2025, Vol. 42文章信息
- 张波, 徐一方, 袁永康, 等.
- ZHANG Bo, XU Yifang, YUAN Yongkang, et al.
- 二苯乙烯类化合物通过NLRP3炎症小体改善脂肪细胞胰岛素抵抗的作用机制
- Mechanism of stilbene compounds on the improvement of insulin resistance of adipocytes by NLRP3 inflammasome
- 天津中医药, 2025, 42(6): 768-777
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(6): 768-777
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.06.15
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文章历史
- 收稿日期: 2025-01-25
2. 天津中医药大学, 组分中药国家重点实验室, 天津 301617
2型糖尿病(T2DM)是21世纪最常见的代谢性疾病之一[1], 其基本的发病机制是胰岛素抵抗(IR)[2]。炎症反应与IR存在直接联系, 可以诱导肝脏、脂肪等组织IR的发生发展[3]。一些促炎因子如白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)等会加重炎症反应, 进而加剧脂肪异位沉积导致的全身性IR。相反, 脂联素(Adipoq)等抗炎因子能够减轻炎症, 改善IR[4-5]。大量研究证实抑制炎症水平可以改善IR, 从而发挥治疗T2DM的作用[6]。
NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体与炎症及相关炎症因子的表达密切相关。NLRP3炎症小体被激活后, 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1前体(pro-caspase 1)蛋白水解成剪切型caspase 1(cle-caspase 1), cle-caspase 1介导pro-IL-1β、pro-IL-18剪切形成成熟的促炎因子IL-1β、IL-18, 从而加重炎症反应[7-8]。已有研究表明, NLRP3在炎症致IR的过程中起推动作用[9], 抑制NLRP3炎症反应可有效缓解T2DM及其并发症的发生发展[10], 故NLRP3已经成为治疗T2DM的药物靶点。
糖尿病古称"消渴"病, 中医认为糖尿病病机主要是阴亏燥热、津液损耗引起肺燥、胃热、肝肾虚损、气血俱亏。故而临床多用清热燥湿、养血益气类中药治疗糖尿病[11]。此类中药的代表有虎杖、桑白皮、何首乌等。虎杖清热利湿、散瘀定痛, 何首乌补肝肾、益精血, 而桑白皮则能够清肺热、利水消肿, 3者均为治疗消渴的常用中药[12-13]。这3种中药中含有多种活性成分, 其中含有的二苯乙烯类化合物被报道在抗炎、调节糖脂代谢等方面均有治疗效果[14-17]。有研究表明, 虎杖主要活性成分白藜芦醇(Re)既能改善自发性T2DM Goto-Kakizaki(GK)大鼠骨骼肌中的葡萄糖耐量并防止了脂质积累等糖尿病症状, 又可通过减少IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生缓解GK大鼠骨骼肌和肝脏组织中的炎症[18-19]。桑白皮中含量最大的化学成分桑皮苷A(SP)能抑制髓核细胞炎症模型中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶(COX-2)和IL-6的产生[20-21], 且可以通过保持肠道完整性来改善糖尿病内毒素血症[22]。何首乌中含量最高的何首乌苷(HSW)可对多种炎症模型通过不同分子机制发挥抗炎作用[23]。课题组前期研究发现, Re、SP和HSW能够改善3T3-L1脂肪细胞模型中的IR, 发挥降糖活性[14]。但是该类分子改善IR的靶点及相关分子机制尚不明确。因此, 本研究围绕NLRP3与炎症和IR的关系深入研究二苯乙烯类化合物的降糖作用机制, 为这类化合物应用于临床治疗T2DM提供实验基础。
1 材料新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司, 22011-8612);胎牛血清(FBS, 天津灏洋生物制品科技有限公司, TBD21HY); BSA溶液(德国默克公司, 9048-46-8);1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX, 德国默克公司, 28822-58-4);地塞米松(Dex, 德国默克公司, 50-02-2);罗格列酮(ROS, 德国默克公司, 122320-73-4);胰岛素(丹麦诺和诺德公司, 114441);TNF-α(美国Proteintech公司, 315-01A); RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司, P0013C); 异丙醇(天津博迪化工有限公司, 67-63-0);鼠抗NLRP3抗体(SAB, 29125);鼠抗β-actin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司, TA-09);兔抗cle-caspase 1抗体(美国Proteintech公司, 22915-1-AP); 兔抗pro-caspase 1抗体(美国Proteintech公司, 31020-1-AP); 白藜芦醇(Re, 上海源叶生物科技有限公司, 501-36-0, 见图 1); 何首乌苷(HSW, 上海源叶生物科技有限公司, 82373-94-2, 见图 1); 桑皮苷A(SP, 天津中医药大学邱峰教授惠赠, 见图 1), 经高效液相色谱(HPLC)鉴定纯度大于或等于96%。化合物均用在无菌环境中溶解于二甲基亚砜(DMSO), -20℃冻存。
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| 图 1 白藜芦醇（Re）、桑皮苷A（SP）、何首乌苷（HSW）的化学结构式 Fig. 1 Chemical structure of resveratro(l Re), mulberroside A(SP), and polygonum multiflorum glycosides(HSW) |
使用SwissTargetPrediction数据库预测Re、SP、HSW的作用靶点, 把各自的靶点合并再剔除重复的靶点。在GeneCards数据库预测治疗炎症和糖尿病的相关疾病靶点, 炎症的筛选分数为9.5以上, 糖尿病的筛选分数在5.9以上。将上述获取的靶点取交集得到共同靶点, 使用STRING数据库, 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络, 在DAVID数据库分别进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析, 选用排名较高的通路进行下一步研究[24]。通过GEO数据库筛查到与T2DM相关的基因表达谱数据集GSE7014, 利用该数据集中正常人与患者的差异基因对于KEGG富集结果中感兴趣的通路进行基因集富集分析(GSEA)。
2.2 3T3-L1细胞的培养和诱导成熟当小鼠前脂肪细胞(中国科学院干细胞库, 3T3-L1)在二氧化碳恒温培养箱(上海力申科学仪器有限公司, HF240)生长到合适密度时, 将其置于已经加入0.5 mmol/L的IBMX、1 μmol/L的Dex、10 μg/mL的胰岛素、3 μmol/L ROS和10% FBS的DMEM高糖培养基培养(美国Gibco公司, 12800-017)48 h后, 再替换为已加入胰岛素、ROS和FBS的DMEM高糖培养基培养48 h, 间隔48 h更换培养基, 分化成熟的细胞比例达到80%以上即可满足建立模型的使用要求。
2.3 TNF-α诱导建立3T3-L1细胞IR模型用无血清DMEM高糖培养基培养成熟的3T3-L1细胞, 向模型组的细胞中加入TNF-α诱导建立模型, 定期更换新培养基, 最后检测葡萄糖消耗量, 具体方法详见参考文献[14]。
2.4 葡萄糖消耗量检测实验待测组弃掉上清液后用PBS溶液洗2遍, 空白对照组和模型组加入无血清低糖DMEM培养基, 胰岛素刺激的空白对照组和模型组加入含有100 nmol/L胰岛素的无血清低糖DMEM培养基, 于孵箱孵育15 min后吸取上清液于96孔板中, 采用葡萄糖氧化酶法试剂盒(北京普利莱公司, E1010)检测上清液中葡萄糖含量。
2.5 噻唑蓝(MTT)法取待测组别细胞用5 mg/mL的MTT溶液在5% 恒温培养箱中作用2.5 h后, 除去原溶液, 用150 μL的DMSO溶液作用10 min并震板, 用酶标仪(美国伯腾仪器有限公司, 254962)的490 nm波长测定OD值, 可计算得细胞存活率。
2.6 分子对接通过Protein Data Ban PDB(https://www.rcsb.org/structure/2Z63)数据库下载疾病关键靶蛋白NLRP3的3D结构图, 利用PubChem数据库、TCMSP数据库、在线工具(https://www.mn-am.com/demos)下载并绘制Re、SP、HSW的3D结构图, 利用AutoDock Vina软件进行对接, 通过PLIP(https://projects.biotec.tu-dReden.de/plip-web/plip)将对接结果进行可视化处理。
2.7 细胞热转移实验(CETSA)检测二苯乙烯类化合物与NLRP3的结合情况取诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞, 接种于培养瓶中并给药, 作用24 h后收集细胞和培养基, 离心去上清液(离心半径8.2 cm), 加入1 mL PBS后将悬液转移至1.5 mL的EP管中, 离心弃上清液, 将含有PMSF与RIPA的裂解液加入到收集好的细胞饼中, 涡旋混匀后再经过冰浴30 min, 期间涡旋再离心2次, 超声破碎仪超声, 离心吸取上清, 即为总蛋白溶液。将总蛋白提取液进行定量。然后将总蛋白提取液以5℃为间隔, 按40~70℃等分为7份, 进行梯度温度加热, 每梯度3 min, 各个样品进行离心后将上清液转移到新的EP管中。根据所得蛋白定量结果制备上样样品, 然后进行蛋白免疫印迹(Western blot)法实验。
2.8 Western blot实验加入RIPA裂解液提取细胞蛋白, 用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司, PC0020)考察蛋白浓度。根据检测结果计算相应样品所需加入的缓冲液, 高温煮蛋白后, 即制成样品, 使用时, 采用电泳和转印电源(美国伯乐公司, PowerPacTM Basic)等仪器分别进行制胶、电泳、转膜、封闭、加入一抗和二抗等处理后, 最后采用全自动化学发光分析系统(上海天能科技有限公司, 5200)曝光条带, 并分析定量, 具体方法详见参考文献[14]。
2.9 逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)实验收集待测细胞, 提取RNA, 测得浓度, 加入相应逆转录试剂, 逆转录为cDNA, 再加入相应扩增试剂, 经过PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司, A28132)完成cDNA的扩增, 采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量, 具体方法详见参考文献[14]。引物序列见表 1。
用SPSS 21.0软件进行数据分析, 每个实验结果均源于3次以上的独立实验, 最终结果采用均数±标准差(x±s)表示, 用单因素方差法考察组间差异, P < 0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 网络药理学分析结果合并预测到的Re、SP和HSW对应的所有靶点, 删除重复的, 得到248个化合物作用靶点, 炎症疾病相关靶点得到1 017个, 糖尿病治疗相关靶点得到807个, 把上述各自相关靶点取交集得到40个共同靶点, 见图 2A, 将其构建成PPI网络, 见图 2B。GO功能富集分析结果中分别筛选出前20条生物过程相关条目, 包含MAPK信号通路、葡萄糖代谢等; 前20条细胞组分相关条目, 包含线粒体、细胞质等; 前20条分子功能相关条目, 包含蛋白质结合、转录辅助因子结合等, 见图 2C。KEGG通路富集得到与疾病相关的前20条通路, 见图 2D。结果提示, Re、SP、HSW参与调控免疫、细胞凋亡、内分泌功能等途径治疗炎症和糖尿病。预测的结果中, NOD样受体信号通路排名靠前。利用GSEA分析GSE7014数据集的差异基因在NOD样受体信号通路中的富集情况, 结果为数据集的核心基因占NOD样受体信号通路基因集中基因总数的20%, 占所有基因的23%, 富集强度为16%, 见图 3, 且近期研究发现NLRP3炎性小体参与糖尿病及其并发症的发病过程[25-26]。因此, 本研究选取NLRP3炎性小体进一步探讨Re、SP和HSW改善胰岛素抵抗的作用机制。
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| 图 2 化合物、炎症和糖尿病对应靶点韦恩图（A）、PPI图（B）、GO功能富集分析图（C）与KEGG通路富集图（D） Fig. 2 Venn diagram of targets for compounds, inflammation, and diabetes mellitus(A), PPI diagram(B), GO function enrichment analysis(C), KEGG pathway enrichment analysis(D) |
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| 图 3 NOD样受体信号通路中GSEA的富集分析 Fig. 3 GSEA analysis on NOD-like receptor signaling pathway |
将各二苯乙烯化合物与NLRP3抑制剂MCC950联合作用于IR-3T3-L1细胞24 h后, 检测细胞存活率和葡萄糖消耗情况。结果显示, 相较于对照组, Re、SP、HSW和联合用药组对IR-3T3-L1细胞的存活率无显著影响, 见图 4A。相较于对照组, 模型组葡萄糖摄取量明显减少。与模型组相比, Re可以逆转葡萄糖摄取的减少, 而SP和HSW可以显著逆转葡萄糖摄取的减少。与Re、SP、HSW单独给药组相比, 再加入MCC950抑制剂可进一步促进IR-3T3-L1细胞葡萄糖消耗, 见图 4B。以上结果说明, 二苯乙烯类化合物可能通过抑制NLRP3改善IR。
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| 注：与加胰岛素的空白对照组比较，**P < 0.01；与加胰岛素的模型组比较，#P < 0.05；与加入RE、SP给药组比较，△△P < .01；与加入HSW给药组比较，△P < 0.05。 图 4 Re、SP、HSW与MCC950联用对IR-3T3-L1细胞存活率（A）及葡萄糖消耗的影响（B） Fig. 4 Effects of Re, SP, HSW combined with MCC950 on the survival rate(A)and glucose consumption of IR-3T3-L1 cell(s B) |
基于分子对接技术初步考察Re、SP、HSW与NLRP3结合情况。结果显示, Re、SP、HSW与NLRP3结合能分别为-8.3、-12.7和-9.8 kcal/mol, 表明Re、SP和HSW均能与NLRP3直接结合。具体结合方式为Re与HSW可能通过疏水作用和氢键的方式与NLRP3的结合, SP可能以疏水作用、氢键作用、盐桥作用和π-π堆积方式与NLRP3发生结合。见图 5。
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| 图 5 Re、SP、HSW与NLRP3的分子对接结果 Fig. 5 Molecular docking between Re, SP, HSW and NLRP3 |
基于CETSA技术考察Re、SP、HSW与可能的靶蛋白NLRP3的结合情况。结果显示, 与空白对照组比较, SP、HSW组在50~65℃间发生了曲线漂移, 且分别在55℃, 60℃下NLRP3蛋白热稳定性显著高于对照组, 见图 6B和6C, 而Re组CETSA曲线与空白对照组基本一致, 无漂移现象, 见图 6A。说明SP、HSW可与NLRP3发生直接结合。
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| 注：图A，Re对NLRP3蛋白热稳定性的影响；图B，SP对NLRP3蛋白热稳定性的影响；图C，HSW对NLRP3蛋白热稳定性的影响。与空白对照组比较，*P < 0.05。 图 6 Re、SP、HSW与NLRP3蛋白结合的CETSA曲线 Fig. 6 CETSA curves of Re, SP, and HSW binding to NLRP3 protein |
Western blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、pro-caspase 1、cle-caspase 1的表达。实验结果表明, 相较于空白组, TNF-α明显促进了NLRP3、cle-caspase 1的蛋白表达, 并降低pro-caspase 1蛋白的表达; 与模型组相比, Re、SP和HSW显著下调了NLRP3的蛋白表达, SP和HSW明显上调pro-caspase 1的蛋白表达, HSW明显下调cle-caspase 1的蛋白表达, 且SP和HSW可降低cle-caspase 1/pro-caspase 1的比值。以上结果说明Re、SP、HSW可以抑制NLRP3炎症小体的激活。见图 7。
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| 注：图A，Western blot条带；图B，NLRP3蛋白相对表达量；图C，pro-caspase 1蛋白相对表达量；图D，cle-caspase 1蛋白相对表达量；图E，cle-caspase/pro-caspase 1的比值。与加胰岛素的空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与加胰岛素的模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 图 7 Re、SP、HSW对IR-3T3-L1细胞的NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响 Fig. 7 Effects of Re, SP, HSW on the expression of NLRP3 inflammasome-related proteins in IR-3T3-L1 cells |
RT-qPCR法检测了NLRP3炎症小体相关炎症因子IL-6、IL-1β、IL-18以及Adipoq的mRNA表达。实验表明, 相较于空白组, 模型组TNF-α明显促进了IL-6、IL-1β、IL-18的mRNA表达, 而明显抑制了Adipoq的mRNA表达; 与模型组相比, Re显著下调了IL-6、IL-18、IL-1β的mRNA表达, SP显著下调了IL-6、IL-1β的mRNA表达, HSW则显著下调了IL-1β的mRNA表达。以上结果说明Re、SP、HSW可以抑制炎症因子的表达。见图 8。
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| 注：与空白对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与加胰岛素的模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 图 8 Re、SP、HSW对IR-3T3-L1细胞炎症因子mRNA表达的影响 Fig. 8 Effects of Re, SP, and HSW on mRNA expression of inflammatory factors in IR-3T3-L1 cells |
大量中药及其来源的活性成分可以通过改善IR, 增强机体对胰岛素的敏感性, 以及减少组织炎症并保护受损组织等发挥治疗糖尿病的作用[27]。其中, 中药来源的多种二苯乙烯类化合物被报道具有改善IR的作用。例如, 在注入β-淀粉样蛋白大鼠模型中, Re通过增强海马组织胰岛素信号和全身胰岛素敏感性提高记忆功能[28]。HSW通过重建肠道微生物多样性调节IR和葡萄糖代谢[29]。
炎症因子可能通过自分泌或内分泌的方式改变脂肪组织中的胰岛素信号传导及胰岛素敏感性[4-5]。如IL-6是一种由多种细胞分泌的促炎因子, 其循环水平增高被认为可以预测T2DM的发生发展[30]。IL-1β在糖尿病大鼠血清及骨骼肌中显著升高, 能够影响胰岛素受体底物(IRS)的磷酸化减弱胰岛素信号的传导, 加剧IR[31-32]。IL-18是由巨噬细胞, 脂肪组织等产生的促炎因子。Rasheed等指出IL-18与IR相关, 其在肥胖人群的血浆、脂肪组织中高表达[33]。Adipoq要来源于脂肪组织, 以多种亚型在血清中循环。大量研究表明, 血清中Adipoq水平下降与IR的加剧有关[34]。本研究中, TNF-α能够显著增加IR-3T3-L1细胞中IL-6、IL-1β、IL-18的mRNA表达, 降低Adipoq的mRNA的表达。Re能够明显减少IL-6、IL-18、IL-1β的mRNA表达, SP能够明显减少IL-6、IL-1β的mRNA表达, HSW能够明显减少IL-1β的mRNA表达, 说明Re、SP、HSW可能通过抗炎改善IR。为了深入研究Re、SP、HSW改善炎症及治疗糖尿病之间的关系及作用机制, 本研究进行了网络药理学实验, 并经过GO和KEGG富集分析, 发现Re、SP、HSW可能通过多种机制如NOD样受体信号通路、IL-17、TNF、有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)等相关通路发挥抗炎作用, 还可以通过免疫调节、细胞凋亡等途径发挥保护作用。据报道, NLRP3是NOD样受体信号通路目前研究最多的相关蛋白, NLRP3的抑制或缺失可以减轻饮食和肥胖相关的IR, 这是肥胖诱导的IR进展的基础过程之一[35]。NLRP3炎症小体的激活与抑制参与多种T2DM相关疾病的发生、发展及治疗过程[36-38]。例如, 在同型半胱氨酸(Hcy)诱导的小鼠IR过程中发现脂肪组织中NLRP3的表达增加[39]。另有报道, 相较于对照组, 在IR-HepG2细胞模型中NLRP3表达显著上升[40]。一些中药来源活性化合物被证实可通过NLRP3发挥抗T2DM的作用[40-41]。本研究围绕NLRP3炎症小体研究了Re、SP、HSW发挥降糖活性的具体机制, 研究发现Re、SP和HSW与NLRP3抑制剂联用可进一步促进IR-3T3-L1细胞葡萄糖的消耗, 提示Re、SP和HSW可能通过NLRP3改善IR。同时, 分子对接及CESTA实验表明SP、HSW可能直接与NLRP3结合。
当机体受到刺激时NLRP3炎症小体被激活, 继而诱导pro-caspase 1自裂解而活化成cle-caspase 1, 从而导致促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟, 炎症因子表达增多会加重IR[42]。本研究结果也显示, TNF-α造模后, NLRP3、cle-caspase 1蛋白表达增多, pro-caspase 1表达减少。研究表明, 在多种与炎症相关的疾病中, Re能够通过抑制NLRP3减轻炎性损伤, 降低炎症因子mRNA的表达[43-45]。本研究首次发现, 除了Re以外, 其他两种二苯乙烯类化合物SP和HSW也可通过抑制NLRP3炎症小体降低炎症因子的表达而改善IR。
综上所述, Re、SP、HSW可能通过抑制NLRP3进而改善脂肪细胞炎症反应和IR, 从而发挥降糖活性。本研究为阐明中药活性成分二苯乙烯类化合物通过抗炎发挥降糖作用机制提供了实验基础及理论依据。
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2. State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China