芍葛颗粒由白芍、白及、枳实、葛根、三七、甘草等药味组成，为临床经验方，具有疏肝理气、扶脾和胃的功效，可用于治疗胃食管反流病、胃溃疡等疾病。传统汤剂存在制备不便、储存携带困难、口味苦、患者顺应性差等缺点，一定程度上制约着本方的应用，故开发本方新剂型具有重要意义。其中，白芍为君药，葛根、枳实为臣药，白及为佐药，为占比较高的处方药味，在处方中发挥重要的药效作用，根据2020年版《中华人民共和国药典》，白芍、葛根、白及分别以芍药苷、葛根素、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯为含量测定指标，又据文献报道，柚皮苷具有良好的抗胃溃疡、抗肿瘤等药理作用，是枳实的主要活性成分^[1]。研究表明，芍药苷具有护肝、抗炎、保护血管等作用^[2-4]。葛根素是葛根中发挥护肝作用的主要有效成分，研究表明葛根素可以通过激活黄素依赖性单加氧酶（FMO5）来防止非酒精性脂肪肝引起的肝损伤和脂质积累，并具有抗氧化、抗炎的作用^[5-6]。白及具有收敛止血的功效，主要药效成分白及多糖对乙醇诱导的大鼠急性胃病具有胃保护作用，1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯在白及饮片中含量较高，可作为定量指标^[7-8]。故芍葛颗粒选择葛根素、芍药苷、柚皮苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯为评价指标。本实验基于Box-Behnken响应面法优化芍葛颗粒的干法制粒工艺，并采用高效液相色谱（HPLC）法测定方中葛根素、芍药苷、柚皮苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量对其进行质量控制，以期为本方的剂型改良提供数据支持。

1 材料 1.1 仪器

AX224ZH型万分之一电子天平，奥豪斯（常州）有限公司；TOLEDO-XP205型十万分之一电子天平，瑞士梅特勒托利多公司；XPR6UD5型百万分之一电子天平，瑞士梅特勒托利多公司；GL系列干法制粒机，江苏张家港市开创机械制造有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪（配G7115A型DAD检测器），美国安捷伦公司；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，日本EYELA公司；低温冷却液循环泵，天津科诺仪器设备有限公司；FDU-2100型冷冻干燥机，日本EYELA公司；Millipore-Q型去离子水机，美国Millipore公司；Heraeus Pico 17型高速离心机，赛默飞世尔科技公司；SHH-220SD-2TA型药品稳定性试验箱，重庆康诚永生试验设备有限公司；VOS-310型真空定温干燥器，日本EYELA公司。

1.2 试药

葛根素对照品（批号：110752-202217，纯度：96.8%）、芍药苷对照品（批号：110736-202246，纯度：96.7%）、柚皮苷（110722-202116，纯度：93.5%）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（批号：112061-202102，纯度：95.5%），均购自中国食品药品检定研究院；色谱甲醇购自天津市康科德科技有限公司；去离子水由Millipore-Q去离子水机制得；实验用饮片及喷干粉（批号为231201）均由天津和治药业集团有限公司提供。

2 方法与结果 2.1 成型工艺研究 2.1.1 指标测定 2.1.1.1 成型率

参考^[9]2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0982第二法（双筛分法），将制备得到的颗粒分别过1号筛和5号筛，取通过1号筛但未通过5号筛的颗粒，称质量，计算成型率，公式为：成型率（%）=（合格颗粒质量/颗粒总质量）×100%。

2.1.1.2 休止角

休止角（α）的大小能反应颗粒的流动性好坏。休止角的测定采用固定高度法，将漏斗固定一定高度的位置，将颗粒样品沿漏斗壁倒入漏斗中，固定锥体底盘直径（d），直到漏斗下形成的颗粒尖端不再变化为止，测出圆锥的高度（H），平行测定3次，根据公式：tanα=H/R，求出休止角。

2.1.1.3 吸湿率

参考文献方法^[10]，取干燥至恒重的具塞玻璃称量瓶，置于相对湿度为75%的药品稳定性试验箱中静置24 h，精密称定质量；取颗粒约1 g，平铺于称量瓶中，精密称定质量，称量瓶敞口放置于药品稳定性试验箱中，24 h后取出精密称定质量。计算吸湿率。

2.1.1.4 溶化率

参考文献方法^[11]，取颗粒约1 g，精密称定，加入20 mL的热水，搅拌至溶化。将溶化的溶液搅拌均匀，精密吸取1 mL至1.5 mL离心管中，以12 000 r/min（离心半径为86 mm）离心10 min，倒掉上清液，将离心管真空干燥至恒重，精密称质量，按公式：溶化率（%）=（颗粒质量-未溶化颗粒质量）/颗粒质量×100%，计算溶化率。

2.1.2 辅料种类考察

取喷干粉分别与糊精、麦芽糊精、甘露醇、药用淀粉、微晶纤维素按质量比1∶1混合均匀，投入干法制粒机中，设置滚轮压力为50 kg/cm²，送料速度为40 Hz，压片速度为20 Hz，收集得到的物料，未通过1号筛的大颗粒和通过5号筛的细粉重复制粒2次。所得颗粒测定成型率、吸湿率、溶化率和休止角。参考文献中颗粒质量综合评分计算公式^[12]：综合评分=成型率/最大成型率×40+最小吸湿率/吸湿率×20+溶化率/最大溶化率×20+最小休止角/休止角×20计算综合评分。结果见表 1。结果表明以麦芽糊精作为稀释剂综合评分略低于甘露醇，但麦芽糊精价格低廉、溶化性好，成型率及休止角也满足生产需要，故选择麦芽糊精作为稀释剂。

2.1.3 辅料配比考察

取喷干粉与麦芽糊精按质量比分别为3∶1、2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3混合均匀，投入干法制粒机中，设置滚轮压力为50 kg/cm²，送料速度为40 Hz，压片速度为20 Hz，收集得到的物料，未通过1号筛的大颗粒和通过5号筛的细粉重复制粒2次。所得颗粒测定成型率、吸湿率、溶化率和休止角。结果见表 2。结果表明随着稀释剂的比例增加综合评分增加，考虑到本方处方量大，以药辅比1∶2计算日处方量约为45 g，日服用量过大易引起患者服药顺应性差，药辅比1∶1及1.5∶1综合评分没有差异，以药辅比为1.5∶1时日处方量约为25 g，日服用量小且不影响成型率，故选择药粉与稀释剂的比例为1.5∶1进行后续实验。

2.1.4 单因素实验 2.1.4.1 滚轮压力

取适量喷干粉与麦芽糊精按质量比1.5∶1混合均匀，投入干法制粒机中，设置送料速度为40 Hz，压片速度为20 Hz，设置滚轮压力分别为10、20、30、40、50 kg/cm²，收集得到的物料，未通过1号筛的大颗粒和通过5号筛的细粉重复制粒2次。所得颗粒测定成型率、吸湿率、溶化率和休止角。实验结果见表 3。结果表明，滚轮压力对吸湿率、溶化和休止角无明显影响，随着滚轮压力的增加，综合评分先增加后降低，当滚轮压力为20 kg/cm²时，综合评分最高，故选择滚轮压力为20 kg/cm²进行后续实验。

2.1.4.2 送料速度

取适量喷干粉与麦芽糊精按质量比1.5∶1混合均匀，投入干法制粒机中，设置滚轮压力为20 kg/cm²，压片速度为20 Hz，设置送料速度分别为30、35、40、45、50 Hz，收集得到的物料，未通过1号筛的大颗粒和通过5号筛的细粉重复制粒2次。所得颗粒测定成型率、吸湿率、溶化率和休止角。实验结果见表 4。结果表明，送料速度对吸湿率、溶化和休止角无明显影响，随着送料速度的增加，综合评分先增加后降低，当送料速度为40 Hz时，综合评分最高，故选择送料速度为40 Hz进行后续实验。

2.1.4.3 压片速度

取适量喷干粉与麦芽糊精按质量比1.5∶1混合均匀，投入干法制粒机中，设置滚轮压力为20 kg/cm²，送料速度为40 Hz，设置压片速度分别为15、17、20、23、25 Hz，收集得到的物料，未通过1号筛的大颗粒和通过5号筛的细粉重复制粒2次。所得颗粒测定成型率、吸湿率、溶化率和休止角。实验结果见表 5。结果表明，压片速度对吸湿率、溶化和休止角无明显影响，随着压片速度的增加，综合评分先增加后降低，当压片速度为20 Hz时，综合评分最高，故选择压片速度为20 Hz进行后续实验。

2.1.5 Box-Behnken响应面实验

在单因素实验结果的基础上，确定滚轮压力（A）、送料速度（B）及压片速度（C）为考察因素，且单因素实验的结果表明，滚轮压力、送料速度及压片速度对颗粒的吸湿率、溶化率、休止角无影响，故响应面实验仅以成型率为评价指标，利用Design-Expert 13软件设计Box-Behnken响应面实验对芍葛颗粒成型工艺进行优化。单因素实验参数对成型率的影响趋势见图 1。实验安排及结果见表 6、表 7。

2.1.6 数据处理与分析

采用Design-Expert 13软件对表 7数据分析，得方程为Y=86.35-0.563 7×A+1.39×B-5.26×C-0.655 0×AB+0.802 5×AC+2.45×BC-1.84×A²+0.251 7×B²-1.43×C²，方差分析见表 8，响应面分析见图 2。可知，R²=0.984 6，表明模型拟合度良好，P＜0.000 1，具有高度显著性；失拟项P＞0.05，表明模型无失拟因素存在，可用于预测。3种因素对成型率的影响程度为C（压片速度）＞B（送料速度）＞A（滚轮压力），其中B、C、BC、A²、C²对成型率有显著影响。等高线图显示A（滚轮压力）、C（压片速度）交互作用较强。

2.1.7 验证实验

最终确定，最优工艺为滚轮压力21.17 kg/cm²，送料速度为31.28 Hz，压片速度为15.06 Hz，成型率为91.28%，结合实际生产经验，将其修正为滚轮压力20 kg/cm²，送料速度为31 Hz，压片速度为15 Hz。按上述优化后工艺制备3批颗粒进行验证实验，结果见表 9，3批颗粒平均成型率为91.83%，峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.82%，结果与预测值91.28%接近，证明该工艺可行，重复性好。

2.1.8 临界相对湿度测定

参考文献方法^[13]，设置药品稳定性实验箱的湿度分别为33%、43%、58%、69%、75%、85%及94%，将称量瓶敞口放置于药品稳定性试验箱预饱和24 h，称定质量，取批号为090401、090402、090403的颗粒约1 g，精密称定质量，将已称定质量的颗粒置于不同湿度的药品稳定性试验箱中放置48 h，精密称定质量，计算平衡吸湿率（n=2）。以相对湿度为横坐标，吸湿率为纵坐标，作图，即得吸湿曲线。结果见图 3。根据吸湿曲线计算得到3批颗粒的临界相对湿度分别为66.57%、66.51%、66.58%，RSD值为0.06%，表明芍葛颗粒在生产及储存过程中应保持环境湿度低于66%。

2.2 芍葛颗粒质量控制研究 2.2.1 色谱条件

ZORBAX EP-C₁₈色谱柱（4.6×250 mm，5-micron，美国安捷伦公司），流动相为纯水（A）-甲醇（B），梯度洗脱，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，检测波长250 nm（葛根素）、230 nm（芍药苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯）、283 nm（柚皮苷）。梯度为0~15 min，26% B；15~16 min，26%~28% B；16~17 min，28%~32% B；17~25 min，32%~41% B；25~30 min，41%~46% B；30~40 min，46% B。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取葛根素、芍药苷、柚皮苷及1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量，分别置棕色量瓶中，加70%甲醇溶液制成每1 mL含葛根素602.125 μg、芍药苷345.375 μg、柚皮苷198.425 μg、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯296.125 μg的对照品母液。

分别吸取葛根素、芍药苷、柚皮苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯母液适量置于棕色量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度线，摇匀。得到葛根素浓度为48.17 μg/mL，芍药苷浓度为27.63 μg/mL，柚皮苷浓度为15.874 μg/mL，1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯浓度为23.69 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取自制颗粒样品约0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，称定质量，超声处理20 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备

取葛根阴性冻干粉、白芍阴性冻干粉、枳实阴性冻干粉、白及阴性冻干粉适量，与辅料按比例混匀，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备各阴性样品溶液。

2.2.5 方法学考察 2.2.5.1 专属性实验

分别取颗粒供试品溶液，混合对照品溶液，缺葛根供试品溶液、缺白芍供试品溶液、缺枳实供试品溶液、缺白及供试品溶液，按上述“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。专属性图谱见图 4，结果显示各成分分离度良好，阴性样品无干扰，该方法专属性良好。

2.2.5.2 线性关系考察

精密称取葛根素对照品、芍药苷对照品、柚皮苷对照品、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量于同一棕色量瓶中，用70%甲醇溶解，定容至刻度线，得质量浓度分别为100.900、133.900、64.250和70.650 μg/mL的混合对照品溶液。以70%甲醇溶稀释成系列浓度的混合对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。以浓度c（μg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标进行回归分析，绘制标准曲线。以70%甲醇溶液依次稀释成葛根素浓度为75.675、50.450、25.225、12.613、5.045 μg/mL，芍药苷浓度为100.425、66.950、33.475、16.738、6.695 μg/mL，柚皮苷浓度为48.188、32.125、16.063、8.031、3.213 μg/mL，1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯浓度为52.988、35.325、17.663、8.831、3.533 μg/mL的混合对照品溶液。

葛根素、芍药苷、柚皮苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯的回归方程及相关系数见表 10，结果表明葛根素在5.045~100.900 μg/mL范围内、芍药苷在6.695~133.900 μg/mL范围内、柚皮苷在3.213~64.250 μg/mL范围内、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯在3.533~70.650 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5.3 精密度实验

取葛根素浓度为25.225 μg/mL、芍药苷浓度为33.475 μg/mL、柚皮苷浓度为16.063 μg/mL、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯浓度为17.663 μg/mL的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算指标成分RSD。结果显示，葛根素、芍药苷、柚皮苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰面积的RSD分别为0.12%、0.45%、0.16%和0.17%，表明仪器精密度良好。

2.2.5.4 重复性实验

取批次为090401的颗粒，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算指标成分含量及RSD。结果显示，6份供试品溶液中葛根素、芍药苷、柚皮苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量的RSD分别为0.49%、0.49%、0.52%和0.67%，该方法重复性良好。

2.2.5.5 准确度实验

取批次为090401的颗粒约0.1 g（n=6），精密称定，置量瓶中，分别精密加入“2.2.2”项下各对照品母液适量，加入70%甲醇溶液适量，超声处理20 min，放冷，用70%甲醇溶液定容至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算指标成分含量及RSD。结果显示，葛根素、芍药苷、柚皮苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯的平均加样回收率分别为104.16%、93.36%、93.52%和94.86%，RSD分别为1.40%、1.95%、1.40%和1.59%，表明该方法的准确度良好，可用于样品检测。

2.2.5.6 稳定性实验

取供试品溶液分别于制备后0、2、4、8、12、16、24、36、48 h按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算指标成分含量及RSD。结果显示，葛根素、芍药苷、柚皮苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量的RSD分别为0.29%、0.34%、0.13%和2.02%，表明供试品溶液在室温下放置48 h稳定性良好。

2.2.6 3批颗粒含量测定

取批次为090401、090402、090403的颗粒，按“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算指标成分含量及RSD。结果见表 11。结果表明3批颗粒各指标性成分含量接近，证明该工艺稳定可行。

3 讨论

在前期研究中对湿法制粒及干法制粒工艺进行了比较，湿法制粒工艺简单，对设备要求较低，但颗粒成型所需辅料量较多，且本方处方量较大，制成颗粒日服用量较大，故不选择湿法制粒方式。干法制粒是将药物和辅料粉末混合均匀，经压力挤压成具有一定硬度的片状物，再通过筛网粉碎制成颗粒的方法^[14]。此过程有助于改善中药粉体性质，增强流动性，降低吸湿性，提升了物料的可加工性能。有研究表明^[15]，在相同的处方条件下以干法制粒制得颗粒抗吸湿性能较湿法制粒和流化床制粒更好。但干法制粒存在一次成型率不高^[16]等问题，但其优势是可通过重复制粒得到较高的成型率。

Box-Behnken设计响应面法^[17]是一种多因素非线性实验优化方法，具有实验次数少，实验精度高的优点，并可直观体现各因素间的交互作用。在处方筛选、工艺优化、制剂成型等方面^[18-21]应用广泛。在单因素实验考察中发现，在处方固定的情况下调整仪器参数仅对成型率有明显影响，故后续本实验利用Box-Behnken响应面法对芍葛颗粒的成型工艺进行优化，以成型率作为评价指标，得到优化后的最佳工艺为：取质量比为1.5∶1的喷干粉和麦芽糊精，混合均匀，投入干法制粒机中，设置滚轮压力为20 kg/cm²、送料速度为31 Hz、压片速度为15 Hz，重复制粒3次。3批工艺验证的结果表明，颗粒成型率均值为91.83%，RSD为0.82%，表明优化后的工艺稳定可行。方法学验证结果表明，建立的多指标含量测定方法可用于生产过程中的质量控制。