2025, Vol. 42文章信息
- 吴琳琳, 孙晓敏, 闫星羽, 等.
- WU Linlin, SUN Xiaomin, YAN Xingyu, et al.
- 基于AMPK/Sirt1通路探讨赤芍总苷对中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症的影响
- Investigating the effect of total paeony glycoside on airway inflammation in mice with neutrophilic asthma based on the AMPK/Sirt1 pathway
- 天津中医药, 2025, 42(6): 778-783
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(6): 778-783
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.06.16
-
文章历史
- 收稿日期: 2025-01-25
哮喘是一种常见的异质性慢性气道疾病, 包括非嗜酸性粒细胞性哮喘、嗜酸性粒细胞性哮喘, 中度至重度哮喘以及糖皮质激素耐药性哮喘患者中中性粒细胞则明显增加, 其治疗难度较大, 全球有哮喘患者超过3亿, 且其发病率逐年增加[1-2]。赤芍总苷(TPG)是从芍药根中提取的生物活性化合物, 具有多种药理特性如抗炎、缓解疼痛、抗氧化[3]。有研究表明TPG可以抑制慢性阻塞性肺疾病中的炎性反应及细胞凋亡[4]。炎性反应在中性粒细胞性哮喘发展过程中发挥关键作用[5], 但TPG能否通过抑制中性粒细胞性哮喘小鼠的气道炎症阻止疾病进展尚未报道。研究表明激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(Sirt1)通路可在多种炎性疾病包括哮喘中发挥抗炎作用, 研究表明紫檀芪可抑制嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的浸润, 可能与激活AMPK/Sirt1通路有关, 而中度至重度哮喘中中性粒细胞增加, 提示激活AMPK/Sirt1通路可能有助于减轻哮喘进展[6]。本研究旨在探讨TPG对中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症的影响及潜在的作用机制。
1 材料 1.1 实验动物从安徽医科大学购入SPF级雌性BALB/c小鼠(年龄6~8周, 体质量20~25 g), 许可证号: SCXK(皖)2022-001。小鼠饲养在特定的无病原体条件下, 饲养环境的温度为20~24℃, 湿度为55%±10%, 光/暗循环为12 h, 自由获取食物和水。所有实验动物方案均经郑州大学附属儿童医院伦理委员会批准(伦理号: 202404005)。
1.2 实验试剂与仪器张仲景大药房提供赤芍, 并通过乙醇回流法提取95%以上并经液质联用检测鉴定为TPG; Selleck公司提供AMPK抑制剂Compound C; 上海西格玛奥德里奇贸易有限公司提供地塞米松; 美国Sigma公司提供卵清蛋白; 杭州联科美讯生物医药技术有限公司提供白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒; 上海吉泰依科赛生物科技有限公司提供IL-17 ELISA试剂盒; 武汉艾美捷科技有限公司提供肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒; 英国Abcam公司提供AMPK、AMPK磷酸化(p-AMPK)、Sirt1抗体。美国Bio-Rad公司提供ChemiDoc XRS凝胶成像系统; 日本奥林巴斯公司提供奥林巴斯CX31光学显微镜。
2 方法 2.1 动物分组与模型的制备[7]、干预将适应性喂养1周的小鼠, 随机分为造模组(50只)及对照组(10只), 其中造模组小鼠在实验开始的第1天鼻腔滴入由脂多糖和生理盐水配置的10 μg/μL卵清蛋白致敏溶液, 每间隔2 d再次重复该操作, 共鼻腔滴入致敏溶液3次, 每只20 μL。对照组小鼠按照上述操作进行鼻腔滴注生理盐水。将造模小鼠随机分为致敏组、TPG低剂量(TPG-低)组、TPG高剂量(TPG-高)组、地塞米松组、TPG-高+抑制剂组, 每组10只, 实验第21~27天, 每天将各组小鼠置于雾化箱, 并进行每天30 min的卵清蛋白激发(对照组小鼠采用生理盐水), 随后TPG-低组、TPG-高组基于参考文献[8]及大量预实验, 分别以150、300 mg/kg TPG灌胃小鼠, 每日1次; 地塞米松组小鼠腹腔注射4 mg/kg地塞米松, 每日1次[7]; TPG-高+抑制剂组小鼠在300 mg/kg TPG灌胃同时, 以15 mg/kg AMPK抑制剂干预, 每日1次[9], 致敏组小鼠均经等体积生理盐水干预, 每日1次, 各组小鼠每天药物或生理盐水干预1 h后, 再次置于雾化箱进行雾化激发(对照组小鼠依然用生理盐水)。
2.2 气道阻力分析各组小鼠最后激发1 h后进行气道阻力检测: 采用肺功能仪通过连接的雾化器在气管内输送浓度递增的乙酰甲碱(0、6.25、12.5、25 g/L)进行反应, 每个浓度反应3 min, 测定增强呼气间歇平均值, 评估气道阻力。
2.3 收集支气管肺泡灌洗液(BALF), 并对细胞分类计数气道阻力评估后, 用0.75%戊巴比妥钠麻醉小鼠, 用磷酸盐缓冲溶液灌洗双肺后收集BALF, 反复灌洗3次, 3 000 r/min离心5 min, 离心半径10 cm, 后将细胞沉淀重悬, 通过细胞计数板统计细胞总数, 并通过迪夫快速染色, 对细胞溶液进行分类计数。
2.4 ELISA检测BALF中炎性因子水平将获得的BALF以1 600 r/min离心15 min, 离心半径10 cm, 使用ELISA试剂盒检测并观察上清液中炎性因子水平(IL-6、IL-17、TNF-α)的变化。
2.5 苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化收集左肺叶并固定在4%多聚甲醛缓冲液中至少24 h, 然后脱水并包埋在石蜡中, 切成5 μm的切片, 并用HE染色, 其中0.2%苏木精染色5 min, 0.35%伊红染色3 min, 由2名病理研究人员通过双盲法在显微镜下以400倍的放大倍率观察切片, 并对气道炎性进行0~4分的评分: 0分无炎性浸润; 1分为少量炎症细胞浸润; 2分为单层细胞包绕的大量炎性细胞浸润; 3分为炎性细胞浸润为2~4层细胞; 4分为炎性细胞浸润超过4层细胞。
2.6 高碘酸-希夫(PAS)染色观察气道黏液分泌的变化石蜡切片制备同上, 对肺组织石蜡切片进行PAS染色, 测定气道中PAS阳性细胞比例进行评分, 0分为阳性细胞比例 < 5%;1分为5%~25%;2分为26%~50%;3分为51%~75%;4分为 > 75%。
2.7 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测肺组织中相关蛋白表达RIPA裂解缓冲液从右肺组织中提取总蛋白并测定浓度, 将30 μg蛋白质添加到10% SDS-PAGE凝胶上, 并在100、150 V下分别运行10、45 min。然后将凝胶转移到PVDF膜, 在振荡器中加入相应的AMPK、p-AMPK、Sirt1一抗, 在4℃下孵育过夜, 使用TBST洗涤膜, 并与适当的HRP标记的二抗孵育, 可视化PVDF膜, 使用凝胶成像系统对膜进行检测, 使用Image J对图像进行灰度分析和定量。
2.8 统计学方法采用SPSS 27.0软件分析实验数据, 以均数±标准差(x±s)表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 以SNK-q检验进一步两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 TPG对各组小鼠呼气间歇值的影响与对照组相比, 致敏组呼气间歇值明显增加(P < 0.05);与致敏组相比, TPG-低组、TPG-高组、地塞米松组呼气间歇值明显降低, 不同剂量TPG间差异有统计学意义(P < 0.05);与TPG-高组相比, TPG-高+抑制剂组呼气间歇值明显增加(P < 0.05), 见图 1。
|
| 注：A，对照组；B，致敏组；C，TPG-低组；D，TPG-高组；E，地塞米松组；F，TPG-高+抑制剂组。n=10。与对照组比较，*P < 0.05；与致敏组比较，#P< 0.05；与TPG-低组比较，△P < 0.05；与TPG-高组比较，▲P < 0.05。 图 1 各组小鼠气道阻力变化比较 Fig. 1 Comparison of changes in airway resistance of mice in each group |
与对照组相比, 致敏组中性粒细胞等炎性细胞数均明显增加(P < 0.05);与致敏组相比, TPG-低组、TPG-高组、地塞米松组中性粒细胞等炎性细胞数均明显降低(P < 0.05), 不同TPG间差异有统计学意义(P < 0.05);与TPG-高组相比, TPG-高+抑制剂组中性粒细胞等炎性细胞数均明显增加(P < 0.05), 见图 2。
|
| 注：A，对照组；B，致敏组；C，TPG-低组；D，TPG-高组；E，地塞米松组；F，TPG-高+抑制剂组。n=10。与对照组比较，*P < 0.05；与致敏组比较，#P< 0.05；与TPG-低组比较，△P < 0.05；与TPG-高组比较，▲P < 0.05。 图 2 各组小鼠炎性细胞计数比较 Fig. 2 Comparison of number of inflammatory cells of mice in each group |
与对照组相比, 致敏组IL-6、IL-17、TNF-α水平增加(P < 0.05);与致敏组相比, TPG-低组、TPG-高组、地塞米松组IL-6、IL-17、TNF-α水平降低(P < 0.05), 不同TPG间差异有统计学意义(P < 0.05);与TPG-高组相比, TPG-高+抑制剂组IL-6、IL-17、TNF-α水平升高(P < 0.05), 见图 3。
|
| 注：A，对照组；B，致敏组；C，TPG-低组；D，TPG-高组；E，地塞米松组；F，TPG-高+抑制剂组。n=10。与对照组比较，*P < 0.05；与致敏组比较，#P< 0.05；与TPG-低组比较，△P < 0.05；与TPG-高组比较，▲P < 0.05。 图 3 各组小鼠IL-6、IL-17、TNF-α水平比较 Fig. 3 Comparison of levels of IL-6, IL-17, and TNF-α of mice in each group |
对照组无明显损伤; 致敏组组织出现水肿, 血管周围出现许多炎症细胞, 炎性评分明显增加(P < 0.05);经不同剂量TPG及地塞米松干预后, 炎症病理变化减轻, 炎性评分较致敏组明显降低(P < 0.05);与TPG-高组相比, TPG-高+抑制剂组病理变化增加, 炎性评分明显增加(P < 0.05), 见图 4、图 5。
|
| 图 4 肺组织病理学变化（HE，×400） Fig. 4 Lung histopathological changes(HE, ×400) |
|
| 注：A，对照组；B，致敏组；C，TPG-低组；D，TPG-高组；E，地塞米松组；F，TPG-高+抑制剂组。n=10。与对照组比较，*P < 0.05；与致敏组比较，#P < 0.05；与TPG-低组比较，△P < 0.05；与TPG-高组比较，▲P < 0.05。 图 5 各组小鼠病理评分比较 Fig. 5 Comparison of pathological scores of mice in each group |
对照组无明显气道黏液; 致敏组气道黏液分泌显著, PAS评分较对照组增加(P < 0.05);经不同剂量TPG及地塞米松干预后, 气道黏液分泌明显减少, PAS评分较致敏组降低(P < 0.05);与TPG-高组相比, TPG-高+抑制剂组气道黏液稍有增加, PAS评分明显增加(P < 0.05), 见图 6、图 7。
|
| 图 6 气道黏液变化（PAS，×400） Fig. 6 Airway mucus changes(PAS, ×400) |
|
| 注：A，对照组；B，致敏组；C，TPG-低组；D，TPG-高组；E，地塞米松组；F，TPG-高+抑制剂组。n=10。与对照组比较，*P < 0.05；与致敏组比较，#P < 0.05；与TPG-低组比较，△P < 0.05；与TPG-高组比较，▲P < 0.05。 图 7 各组小鼠PAS评分比较 Fig. 7 Comparison of PAS scores of mice in each group |
与对照组相比, 致敏组p-AMPK/AMPK、Sirt1蛋白表达降低(P < 0.05);与致敏组相比, TPG-低组、TPG-高组、地塞米松组p-AMPK/AMPK、Sirt1蛋白表达增加(P < 0.05), 不同TPG间差异有统计学意义(P < 0.05);与TPG-高组相比, TPG-高+抑制剂组p-AMPK/AMPK、Sirt1蛋白表达降低(P < 0.05), 见图 8。
|
| 注：A，对照组；B，致敏组；C，TPG-低组；D，TPG-高组；E，地塞米松组；F，TPG-高+抑制剂组。n=10。与对照组比较，*P < 0.05；与致敏组比较，#P < 0.05；与TPG-低组比较，△P < 0.05；与TPG-高组比较，▲P < 0.05。 图 8 各组小鼠组织中p-AMPK/AMPK、Sirt1蛋白表达比较 Fig. 8 Comparison of expression of p-AMPK/AMPK and Sirt1 protein of mice in each group |
支气管哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病, 以气流受限、黏液分泌增加、炎性反应增加为主要特征, 嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等许多细胞在哮喘的发作中起着重要作用, 尤其是中性粒细胞性哮喘, 通常与疾病严重程度和对治疗反应不佳有关[10-11]。中性粒细胞性哮喘是临床哮喘患者的主要表型, 且皮质类固醇治疗反应不佳, 因此有发生难治性哮喘的风险, 产生巨大的医疗费用[12], 因此研究中性粒细胞性哮喘的发病机制对于找寻高效的治疗药物意义重大。
中性粒细胞性气道炎症被认为是哮喘治疗中的一个重要问题, 常伴有进行性肺功能下降、皮质类固醇耐药进而加重哮喘, 先前的研究表明, 在严重哮喘进展过程中, 患者IL-6、TNF-α和IL-17水平升高可能导致中性粒细胞炎症[13-14]。本研究通过脂多糖联合卵清蛋白共同制备中性粒细胞性哮喘小鼠模型, 结果显示小鼠呼气间歇值明显增加, 炎性细胞如中性粒细胞、IL-6、IL-17、TNF-α水平增加, HE及PAS染色结果表明, 小鼠炎性细胞浸润及气道黏液分泌明显增加, 提示气道炎症与中性粒细胞性哮喘的发展密切相关。TPG是一种天然活性皂苷, 从传统中药芍药提取得到, 具有神经系统保护、护肝、抗炎以及免疫调节等作用, 药物不良反应较少[15]。在炎症性关节炎中[16], TPG可减轻尿酸钠介导的炎症反应, 是治疗关节炎的有效成分。胡姮等[8]研究表明在烟熏和脂多糖建立的慢性阻塞性肺疾病中, TPG可通过减轻IL-6、TNF-α等炎性水平保护大鼠肺组织。本研究同样发现TPG干预后, 降低中性粒细胞性哮喘小鼠呼气间歇值, 减轻炎性水平及气道黏液分泌, 改善小鼠肺组织损伤, 提示TPG可能用于治疗中性粒细胞性哮喘。
AMPK是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 参与调节能量代谢, AMPK可以激活Sirt1在多种炎性反应相关的疾病中发挥保护作用[17], Sirt1是sirtuin家族的成员之一, 在哮喘炎症进展中发挥重要的抗炎作用[18]。先前研究表明药物在缓解哮喘中的机制与AMPK/Sirt1信号通路抑制炎症反应有关[19-20]。本研究同样发现中性粒细胞性哮喘小鼠中p-AMPK/AMPK、Sirt1表达降低, 气道炎症显著, 小鼠出现严重肺组织损伤, 提示中性粒细胞性哮喘的发生与AMPK/Sirt1信号通路介导的炎症反应有关。但经TPG干预后, 小鼠肺组织中p-AMPK/AMPK、Sirt1蛋白表达上调, 减轻了气道炎症及肺组织病理损伤, 提示TPG减轻中性粒细胞性哮喘小鼠的气道炎症, 可能与激活AMPK/Sirt1信号通路有关。实验最后以AMPK/Sirt1通路-抑制剂进行验证, 结果发现抑制剂下调p-AMPK/AMPK、Sirt1表达, 逆转了TPG对中性粒细胞性哮喘小鼠的保护作用, 表明TPG可能通过激活AMPK/Sirt1信号通路减轻中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症。
综上所述, TPG减轻了中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症, 可能与激活AMPK/Sirt1信号通路有关, 进而对肺组织发挥保护作用, 为临床治疗哮喘提供方向。
| [1] |
LU H N, FU Z, CHEN X, et al. Shegan Mahuang Decoction may reduce airway inflammation in neutrophilic asthmatic mice by improving the mitochondrial function of bronchoalveolar lavage fluid exosomes[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2022, 2022: 2477510. |
| [2] |
齐莎莎, 吕民英, 付晓梅, 等. 鹰嘴豆芽素A通过调节TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路减轻卵清蛋白诱导哮喘大鼠的气道炎症[J]. 天津中医药, 2023, 40(4): 506-512. |
| [3] |
JIN Y, ZHANG A. Total glucosides of paeony ameliorates oxidative stress, apoptosis and inflammatory response by regulating the Smad7-TGF-β pathway in allergic rhinitis[J]. Molecular Medicine Reports, 2022, 25(3): 83-93. DOI:10.3892/mmr.2022.12599 |
| [4] |
许海江, 欧阳松云, 陈兰兰, 等. 赤芍总苷对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的干预作用[J]. 中国新药与临床杂志, 2022, 41(9): 561-565. |
| [5] |
HAN X A, JIE H Y, WANG J H, et al. Necrostatin-1 ameliorates neutrophilic inflammation in asthma by suppressing MLKL phosphorylation to inhibiting NETs release[J]. Frontiers in Immunology, 2020, 11: 666. DOI:10.3389/fimmu.2020.00666 |
| [6] |
XU C, SONG Y, WANG Z, et al. Pterostilbene suppresses oxidative stress and allergic airway inflammation through AMPK/Sirt1 and Nrf2/HO-1 pathways[J]. Immunity Inflammation and Disease, 2021, 9(4): 1406-1417. DOI:10.1002/iid3.490 |
| [7] |
胡清宇, 吕宗立, 刘文娟. 基于VSIG4/NLRP3炎症复合通路探讨异甘草素对中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症的影响[J]. 中国临床药理学杂志, 2024, 40(6): 869-873. |
| [8] |
胡姮, 邹志红, 张刚成. 赤芍总苷通过NF-κB通路对慢阻肺大鼠肺组织炎症及凋亡的作用研究[J]. 湖北中医药大学学报, 2022, 24(3): 16-20. |
| [9] |
田新磊, 朱珊, 赵文锦, 等. 基于AMPK/SIRT1通路介导的自噬途径研究清肺止咳方治疗急性支气管炎小鼠模型的作用机制[J]. 中药材, 2022, 45(8): 1975-1980. |
| [10] |
IMMORMINO R M, JANIA C M, TILLEY S L, et al. Neuropilin-2 regulates airway inflammation in a neutrophilic asthma model[J]. Immunity Inflammation and Disease, 2022, 10(3): e575. |
| [11] |
QIAO X R, FENG T, ZHANG D, et al. Luteolin alleviated neutrophilic asthma by inhibiting IL-36γ secretion-mediated MAPK pathways[J]. Pharmaceutical Biology, 2023, 61(1): 165-176. |
| [12] |
XU W, WANG Y, MA Y, et al. MiR-223 plays a protecting role in neutrophilic asthmatic mice through the inhibition of NLRP3 inflammasome[J]. Respiratory Research, 2020, 21(1): 116-128. |
| [13] |
BAI F, CHEN Z, XU S, et al. Wogonin attenuates neutrophilic inflammation and airway smooth muscle proliferation through inducing caspase-dependent apoptosis and inhibiting MAPK/Akt signaling in allergic airways[J]. International Immunopharmacology, 2022, 113(Pt B): 109410. |
| [14] |
HANASHIRO J, MURAOSA Y, TOYOTOME T, et al. Schizophyllum commune induces IL-17-mediated neutrophilic airway inflammation in OVA-induced asthma model mice[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1): 19321-19329. |
| [15] |
SU L, LU H, ZHANG D, et al. Total paeony glycoside relieves neuroinflammation to exert antidepressant effect via the interplay between NLRP3 inflammasome, pyroptosis and autophagy[J]. Phytome- dicine, 2024, 128: 155519. |
| [16] |
MENG Q, MENG W, BIAN H, et al. Total glucosides of paeony protects THP-1 macrophages against monosodium urate-induced inflammation via MALAT1/miR-876-5p/NLRP3 signaling cascade in gouty arthritis[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2021, 138: 111413. |
| [17] |
WANG X D, YU W L, SUN Y. Activation of AMPK restored impaired autophagy and inhibited inflammation reaction by up-regulating SIRT1 in acute pancreatitis[J]. Life Sciences, 2021, 277: 119435. |
| [18] |
孙毅, 任亚平, 孔乔, 等. 五味子哮喘汤对哮喘小鼠SIRT1/Akt信号通路及肺功能的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2021, 37(3): 481-486. |
| [19] |
WANG C, CHOI Y H, XIAN Z, et al. Aloperine suppresses allergic airway inflammation through NF-κB, MAPK, and Nrf2/HO-1 signaling pathways in mice[J]. International Immunopharmacology, 2018, 65(1): 571-579. |
| [20] |
魏晶, 王青筠, 王颖, 等. 白藜芦醇抑制哮喘幼鼠肺组织Sirt1与AMPK的表达[J]. 解剖科学进展, 2018, 24(6): 573-576. |