腺癌术前中医证型分布基本一致。进一步研究发现PTC肝郁气滞证患者病理分期多处于Ⅰ期，癌灶最大直径多＜0.8 cm；PTC瘀热内结证患者多处于Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期，癌灶最大直径多≥0.8 cm，且淋巴结转移的风险更高，这可能与PTC不同病变阶段的病机不同有关。魏澹宁等^[18]认为肝气郁滞是TC发生的基始病机，多发生在TC的早期，所以预后较好。而肝气郁结结合内生痰湿易致气血运行不畅，日久易化火，火邪煎熬血液成瘀，进而发展成瘀热内结之证，遂瘀热内结证多处于TC的进展期。瘀热内结证兼有瘀血阴邪凝结胶固和火热阳邪易动、燔灼升腾的双重特性，热邪推动瘀血流注、攻窜，所以更容易发生淋巴结转移。瘀热相搏，瘀血助热盛，瘀血不断生成，新旧交错包裹，热灼烧瘀血使得肿块更加坚硬，表明瘀热会导致肿瘤增大、硬化，虽然痰瘀互结证与PTC临床病理特征无明显相关性，但3种证型在有淋巴结转移、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ病理分期以及肿瘤最大直径所占的比例逐步增加，与目前中医对与PTC病理演变及疾病进程认知有异曲同工之处，所以PTC证型变化从侧面反映出了疾病的进展。

NLRP3作为一种炎症小体，可以感知多种细胞内外的应激信号，与PTC的发病密切相关。细胞内氧化应激水平的增加或肿瘤微环境中的某些促炎性因子释放增加，可触发NLRP3炎症小体的激活。NLRP3的激活导致白细胞介素（IL）-1β和IL-18的大量释放，这些促炎性细胞因子在肿瘤微环境中增强了炎症反应，并通过吸引免疫细胞进入肿瘤组织，导致肿瘤进展^[6]。研究表明，NLRP3在PTC组织中呈高表达，NLRP3的过表达可导致PTC细胞的增殖和侵袭能力增强，而抑制NLRP3的激活可以显著降低癌细胞的增殖和侵袭能力^[19]。临床研究发现：NLRP3表达与PTC患者的肿瘤大小、血管侵犯、甲状腺外浸润以及复发与否显著相关，NLRP3高表达的PTC患者复发率升高和无病生存期缩短^[8]。因此，NLRP3不仅可以作为PTC的潜在生物标志物，还可能成为未来PTC治疗的新靶点。

本研究发现各证型PTC患者中NLRP3阳性表达的人数均高于阴性表达，NLRP3阳性表达率由高到低依次为瘀热内结证（77.1%）、肝郁气滞证（63.9%）、痰瘀互结证（56.8%），这提示瘀热内结证的患者机体炎症反应更为显著，是因为瘀热内结证的核心病机包括瘀血、热毒郁滞，这可能与NLRP3炎症小体激活相关。NLRP3炎症小体的激活往往与炎症反应、细胞损伤和免疫失调有关，所以瘀热内结证患者中NLRP3表达程度高于其他证型。本研究中虽然不同证型的PTC患者NLRP3阳性表达差异无统计学意义，但是瘀热内结证的患者NLRP3阳性表达率高于其他两种证型，且瘀热内结证中NLRP3蛋白免疫组化评分高于其他两种证型（P < 0.05），这提示NLRP3阳性表达可能有助于区别瘀热内结证与其他证型。虽然所有证型中NLRP3的表达较高，但其在不同证型中的表达意义不同：本研究发现肝郁气滞证及瘀热内结证的PTC患者在有无周围组织侵犯中NLRP3表达存在差异，且瘀热内结证的PTC患者在有无淋巴结转移中NLRP3表达亦存在差异；这提示NLRP3可能不仅是炎症反应的参与者，也可能在PTC的侵袭和转移过程中发挥了重要作用。痰瘀互结证中癌灶最大直径是否超过0.8　cm的患者间NLRP3表达差异有统计学意义，这表明肝郁气滞证可能更趋向出现侵袭其他组织，瘀热内结证则趋向于高转移性、高侵袭性，而痰瘀互结证更趋向于较大的癌灶直径，NLRP3在区分这些病理特征中具有诊断价值。这可以为进一步研究不同证型在PTC中的分子机制提供线索，并可能有助于开发个体化的治疗策略，通过调控NLRP3来影响疾病进展。

综上所述，本研究强调了将中医证型与现代分子生物学标志物NLRP3相结合的重要性。通过中医辨证论治与分子标志物的联合分析，可以更深入地理解PTC的发病机制，并为临床提供更加精准的诊疗方案。本研究提示术前瘀热内结证患者NLRP3表达程度高于其他证型，并且不同证型中的NLRP3的表达意义也不同。未来针对不同的术前PTC证型患者，可以考虑加入靶向NLRP3通路的中药来早期干预改善预后。但本研究的样本量有限，未来应扩大样本规模以提高研究结果的普遍性。此外，仍需要完善机制研究进一步阐明NLRP3在不同中医证型中的具体作用途径，为中西医结合治疗PTC提供新的思路。