雷公藤甲素（TP）是一种具有免疫抑制、抗风湿、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性及药理学作用的环氧二萜内酯类化合物^[1]。研究表明^[2-3]，TP可用于治疗类风湿性关节炎、白血病、乳腺癌等疾病。但TP在体内消除速率快^[4]、具有全身毒性^[5]、低溶解度^[6]等缺点，限制其在临床上的应用。故如何降低TP在体内的血液清除速率、毒副作用，提高TP的溶解度已成为近年来应用TP治疗的重要研究领域。

雷公藤甲素脂质体（TP-Lip）是一种有效改善TP溶解性^[7]的手段。将TP包裹在脂质体的磷脂双分子层中可以延长TP在体内的半衰期，降低血液清除速率，提高生物利用度；同时还能降低TP对非治疗组织、器官的毒副作用，减少不良反应的发生。包封率的高低是制备TP-Lip的关键，同时也是评价TP-Lip质量的重要指标。TP-Lip处方的细微变化会对包封率产生显著影响。但是仅仅通过常规的正交实验或单因素实验无法反映出不同因素对实验结果的交互影响。

因此，本研究拟通过星点设计-效应面法优化TP-Lip的处方，通过对回归方程的分析，优化TP-Lip的处方参数，并通过对回归方程的拟合以及响应曲面的分析得到TP-Lip制备过程中影响包封率各因素水平的响应值^[8]，为TP-Lip的制备提供理论依据。

1 仪器与材料 1.1 仪器

旋转蒸发仪（N-1210B，日本EYELA公司）；加热磁力搅拌器（IKA-RCT-BASIC S025，德国IKA公司）；超声细胞粉碎机（SCIENTZ-IID，新芝生物科技公司）；场发射透射电镜（FEI-Tecnai-G2-F30，美国FEI公司）；高效液相色谱仪（Agilent-LC，日本Agilent公司）；激光粒度分析仪（Nano ZS型，英国Malvern公司）；高功率超声清洗机（KQ-3200型，昆山超声仪器有限公司）等。

1.2 材料

蛋黄卵磷脂（货号：N01001，上海艾伟拓医药科技有限公司）；胆固醇（货号：CC3561A-25 g，北京酷来博科技有限公司）；TP原料药（货号：BP1411，西安嘉天生物科技有限公司）；氯仿（货号：3981天津市大茂化学试剂厂）；生理盐水（货号：2402222107，石家庄四药有限公司）；TP标准品（货号：B20709-100 mg上海源叶生物科技有限公司）；纤维素透析袋（货号：SP131273-0.5 m上海源叶生物科技有限公司）等。

2 方法与结果 2.1 TP-Lip的制备

采用薄膜分散法制备TP-Lip^[9]：称取TP原料药、胆固醇、蛋黄卵磷脂溶解于一定量的氯仿中，使用旋转蒸发仪除去氯仿直至茄形瓶底部形成一层均匀薄膜，随后加入一定量的生理盐水和小号玻璃珠溶解茄形瓶底部的薄膜。常温水化1 h后置于超声波细胞破碎机中80 W超声15 min，即得TP-Lip。放置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2 TP含量测定方法学考察 2.2.1 色谱条件

色谱条件：色谱柱：Agilent 5 TC-C₁₈（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：水-乙腈（75∶25）；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长：218 nm^[10-12]。

2.2.2 对照品溶液

精密称取TP对照品10.0 mg，加入适量甲醇，超声溶解后于容量瓶中定容至10.0 mL，得到质量浓度为1.0 mg/mL的对照品母液。

2.2.3 空白脂质体溶液

精密量取空白脂质体溶液1.0 mL，置于10.0 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声破乳后定容至刻度线，随后用0.22 μm滤膜过滤，得到空白脂质体破乳溶液。

2.2.4 脂质体溶液

精密量取TP-Lip溶液1.0 mL置于10.0 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声破乳后定容至刻度线，随后用0.22 μm滤膜过滤，得到脂质体破乳溶液。

2.2.5 专属性考察

分别取对照品溶液、脂质体破乳溶液、空白脂质体破乳溶液适量，按照“2.2.1”的色谱条件各进样10 μl进行检测。结果表明TP为单峰且峰型良好。在此条件下，空白脂质体没有干扰峰，表明本法专属性良好。见图 1。

2.2.6 精密度考察

精密量取TP对照品母液，依次稀释为低、中、高（20、40、66.67 μg/mL）3个质量浓度。按照“2.2.1”的色谱条件连续进样6次。计算得到低、中、高3个浓度峰面积的RSD值分别为0.83%、0.35%、0.31%，结果显示仪器精密度良好。

2.2.7 线性关系考察

精密称取“2.2.2”项下对照品母液，依次稀释为4、10、20、40、50、66.67、100 μg/mL的7个质量浓度，按照“2.2.1”色谱条件下以低浓度到高浓度的顺序进样，记录峰面积。以吸收峰的峰面积为纵坐标（Y），TP对照品的浓度为横坐标（X）作图，对结果进行分析，得到线性回归方程Y=18.347X-6.242 1，R²=0.999 9，结果表明TP在4~100 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.8 稳定性实验

精密量取脂质体破乳溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h，按照“2.2.1”的色谱条件进行测定。结果显示峰面积的RSD为0.32 %，表明TP-Lip溶液在24 h内的稳定性良好。

2.2.9 重复性考察

取同一批TP-Lip溶液5份，按照“2.2.4”制备脂质体破乳溶液进行处理，按照“2.2.1”色谱条件下进行进样测定。结果显示TP-Lip峰面积RSD为0.76%，表明重复性良好。

2.2.10 加样回收率考察

精密量取空白脂质体3份，分别加入（低、中、高）TP对照品溶液，混合均匀。按“2.2.3”条件下的方法制备空白脂质体破乳溶液，按“2.2.1”色谱条件下进行进样测定，各连续进样3次。结果得到不同浓度5、20、50 μg/mL平均加样回收率分别为99.0%、103.0%、101.0%。

2.3 滤膜法测定TP-Lip包封率 2.3.1 TP-Lip包封率的测定

采用滤膜法对TP-Lip中的游离药物进行分离，并通过“2.2.1”色谱条件计算TP-Lip的包封率：精密量取1.0 mL脂质体溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤，精密吸取过滤后的脂质体溶液0.5 mL，加入4.5 mL甲醇，超声20 min破乳，破乳后经HPLC测定其中的药物含量记为C_包，另取未过膜的脂质体溶液1.0 mL，同样方法处理并测定药物含量记为C_总，采用下述公式计算TP-Lip的包封率^[13-15]。包封率（%）= C_包/C_总×100%。

2.3.2 滤膜法分离效果的考察

按“2.1”的制备方法制备两份TP-Lip混悬液，第1份加入等处方量的TP原料药后超声混匀，第2份不做任何处理。两份脂质体混悬液各取一定量按照“2.3.1”中的滤膜法过滤及破乳操作，随后按照“2.2.1”色谱条件测定。结果显示，第2份含量为（49.804±0.226）μg/mL（n≥3），第1份含量为（52.301±0.071）μg/mL（n≥3）。游离药物加样回收率为4.78%（＜5%）。上述结果表明加入的处方量的TP原料药能被0.22 μm滤膜有效截留，证明滤膜法能够有效分离游离药物与脂质体^[16]。

2.4 TP-Lip单因素实验

根据相关文献^[17-18]及前期实验结果，对制备工艺中氯仿的用量、水合时间、水合温度、超声破碎时间、超声破碎功率等因素进行考察时，发现上述考察因素所制备的TP-Lip包封率变化不大且变化规律不显著。在对TP-Lip处方中TP浓度、蛋黄卵磷脂含量、胆固醇含量等因素进行考察时，发现这3种因素对TP-Lip的包封率有显著影响且具有一定的变化规律。因此，以TP-Lip包封率为考察指标，TP药物浓度、药脂比、胆脂比为考察因素进行单因素实验。

2.4.1 TP-Lip药物浓度的考察

保持TP-Lip中的脂质材料用量及制备方法不变，设置TP浓度分别为0.5、1.0、1.5 mg/mL，按照“2.1”方法制备TP-Lip，各浓度TP-Lip平行实验3份，包封率分别为88.59%、95.43%、81.79%。结果表明随着药物浓度的提高，脂质体的载药量逐渐达到饱和，包封率反而下降。

2.4.2 TP-Lip药脂比的考察

保持TP-Lip中的脂质材料用量和制备方法不变，固定TP浓度为1 mg/mL，设置药脂比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，按照“2.1”方法制备TP-Lip，各药脂比TP-Lip平行实验3份，测得包封率分别为65.72%、78.46%、91.28%、88.63%、83.54%、84.63%。结果表明当药脂比大于1∶20时，随着含药量的增大，包封率逐渐降低，这可能是由于蛋黄卵磷脂的包载能力达到饱和。当药脂比达到1∶20时，包载率最高，继续增加蛋黄卵磷脂的量，药物与蛋黄卵磷脂包载不充分，包封率随之下降。

2.4.3 TP-Lip胆脂比的考察

保持TP-Lip中的脂质材料总量和制备方法不变，固定TP浓度为1 mg/mL，设置胆脂比为1∶10、1∶5、1∶2，按照“2.1”方法制备TP-Lip，各胆脂比TP-Lip平行实验3份，包封率分别为85.31%、89.65%、69.44%。结果表明当胆固醇含量过高时，脂质体包封率较低。胆固醇作为脂质体的重要组成部分，在一定范围内，对脂质体的结构、稳定性有重要影响。胆固醇含量过低时，会导致脂质体无法形成正常的磷脂双分子层结构，无法包载药物；胆固醇含量过高时，会导致脂质体膜负荷过大，造成部分脂质体破裂^[19-21]。

2.5 星点设计-效应面法优化TP-Lip处方 2.5.1 星点设计方案

在“2.4”实验的基础上，应用Design Expert 11软件进行实验设计，以TP-Lip的包封率（Y）为响应值，以TP-Lip中的药物浓度（X₁）、药脂比（X₂）、胆脂比（X₃）为考察因素，采用星点设计-效应面优化法来确定最佳工艺。因素及水平表见表 1、实验设计与结果见表 2。

2.5.2 模型拟合

运用Design-Expert 11对实验结果进行拟合，得到回归方程：Y=94.22+1.36X₁+6.83X₂+4.34X₃+0.45X₁X₂-1.09X₁X₃+0.2125X₂X₃-4.51X₁²-9.78X₂²-5.61X₃²，结果见表 3。

由表 3可知，所建立的模型P＜0.000 1，结果显著；失拟项P>0.05，表明该模型预测的可靠性。调整决定系数R²_Adj=0.9498，表明TP-Lip包封率的变化有94.98 %与TP浓度、TP与蛋黄卵磷脂的比值、胆固醇与蛋黄卵磷脂的比值有关。通过方差分析表得出，3个因素中对TP-Lip包封率影响的主次顺序依次是：X₂>X₃>X₁，即药脂比>胆脂比>药物浓度。

2.5.3 效应面分析

为了将TP药物浓度、药脂比、胆脂比的交互作用对TP-Lip包封率的影响更为清楚直观地表现，通过Design-Expert 11绘制出三维效应面图和等高线图，见图 2。

由图 2可知，当固定胆脂比不变时，随着药物浓度的增加以及药脂比比例的增大，TP-Lip的包封率曲线呈现先上升后下降的趋势。由曲线可知，在药物浓度＜0.9 mg/mL时，包封率随着药物浓度的增加而增加，但当药物浓度>1.1 mg/mL时，包封率随着药物浓度的增加而降低。由此可说明药物浓度的最佳用量范围为0.9~1.1 mg/mL；同理，药脂比的最佳比例范围为1∶25~1∶20。

当固定药物浓度不变时，随着药脂比、胆脂比比例的增加，TP-Lip的包封率曲线呈现先上升后下降的趋势。由曲线可知，药脂比为1∶25~1∶20，胆脂比的比例为1∶5.5~1∶4较为合适。

当固定药脂比不变时，随着药物浓度、胆脂比比例的增加，TP-Lip的包封率曲线呈现先上升后下降的趋势。由曲线可知，药物浓度为0.9~1.1 mg/mL，胆脂比的比例为1∶5.5~1∶4.0较为合适。

2.6 最佳工艺验证及Tp-Lip的表征 2.6.1 多批次工艺验证

利用Design-Expert 11软件对所得回归方程进行逐步回归分析，在预测的最优区域内，随机选择3个不同配比的处方进行验证。验证结果见表 4。

对上述3种处方的参数验证表明该模型预测具有可靠性。最终选择TP药物浓度、药脂比、胆脂比均在最佳比例范围内的处方，即TP药物浓度为1.083 mg/mL、药脂比为1∶24.144、胆脂比为1∶4.007，此时TP-Lip包封率预测值为92.93%。为了便于验证实验操作的简单可行性，将最佳工艺参数中的TP药物浓度修改为1.1 mg/mL、药脂比为1∶24、胆脂比为1∶4。在最佳工艺参数条件下，测得TP脂质体包封率为91.57%±0.21%，与模型预测的92.93%较一致，进一步验证了模型的可靠性。

2.6.2 TP-Lip的外观及透射电镜下的形态

图 3是在最佳处方工艺条件下制备的TP-Lip，以及在透射电镜下获得的图像，其外观为乳白色半透明溶液，具有丁达尔效应，透射电镜结果表明所制备的TP-Lip为类圆球形，分布较为均匀，其粒径大约为20~80 nm。

2.6.3 TP-Lip的粒径分布及电位

采用激光粒度仪测定TP-Lip的平均粒径为（86.97±4.55）nm，PDI为0.27，Zeta电位为-30.7 mV，其绝对值大于20 mV，说明TP-Lip粒径分布均匀且具有良好的负电性。需要注意的问题是，在透射电镜（TEM）下测得的TP-Lip的粒径小于激光粒度分析仪，这可能是TEM在测定时TP-Lip脱水导致的粒径收缩，以及激光粒度分析仪在测量时，TP-Lip在稀释后吸入液体膨胀导致的粒径增大所致。见图 4。

2.6.4 TP-Lip的体外释放考察

根据上述响应面筛选出的优化条件制备TP-Lip，采用透析法研究TP-Lip以及TP原料药的体外释药行为，在37 ℃、转子转速为100 r/min的条件下，分别取30.0 mL，pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）作为溶出介质，分别吸取浓度为1.0 mg/mL的TP-Lip原料药溶液及TP-Lip脂质体溶液置于透析袋中并浸入溶出介质，在0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h吸取1.0 mL溶出介质，同时补充1.0 mL PBS溶液。TP原料药溶液及TP-Lip脂质体溶液各平行测定3次，对所取出的溶液按“2.2.1”色谱条件测定药物浓度，并计算累计药物释放量。结果见图 5。

结果表明，TP-Lip在2~4 h有一定的突释，这可能是由于脂质体分解时，包埋较浅的药物分子发生了释放，4 h之后的释放趋于平稳，且TP-Lip的总体释放显著低于原料药，说明其具有一定的缓释作用。

3 讨论

值得注意的是，现有TP-Lip在制备时常需要加入表面活性剂如吐温-80、DSPE-PEG2000^[22]等多种辅料来提高脂质体的稳定性，但提升效果往往不好且增加了制备工艺中不必要的工序。本实验通过星点设计-效应面法所制备的TP-Lip具有处方优化效果好、原材料少、制备工艺简单、验证工艺便捷的特点。

相对于透析法、超速离心法、葡聚糖凝胶法等测定包封率的方法，滤膜法具有操作简单、重复率高、经济实惠的特点，适合脂溶性药物脂质体包封率的测定。本实验通过对游离药物加样回收率^[23]进行测定，表明滤膜法能够有效地截留住游离药物，基本不会影响脂质体包封率的测定。

本实验最终确定TP-Lip制备处方：TP药物浓度为1.1 mg/mL、药脂比为1∶24、胆脂比为1∶4，并通过测定TP-Lip包封率、外观、粒径、电位、体外释放等实验验证制备的TP-Lip形态分布均匀、缓释作用较好，为后续TP给药剂型的研究提供参考。