天津中医药  2025, Vol. 42 Issue (7): 885-895

文章信息

杜群群, 王小兰, 郑小玲, 等.
DU Qunqun, WANG Xiaolan, ZHENG Xiaoling, et al.
基于UPLC-Q-TOF/MS探究玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎的潜在作用机制
Study on potential action mechanism of Yupingfeng teabags in treatment of Hashintoto's thyroditis based on UPLC-Q-TOF/MS
天津中医药, 2025, 42(7): 885-895
Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(7): 885-895
http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.07.12

文章历史

收稿日期: 2005-03-14
基于UPLC-Q-TOF/MS探究玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎的潜在作用机制
杜群群1,2,3 , 王小兰1 , 郑小玲1 , 张永涛1 , 何风雷1 , 覃仁安1 , 张莹3     
1. 广州白云山陈李济药厂有限公司研发中心, 广州 510515;
2. 广州医药集团有限公司, 广州 510515;
3. 广州医科大学附属第三医院, 广州 510515
摘要:[目的] 通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)与网络药理学探讨玉屏风袋泡茶对桥本甲状腺炎的药效物质基础和作用机制。[方法] 采用UPLC-Q-TOF/MS定性分析玉屏风袋泡茶的化学成分,网络药理学预测玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎潜在靶点,通过动物实验验证玉屏风袋泡茶对桥本甲状腺炎的治疗作用。[结果] 共分析出75个化学成分。网络药理学结果显示,玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎可能与钙离子信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、Rap1信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等有关。动物实验结果显示,玉屏风袋泡茶可以显著降低桥本甲状腺炎模型小鼠的抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、促甲状腺素(TSH)水平,显著升高游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)水平,维持甲状腺激素及抗体的稳定,保护甲状腺组织内滤泡细胞完整性减少淋巴细胞浸润,降低甲状腺组织IL-17、VEGF、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达。[结论] 采用UPLC-Q-TOF/MS技术,探究玉屏风袋泡茶的药效物质基础,并结合网络药理学和实验验证探究其治疗桥本甲状腺炎潜在作用机制,初步为玉屏风袋泡茶进一步开发利用提供参考依据。
关键词成分分析    网络药理学    作用机制    桥本甲状腺炎    玉屏风袋泡茶    

开放科学(资源服务)标识码(OSID):

桥本甲状腺炎(HT)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎,是自身免疫性甲状腺炎(AIT)的一个类型,起病隐匿,病程较长,以无痛性、弥漫性甲状腺肿大、甲状腺自身抗体阳性为特征,是最常见的自身免疫性疾病之一[1]。随着HT病程发展最终引起原发性甲状腺功能减退症,严重影响患者身心健康[2]。尽管确切的病因尚未完全阐明,但HT的发病与遗传因素、环境因素和表观遗传影响之间的相互作用有关。HT的治疗以控制病程发生发展为主,包括口服合成激素左旋甲状腺素(L-T4)、糖皮质激素泼尼松龙、补充硒元素等,但是长期服用易引发焦虑、失眠、心悸、心动过速、食欲增加等方面的不良反应[3-5]

中医无HT的病名记载,根据HT的临床表现,可以将HT归属为中医“瘿瘤”“肉瘿”“气瘿”或“石瘿”范畴,对该疾病治疗有一定的经验。有研究者运用玉屏风相关制剂及加减方或加载其他药物对HT进行临床研究,结果显示玉屏风相关制剂及其加减方或加载其他药物对HT患者的激素、抗体水平及中医证候有一定的改善作用,且安全性较高[6-8]。目前2020版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)收载的玉屏风相关制剂有颗粒、胶囊、口服液,袋泡茶等剂型,其中“玉屏风袋泡茶”生产工艺有别于其他剂型(表 1)。前期团队成员开展了“单中心、前瞻性、开放性、随机对照——不同治疗方案对桥本甲状腺炎的治疗效果观察”临床研究(中国临床试验注册: ChiCTR2200058158),其目的是比较玉屏风袋泡茶与硒酵母片对该部分患者的疗效,为患者提供一种新的用药选择。玉屏风袋泡茶(国药准字Z440021060)已上市多年,传承原“玉屏散”精华,具有益气,固表,止汗,用于表虚不固,自汗恶风,面色㿠白,或体虚易感风邪者,属于甲类OTC药品。目前还未有报道“玉屏风袋泡茶对桥本甲状腺炎治疗作用的有效性研究”,其药效物质及作用机制尚不明确。因此,本项研究拟采用UPLC-Q-TOF/MS和网络药理学方法探究玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎的潜在药效物质成分及作用机制,并通过动物实验进行初步验证其作用靶点,为后续进一步研究及临床应用提供理论依据。

表 1 目前玉屏风相关制剂工艺对比 Tab. 1 Comparison of current Yupingfeng related formulation processes
剂型 工艺 辅料 执行标准
袋泡茶 白术粉碎与黄芪、防风水提浓缩 可溶性淀粉、甜叶菊 2020版《中国药典》
颗粒 防风与黄芪、白术一起水提醇沉 糊精、甘露醇、矫味剂、黏合剂 2020版《中国药典》
口服液 防风与黄芪、白术一起水提醇沉 蔗糖 2020版《中国药典》
胶囊 防风与黄芪、白术一起水提醇沉 2020版《中国药典》
1 材料 1.1 实验动物

SPF级4~5周NOD雌性小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证为SCXK(京)2019-0008,体质量18~20 g,(24±2)℃、12 h照明/12 h黑暗明暗交替条件下饲养,动物自由获取水和食物。动物实验伦理批件号IA-PD2022008-01。

1.2 主要药物及试剂

甲醇(色谱纯,Rhawn,批号R007544-4L);乙腈(色谱纯,MACKLIN,批号A801556-4L);甲酸(色谱纯,MACKLIN,批号F809715-100 mL);玉屏风袋泡茶(广州白云山陈李济药厂有限公司,批号B76001)、黄芪、白术、防风(东莞星康大药房,批号分别是2011001、2107001、2004001);优甲乐(左甲状腺素钠片,LT4,默克公司,批号255763);抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(南京博研生物,BY-EM222042);抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)ELISA试剂盒(南京博研生物,BY-EM220438);促甲状腺素(TSH)ELISA试剂盒(酶免生物科技有限公司,MM-0564M1);游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)ELISA试剂盒(酶免生物科技有限公司,MM-45652M1);游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)ELISA试剂盒(酶免生物科技有限公司,MM-0576M1);白细胞介素-17(IL-17)抗体、血管内皮生长因子(VEGF)抗体、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体[Cell Signaling Technology(CST)公司]。

1.3 主要仪器

电子天平(北京赛多利,BS224S);全自动血液分析仪(日本,Sysmex 2000iv);可见分光光度计(上海现科,722);脱水机(德国Leica,ASP300S);石蜡包埋机(德国Leica,EG1160);轮转式切片机(德国Leica,RM2235);摊片机(德国Leica,HI1210);图像采集头(日本OLYMPUS,DP71/DP73)、全自动染色/封片工作站(日本OLYMPUS,ST5020/CV5030);超高效液相(日本Nexera,X2 Shimadzu);四极杆飞行时间质谱(美国AB SCIEX,TripleTOFTM5600)。

2 方法 2.1 玉屏风袋泡茶成分分析 2.1.1 样本溶液制备

精密称取黄芪、白术、防风1 g以及玉屏风袋泡茶浸泡液0.5 mL(取适量袋泡茶,按料液比6∶200加入开水浸泡15 min,然后在60 ℃条件下减压浓缩浸泡液,至1 mL等于1 g玉屏风袋泡茶产品量),加50%甲醇(50%,V/V)10 mL,称定质量;超声处理30 min,用50%甲醇补足所失质量;以12 000 r/min离心(离心半径10 cm)15 min后取上清,过0.22 μm微孔滤膜,即得药材黄芪、白术、防风和玉屏风袋泡茶供试品溶液。

2.1.2 液相色谱和质谱条件

色谱条件: 色谱分离采用Nexera X2 Shimadzu超高效液相系统,色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18(1.7 μm,200 mm×2.1 mm),流动相由(A相)0.1%甲酸水溶液和(B相)0.1%甲酸乙腈溶液组成,梯度洗脱程序为: 0~0.5 min,5% B;0.5~5.0 min,5%~10% B;5.0~10.0 min,10%~25% B;10.0~18.0 min,25%~35% B;18.0~20.0 min,35%~80% B;20.0~20.5 min,80%~95% B;20.5~28.0 min,95% B;流速0.3 mL/min,柱温40 ℃,进样量2 μL。

质谱条件: 数据的采集使用AB SCIEX 5600+Triple TOF四极杆飞行时间质谱仪,离子源为电喷雾离子源(ESI),并在正(POS)、负(NEG)离子模式下进行全扫描分析。数据采集母离子质荷比扫描范围m/z 100~1200,子离子m/z 50~1200。POS模式下优化后的质谱参数为: 毛细管喷雾电压5.5 kV;涡轮喷雾温度,500 ℃;雾化气,50 L/min;加热气,50 L/min;气帘气,35 L/min。优化后的去簇电压、碰撞能量和碰撞能间隔分别设置为80 V、35 eV、15 eV。NEG模式下毛细管喷雾电压、去簇电压和碰撞能量分别设置为-4.5 kV、-80 V和-35 eV,其他参数同POS模式。使用在线自动校准系统(CDS)进行MS和MS/MS对质谱进行调谐与校正。

2.2 网络药理学研究 2.2.1 数据准备

SwissTargetsPrediction(http://swisstargetprediction.ch/)数据库搜集“2.1.2”鉴别的化学成分相关作用靶点;GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、DisGeNet(https://disgenet.com/)数据库,以“Hashimoto Thyroiditis”为关键词搜集相关靶点。

2.2.2 交集靶点筛选及PPI网络的构建

分别将玉屏风袋泡茶和桥本甲状腺炎相关靶点导入R语言(4.3.2),利用“ggvenn”语言包挖掘共有靶点,并上传至String(https://cn.string-db.org/)数据库,将筛选条件设置为“Homo sapiens”,构建蛋白-蛋白互作(PPI)网络,导入Cytoscape(3.10.1)分析网络核心靶点并进行可视化。

2.2.3 共有靶点GO与KEGG富集分析

利用R语言“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“ggplot2”等语言包对共有靶点进行GO与KEGG富集分析,搜集“玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎”潜在的信号通路,设置筛选条件为P<0.05。

2.3 动物实验研究 2.3.1 动物模型的建立

对4~5周龄NOD雌性小鼠饲喂0.05%NaI溶液,共12周。后随机选取一定比例造模小鼠取血清检测TPOAb和TSH水平,并进行甲状腺组织病理检测,以甲状腺内淋巴细胞浸润的面积与整个腺面积的比值>2%的小鼠相对占比不低于80%,且与空白对照组相比TPOAb、TGAb抗体显著升高,TSH水平显著升高,且FT3、FT4水平显著降低,即为造模成功;空白对照组给予等量正常饮用水。

2.3.2 分组及给药

玉屏风袋泡茶处理: 取适量袋泡茶,按料液比6∶200加入开水浸泡15 min,然后在60 ℃条件下减压浓缩浸泡液,至1 mL等于1 g玉屏风袋泡茶产品量。玉屏风袋泡茶剂量设计: 成人日服用量6 g/次,每日1次,人体体质量按照70 kg计算,根据人与小鼠剂量转换系数折算小鼠剂量为0.78 g/kg。

造模成功后,将造模小鼠随机分为模型组、阳性对照组(优甲乐)、玉屏风袋泡茶低、中、高剂量治疗组,每组12只。阳性药对照组(优甲乐)给药剂量为: 6.5 μg/kg灌胃。玉屏风袋泡茶低、中、高剂量组给药剂量分别为: 0.39、0.78、1.56 g/kg灌胃。模型组与空白对照组给予等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续12周。

2.3.3 指标测定 2.3.3.1 ELISA检测血清中TPOAb、TGAb、TSH、FT3、FT4含量

末次给药后,对小鼠进行眼眶取血,采用ELISA检测TGAb、TPOAb、TSH、FT3、FT4,操作步骤按试剂盒说明书。

2.3.3.2 甲状腺组织苏木精-伊红(HE)染色

取血后,将小鼠甲状腺组织固定于4%多聚甲醛中,后用石蜡包埋,进行甲状腺组织切片和HE染色,观察各组小鼠甲状腺组织病理状况。

2.3.3.3 甲状腺组织免疫组化检测

将组织切片用磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST)洗涤后加入山羊血清室温下封闭,除去封闭液后分别加入一抗IL-17、VEGF、TNF-α(1∶200)4 ℃下过夜。PBST将切片洗涤3次,每次5 min,加入二抗室温下孵育40 min,重复上述洗涤操作。加入DAB显色液3 min后,用水冲洗10 min,苏木精复染切片2 min,再用水冲洗10 min。经一系列浓度乙醇脱水后封片。

2.3.4 统计学方法

所有数据以均数±标准差(x±s)表示,数据采用统计软件SPSS 25.0进行分析,组间比较采用单因素方差分析(analysis of variance ANOVA),使用LSD-t检验进行多重比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 化学成分研究结果

玉屏风袋泡茶采用传统工艺水提(黄芪、防风)与粉碎(白术)制备而成,基本保留原药的有效成分,为了鉴别玉屏风袋泡茶中的成分归属,将黄芪、白术、防风按统一方法进行处理并分析,黄芪、白术、防风、玉屏风袋泡茶在正负离子模式下的总离子流图见图 1。通过文献和数据库(TCMSP、BATMAN-TCM、naturalprocducts HR-MSMS2.0等),搜集玉屏风方中单味药所含的化合物的中英文名称、分子式、精确分子量、一级和二级质谱图等信息,建立方中化学成分数据库。样品进样后以目标式查找,在满足质量偏差≤5,同位素丰度比≤5,数据库匹配得分≥90的基础上,与数据库中的化合物准分子离子峰、碎片裂解规律进行对比分析,初步确认化合物,结果共鉴别玉屏风袋泡茶中75个化合物,其中30个来源于黄芪,19个源自白术,18个源自防风,2个源自甜叶菊(辅料),5个来源于黄芪或白术或防风,还有1个未确定归属。玉屏风袋泡茶所含化合物成分主体是有机酸、黄酮类、萘醌和苯并呋喃类等,其主体结构信息见图 2,玉屏风袋泡茶化合物信息见开放科学OSID标识码。

注:HQ,黄芪;BZ,白术;FF,防风;YPF,玉屏风袋泡茶。 图 1 玉屏风袋泡茶及药材在正(A)、负离子(B)模式下的总离子流图 Fig. 1 Total ion flux diagram of Yupingfeng teabags and medicinal herbs in positive(A)and negative(B)ion modes
图 2 初步鉴定玉屏风袋泡茶中主体成分结构 Fig. 2 Preliminary identification of the main component structure in Yupingfeng teabags
3.2 网络药理学研究结果 3.2.1 玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎潜在靶点的挖掘

用SwissTargetsPrediction(http://swisstargetprediction.ch/)数据库收集玉屏风袋泡茶“3.1化学成分”相关作用靶点,以“Hashintoto’s thyroditis”为关键词在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、DisGeNet(https://disgenet.com/)搜索HT的靶点,去重后共有3 667个,将两者导入R语言利用“ggvenn”包挖掘后发现共有靶点319个,见图 3

图 3 靶点韦恩图 Fig. 3 Target Venn diagram

将交集靶点导入STRING(https://cn.string-db.org/)数据库,将筛选条件设置为“Homo sapiens”,构建蛋白-蛋白互作(PPI)网络,设置置信值>0.4,删除无相互作用靶点,导入Cytoscape(3.10.1)分析。如图 4所示,该网络包含319个节点,890条边。利用Cytoscape建立“药物-成分-共有靶点”可视化并分析网络核心靶点,发现细胞色素P450 19A1(CYP19A1)、基质金属蛋白酶(MMPs)[基质金属蛋白酶1(MMP1),基质金属蛋白酶2(MMP2),基质金属蛋白酶9(MMP9)等]、早老素2(PSEN2)、血管内皮生长因子A(VEGFA)等靶点位于网络的核心,有可能是玉屏风袋泡茶有效物质治疗HT的关键靶点。玉屏风袋泡茶由黄芪、白术、防风组成,其中黄芪主要活性成分是黄酮类化合物和黄芪皂苷等(见开放科学OSID标识码)中Astragaloside V/Ⅵ/Ⅶ,有研究表明该成分可能通过抑制VEGFA和MMPs等的表达,发挥抗炎、抗氧化及免疫调节的作用[9],而在多种慢性和自身免疫性疾病中,MMPs(尤其是MMP9)在IL-17介导的炎症过程中发挥着重要作用[10-11]。有研究指出,MMP9可能通过免疫和氧化应激反应相关的信号通路对HT发挥关键作用,MMP9与TGAb的相关性最高,与炎症浸润评分呈正相关[12],由此可以推测玉屏风袋泡茶中的黄酮类化合物和黄芪皂苷等通过抑制MMPs表达,抑制特异性抗体TGAb分泌,抑制甲状腺炎症浸润。白术含有白术内酯类化合物(见开放科学OSID标识码)中Atractylenolide Ⅰ等,具有抗炎、抗氧化作用,且能显著抑制VEGFA表达[13]。研究表明,VEGFA在桥本甲状腺炎中表达水平升高,因其可以促进炎症区域的血管新生,活化核因子-κB(NF-κB)信号通路,使炎症因子如TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)等释放[14],从而加剧疾病进展,VEGFA可能是HT中一个关键疾病特征[15]。由此可以推测玉屏风袋泡茶中的白术内酯类化合物可能通过抑制VEGFA表达,缓解HT的病程。防风含有Scopoletin等成分(见开放科学OSID标识码),该成分具有抗炎、免疫调节等作用,有研究表明Scopoletin可抑制NF-κB活化,调节免疫细胞功能和炎症反应[16]。在炎症状态下,体内的炎症因子可能会作用于表达CYP19A1的细胞,使CYP19A1的活性增加,进而促进雌激素的合成[17],CYP19A1是雌激素合成的关键酶,而雌激素水平异常与自身免疫性甲状腺疾病(如HT)的性别差异密切相关。由此可以推测,玉屏风袋泡茶中Scopoletin成分可能通过调控下调CYP19A1表达,减少雌激素生成,调节免疫细胞T分化与促炎症分子释放,从而缓解HT进展。

注:图A,玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎PPI网络;图B,PPI网络可视化,橙色箭头代表中药(HQ,黄芪;BZ,白术;FF,防风),黄色圆形代表药物有效成分,绿色菱形代表“药物-疾病”共有靶点。 图 4 玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎潜在靶点PPI网络图 Fig. 4 PPI network diagram of potential targets in the treatment of Hashimoto's thyroiditis with Yupingfeng teabags
3.2.2 GO与KEGG富集分析

利用R语言“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“ggplot2”等对交集靶点进行GO与KEGG富集分析,设置筛选条件为P<0.05,按照degree值排序,选用前50个共有靶点进行GO、KEGG富集分析,探究玉屏风袋泡茶治疗桥本甲状腺炎的潜在机制。见图 5

注:图A,GO富集分析(BP、CC、MF);图B,KEGG信号通路富集分析。 图 5 GO与KEGG富集分析 Fig. 5 GO and KEGG enrichment analysis

KEGG信号通路主要富集在: Calcium signaling pathway、Estrogen signaling pathway、VEGF signaling pathway、Rap1 signaling pathway、IL-17 signaling pathway、MAPK signaling pathway等。

3.3 动物实验研究结果 3.3.1 ELISA检测小鼠血清中TPOAb、TGAb、TSH、FT3、FT4含量

表 2所示,与空白对照组相比,模型组小鼠血清中TPOAb、TGAb、TSH的浓度滴度显著升高,FT3、FT4的水平显著降低;与模型组相比,阳性药对照组的TPOAb、TGAb无显著性差异,TSH的浓度滴度显著降低,FT3、FT4的水平显著升高;玉屏风袋泡茶各剂量给药组的TPOAb、TGAb、TSH的浓度滴度显著降低,FT3、FT4的水平显著升高,且玉屏风袋泡茶中、高剂量治疗效果与阳性对照药治疗效果相当。随着剂量增加,玉屏风袋泡不仅改善桥本甲状腺炎小鼠甲状腺激素水平,而且还能降低甲状腺自身抗体滴度,且呈现剂量依赖性作用,表明玉屏风袋泡茶对桥本甲状腺炎具有良好的治疗效果。

表 2 各组小鼠血清TPOAb、TGAb、TSH、FT3、FT4比较(x±s Tab. 2 Comparison of serum TPOAb, TGAb, TSH, FT3, FT4 of mice in each group(x±s)
组别 动物数 FT3(pg/mL) FT4(pg/mL) TSH(pg/mL) TPOAb(U/mL) TGAb(U/mL)
空白对照组 12 12.11±1.24 10.56±1.05 28.25±3.18 4.13±0.19 5.35±0.23
模型组 12 4.07±1.56** 5.04±1.09** 56.56±3.60*** 9.24±1.66** 11.78±1.32**
阳性药对照组 12 9.24±1.20## 8.77±1.36## 31.22±2.88## 8.73±1.01 9.41±4.43
玉屏风袋泡茶低剂量组 12 6.69±1.48# 7.02±1.33# 43.71±2.59# 6.94±1.22# 9.27±1.86
玉屏风袋泡茶中剂量组 12 8.02±1.17# 8.16±2.29# 39.41±4.97## 6.27±1.83## 6.85±1.22#
玉屏风袋泡茶高剂量组 12 9.09±1.81## 8.83±1.01## 36.09±3.24## 5.53±1.11## 6.73±1.49#
注:与空白对照组比,**P<0.01,***P<0.001;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01。
3.3.2 甲状腺组织HE染色

图 6所示,空白对照组可见大量完整的甲状腺滤泡,且形状规则,大小适中,腔内胶质充盈,间隙炎性浸润较少。模型组甲状腺滤泡形状多不规则,滤泡壁变薄或被破坏,大多滤泡腔破损或变小,其中腔内胶质含量明显减少,且滤泡间隙存在淋巴细胞浸润。玉屏风袋泡茶低、中、高组与模型组相比,甲状腺淋巴细胞浸润的病变程度有改善趋势;随着剂量增加,玉屏风袋泡对甲状腺淋巴细胞浸润的改善呈剂量依赖性作用。

图 6 玉屏风袋泡茶对HT小鼠甲状腺组织病理变化的影响(×200,n=9) Fig. 6 The effect of Yupingfeng teabags on the pathological changes of thyroid tissue in mice with Hashimoto's thyroiditis(×200, n=9)
3.3.3 各组小鼠甲状腺组织IL-17、VEGF、TNF-α免疫组化分析

图 7A-C所示,利用免疫组化染色观察小鼠甲状腺的IL-17、VEGF、TNF-α的表达,与空白对照组相比,模型组小鼠甲状腺组织中IL-17、VEGF、TNF-α的表达增加;与模型组相比,玉屏风袋泡茶各给药组小鼠甲状腺组织中IL-17、VEGF、TNF-α的表达均有所降低。

注:图A,白细胞介素-17(IL-17);图B,血管内皮生长因子(VEGF);图C,肿瘤坏死因子α(TNF-α)。 图 7 各组小鼠甲状腺组织免疫组化染色结果(×200) Fig. 7 Immunohistochemical staining results of thyroid tissue of mice in each group(×200)

将各组小鼠甲状腺组织IL-17、VEGF、TNF-α表达进行半定量量化,如表 3结果显示,与空白对照组相比,模型组小鼠甲状腺组织中的IL-17、VEGF、TNF-α表达均显著增多(P<0.001);HT模型小鼠给予玉屏风袋泡茶后,不同剂量组的小鼠甲状腺组织中的IL-17、VEGF、TNF-α表达显著减少(P<0.05或P<0.01),随着剂量增加,IL-17、VEGF、TNF-α表达逐渐减少。

表 3 各组小鼠甲状腺组织IL-17、VEGF、TNF-α免疫组化半定量结果(x±s Tab. 3 Semi quantitative immunohistochemical results of IL-17, VEGF, TNF-α in thyroid tissue of mice in each group(x±s)
组别 动物数 IL-17 VEGF TNF-α
空白对照组 9 91.05±13.54 100.00±20.13 100.00±13.33
模型组 9 178.65±15.72*** 160.39±21.54*** 194.35±22.55***
阳性药对照组 9 145.07±25.86# 140.67±19.36# 135.25±20.14##
玉屏风袋泡茶低剂量组 9 148.37±18.96# 142.72±12.63# 149.58±35.92#
玉屏风袋泡茶中剂量组 9 136.52±20.16## 129.66±21.32## 136.02±12.70##
玉屏风袋泡茶高剂量组 9 130.74±15.39## 126.35±17.97## 135.84±24.94##
注:与空白对照组比,***P<0.001;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01。
4 讨论

中医认为HT的病机在于气虚、气滞、痰凝、血瘀,属于本虚标实之病。HT患者虽然临床病程各异,临床表现复杂多样,但无论处于何种阶段,均有不同程度的气虚表现(乏力和代谢机能降低)。正气亏虚贯穿于其发生发展的全部过程,其病因为元气不足(气虚),无力抵抗外邪入侵而发为本病,外邪在体内无正气与之抗衡,因而短期之内邪气已盛,进一步耗伤正气,致气虚更甚引起痰湿、瘀血等病理产物(免疫复合物)壅结颈前而发病[18]。对于本虚(气)证,临床上常用的经方—“玉屏风散”,方中黄芪甘温,归脾、肺经,具补气升阳,益气固表,利水消肿等功效。脾气虚,则倦怠乏力,常配白术,以补气健脾,脾旺则土生金,肺气足则卫实固表;白术甘苦而温,入脾、胃经,健脾要药,增强黄芪培土生金,固表止汗之力,两药共用,既可以温补脾胃,使气血化生有源;又补肺气而充实肌表,使营血循其常道,气旺表实,汗不外泄,邪不内侵。防风甘温而不燥,性缓和,为“风药之润剂”,以少量防风走表而祛风,并与黄芪相伍,黄芪得防风,则固表而不留邪;防风得黄芪,祛邪而不伤正,两药相伍,祛风而不伤表,腠理密而不留邪。三药合用,补中有疏,散中兼收,共凑益气固表,扶正祛邪之功。

前述文献报道玉屏风相关制剂及其加减方或加载其他药物对HT治疗表现出良好的疗效,而玉屏风袋泡茶是唯一有别其他现代玉屏风制剂制备工艺的产品,采用传统工艺水提、粉碎制备而成,传承“原散剂精华”,是已上市甲类OTC药品,由黄芪、白术、防风和辅料甜叶菊组成,具有益气,固表,止汗,用于表虚不固,自汗恶风,面色㿠白,或体虚易感风邪者。由于该制剂属于多成分中药复方,缺少相关数据及理论支撑玉屏风袋泡茶是否对HT有效,笔者研究团队在开展“玉屏风袋泡茶对HT治疗”临床试验的同时,按照“药效物质基础-有效性-作用机制”思路,采用UPLC-Q-TOF/MS技术分析玉屏风袋泡茶所含的物质成分,将解析的物质成分结合网络药理学预测玉屏风袋泡茶对HT治疗的作用靶点及通路,并通过动物药效学评价玉屏风袋泡茶对HT的有效性及作用靶点。玉屏风袋泡茶采用传统工艺(水提和粉碎)制备而成,极大保留原药材的成分,为了更好确认玉屏风袋泡茶中的成分信息,本研究将原药材和玉屏风袋泡茶采用同样方法通过UPLC-Q-TOF/MS解析、数据库对比及文献分析初步鉴定了玉屏风袋泡茶中的75个化合物信息,对其进行归属,其中30个来源于黄芪,19个源自白术,18个源自防风,2个源自甜叶菊(辅料),5个来源于黄芪或白术或防风,还有1个未确定归属。运用网络药理学分构建了初步解析的玉屏风袋泡茶物质成分治疗HT的“药物-成分-靶点”网络图和核心靶点互作图,玉屏风袋泡茶中的黄芪皂苷如Astragaloside Ⅴ/Ⅵ/Ⅶ、白术内酯类如Atractylenolide Ⅰ、Scopoletin等成分可能作用CYP19A1、MMPs(MMP1、MMP2、MMP9等)、PSEN2、VEGFA等核心靶点,通过钙离子信号通路、VEGF信号通路、Rap1信号通路、IL-17信号通路以及MAPK信号通路等发挥治疗HT的作用。动物实验结果表明,玉屏风袋泡茶不仅能改善HT小鼠甲状腺激素水平,还能降低甲状腺自身抗体滴度,维持小鼠甲状腺生理功能稳定,表明其对HT具有良好的治疗作用,甲状腺组织中的IL-17、VEGF、TNF-α表达均降低。其中IL-17是一种多用途的促炎症细胞因子,是宿主免疫防御、组织修复、炎症性疾病发病机制等重要过程所必需的,有研究表明IL-17信号通路可能是多种药物治疗自身免疫性甲状腺炎的关键通路之一[19-20]。VEGF受体存在于甲状腺上皮细胞中,是甲状腺上皮的关键调节因子,HT患者的VEGF与促甲状腺激素水平呈相关性,甲状腺治疗后VEGF水平降低[21-22]。由此可以表明,玉屏风袋泡茶作为传统工艺制备的中药,通过“多成分、多通路、多靶点”发挥免疫调节、抗炎等作用从而治疗HT。

同时本研究也存在一些不足。其一,玉屏风袋泡茶通过“水提、粉碎”制备而成,所用的药材(黄芪、白术、防风)均为根茎类植物,含有丰富的“糖类”成分,该成分对免疫、炎症调节具有重要作用,本研究初步鉴定了玉屏风袋泡茶中的成分,后续可通过多种方法相结合对产品中的“单糖”“多糖”等糖类成分进行鉴别研究,并通过化合物标准品确证成分。其二,已有报道玉屏风相关制剂及其加减方或加载其他药物对HT治疗有良好的作用,本研究缺少玉屏风袋泡茶与同名产品疗效的对比,后续可通过增加动物实验组别,进一步判定玉屏风袋泡茶治疗HT的优势。其三,HT作为一种多因素疾病,治疗效果受到遗传、环境、生活习惯等多种因素影响,本研究采用高碘饲养方式诱导HT模型,方法单一,作用靶点选取了网络药理学预测的通路靶点,后续研究需通过动物实验、细胞实验以及靶点抑制、过表达等方法,以期全面地研究玉屏风袋泡茶治疗HT的作用机制。本研究结果发现,玉屏风袋泡茶作为特有工艺的产品对HT有良好的治疗作用,为后期深度研究及临床合理应用奠定了基础,他为HT患者提供一种新的有效药物。

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Study on potential action mechanism of Yupingfeng teabags in treatment of Hashintoto's thyroditis based on UPLC-Q-TOF/MS
DU Qunqun1,2,3 , WANG Xiaolan1 , ZHENG Xiaoling1 , ZHANG Yongtao1 , HE Fenglei1 , QIN Renan1 , ZHANG Ying3     
1. Research and Development Centre, Guangzhou Baiyunshan Chenliji Parmaceutical Co., Ltd., Guangzhou 510515, China;
2. Guangzhou Parmaceutical Holddings Limited, Guangzhou 510515, China;
3. The Third Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510515, China
Abstract: [Objective] To explore the regulatory mechanism of Yupingfeng teabags in treatment of Hashintoto's thyroditis through UPLC-Q-TOF/MS and network pharmacology. [Methods] UPLC-Q-TOF/MS was used to qualitatively analyze the chemical components of Yupingfeng teabags. Network pharmacology was used to predict the potential targets of Yupingfeng teabags in treatment of Hashintoto's thyroditis. And animal experiments were used to verify the therapeutic effect of Yupingfeng teabags on Hashintoto's thyroditis. [Results] Totally 75 compounds were identified. The results of Network pharmacology showed that the effect of Yupingfeng teabags on treatment of Hashintoto's thyroditis might be related to calcium signaling pathway, VEGF signaling pathway, Rap1 signaling pathway, IL-17 signaling pathway, MAPK signaling pathway and other signaling pathways. Animal experiments showed that Yupingfeng teabags significantly reduced the levels of TGAb, TPOAb and TSH in Hashimoto's thyroiditis model mice, increased the levels of FT3 and FT4, and maintained the stability of thyroid hormones and antibodies. Moreover, Yupingfeng teabags protected the integrity of follicular cells in thyroid tissue, and reduced lymphocyte infiltration, and the expression of IL-17, VEGF and TNF-α protein in thyroid tissue. [Conclusion] The pharmacodynamic basis of Yupingfeng teabags is determined by UPLC-Q-TOF/MS. Its potential mechanism for Hashintoto's thyroditis is made clear by being combination with network pharmacology and animal experiments, providing reference for the development and utilization of Yupingfeng teabags.
Key words: component analysis    network pharmacology    mechanism of action    Hashintoto's thyroditis    Yupingfeng teabags