2025, Vol. 42文章信息
- 刘东岩, 谢周凡, 徐泽军, 等.
- LIU Dongyan, XIE Zhoufan, XU Zejun, et al.
- BCL2家族蛋白在中药干预心肌缺血/再灌注损伤的作用研究进展
- The role of BCL2 family proteins in traditional Chinese medicine intervention for myocardial ischemia/reperfusion injury
- 天津中医药, 2025, 42(7): 931-943
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(7): 931-943
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.07.17
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文章历史
- 收稿日期: 2025-03-19
2. 广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂, 广州 510515;
3. 广东省化学药原料与制剂关键技术研究企业重点实验室, 广州 510515;
4. 暨南大学, 广州 510632
心肌细胞死亡是冠心病患者因心肌梗死（MI）及其继发的心肌缺血/再灌注损伤（I/R）而死亡的核心病理机制之一。MI主要由动脉或旁路移植的血栓阻塞所诱发，导致心肌血流骤减，进而缺氧引发心肌细胞凋亡与坏死[1-2]。MI通过冠状动脉成形术、冠状动脉搭桥术（CABG）、血栓溶解疗法或直接经皮冠状动脉介入治疗（PCI）进行早期再灌注，可有效限制急性心肌梗死的发病率。这些方法显著降低了患者的病死率[3]，但并发症却以难以预测的方式发生，包括出血、缺血再灌注损伤和冠状动脉再狭窄[4-5]。经皮腔内冠状动脉成形术和血栓溶解疗法后的短期病死率分别为7% 和9%，PCI后1年病死率或心力衰竭住院率为8.6%[3]，部分原因是I/R损伤。
I/R损伤涉及多种病理过程，例如细胞损伤（凋亡、坏死和铁死亡）、氧化应激、炎症反应、血脑屏障（BBB）破坏、细胞外基质（ECM）重塑、血管生成、心肌细胞肥大和纤维化[6]等。在心肌缺血/再灌注损伤（I/R）的治疗领域，中药通过调控多重重要病理过程发挥作用，涉及的重要信号通路包括：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、丙酮酸激酶M2型（PKM2）、Notch信号通路以及受体相互作用蛋白1/受体相互作用蛋白3/混合系列蛋白激酶样结构域（RIP1/RIP3/MLKL）通路，这些通路可能以BCL2家族调控的细胞死亡为下游关键节点之一。其中，BCL2家族中的促凋亡蛋白BCL2同源拮抗剂杀伤蛋白/BCL2相关X蛋白（BAK/BAX）BAK/BAX依赖的线粒体外膜通透性（MOMP）驱动型细胞凋亡和线粒体通透性转换孔（MPTP）驱动型坏死性凋亡可能是I/R不良预后的关键作用因素之一，但目前尚无直接靶向BAK/BAX的中药、化学药或生物药应用于I/R治疗[7-10]；同时直接靶向BAK和BAX蛋白及其上下游通路，可能是实现I/R心肌细胞保护的有效方法之一。
在中医理论指导下，中药因具有多靶点协同、增效减毒特性，被应用于众多疾病领域。部分学者认为，“心肌缺血再灌注损伤”归属于“胸痹”“真心痛”“心悸”等范畴，为本虚标实之证，患者具有胸阳不振、心肾亏虚及心脉痹阻等多种症状，宜采用益气温阳、散瘀止痛、养阴活血等治疗策略[11-12]；涉及PI3K/AKT[13]、JAK/STAT[14]等多条通路。上述治疗策略指导下的中药组合，通过调控BCL2家族上游的多个关键信号通路，并以抑制BAK/BAX依赖的细胞死亡为重要下游节点，发挥I/R保护作用；但其多靶点多通路协同作用的分子机制尚未十分清晰，也尚无直接靶向BAK/BAX蛋白的中药被报道，这未能最大限度发挥中药和BCL2家族的心肌保护作用。针对上述问题，探索直接靶向BAK/BAX蛋白的中药并结合中医理论进行组合，可能是最大限度实现I/R保护的重要手段。
基于此，文章综述提出了筛选出直接靶向BAK/BAX蛋白的中药并结合中医理论进行搭配发挥多靶点协同、增效减毒作用的新策略，该方法既能直接抑制I/R损伤的关键蛋白，又能发挥中医药的特色优势，为I/R治疗提供了新的视角。
1 BAK/BAX调控I/R状态下心肌细胞的凋亡和坏死性凋亡 1.1 BCL2家族蛋白与凋亡凋亡机制主要分为死亡受体途径与线粒体途径，后者受BCL2家族蛋白的精密调控。BCL2家族包含3个亚家族：抗凋亡效应蛋白（如BCL2、MCL1、BCLXL），促凋亡效应蛋白（如BAK、BAX），以及仅含BH3结构域的蛋白（BH3-only蛋白，含BIM、PUMA、BAD等）[15-17]。这些蛋白中，抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白均含4个BH结构域（BH1-4），构成BCL2核心，其中，BH3结构域是这些蛋白间相互作用的关键；BH3-only蛋白则仅含单一α螺旋结构，用于结合抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的BH3结构域 [18]。
BCL2家族蛋白通过动态互作维持细胞的“死亡-存活”平衡。促凋亡蛋白BAK与BAX在被激活后直接启动凋亡，而BH3-only蛋白则通过直接激活BAK或BAX；也可以与抗凋亡蛋白结合削弱其功能（如BCL2、MCL1）来增强凋亡敏感性[15]。反之，抗凋亡蛋白通过与BH3-only蛋白或BAK/BAX的直接结合作用抑制凋亡。在应激条件下（如营养匮乏、缺氧），促凋亡蛋白或BH3-only蛋白表达上调，而抗凋亡蛋白表达下调或加快降解，促使细胞凋亡；而在药物干预或营养补充时，抗凋亡蛋白表达增加或降解减缓，利于细胞存活[19]。
BAK或BAX的激活是线粒体凋亡途径的核心步骤。两者均含9个螺旋结构（α1-α9），常态下以非活化单体形式存在。BAK锚定于线粒体外膜，可呈非活化单体或预活化二聚体状态；BAX则游离于细胞质，受信号刺激后α9螺旋插入线粒体外膜发挥促凋亡作用[20]。在凋亡信号刺激下，BH3-only蛋白与BAK或BAX的BH3结构域相互作用，激活BAK或BAX，暴露α2-α5结构域形成BH3凹槽，促进BAK或BAX各自形成二聚体及寡聚体。同时，α6-α8区域形成疏水结构，破坏膜双层稳定性，导致BAK/BAX低聚物聚集并形成膜孔，即发生线粒体外膜通透性改变，释放细胞色素c（Cytc）至胞质溶胶，触发下游凋亡途径。这一过程体现了细胞凋亡调控的复杂动态平衡[15]。
1.2 I/R心肌细胞死亡的主要形式 1.2.1 MOMP驱动型细胞凋亡和MPTP驱动型坏死性凋亡在心肌缺血时期及再灌注初期，心肌细胞发生以MOMP驱动型细胞凋亡为代表性的死亡方式[21-23]。在心肌缺血再灌注损伤初期，观察到Caspase-3的激活和促凋亡蛋白BAX、NOXA和PUMA的活性显著提升[22]；均为BCL2家族调控的线粒体凋亡途径特征，而BCL2家族依赖的细胞凋亡特征之一则为MOMP驱动。部分研究表明，在心脏在缺血/再灌注初期，坏死性凋亡信号通路未被激活，给予坏死性凋亡核心蛋白RIP3抑制剂无法消除心肌损伤；心肌梗死后1~12周，梗死心脏边缘区的RIP1和RIP3蛋白水平显著上调，坏死性凋亡是随着心力衰竭的进展而诱发[21, 23]，因此，在心肌缺血时期及再灌注初期，心肌细胞发生MOMP驱动型细胞凋亡为代表性的死亡方式，而坏死性凋亡更多存在于后期。在缺血缺氧状态下，心肌氧气供应减少线粒体氧化磷酸化受抑制，从而可能导致有氧代谢向无氧代谢转变，细胞内钙水平增加；低水平的ATP和Ca2+过载，将部分诱导ROS的生成、胞内氧化应激增加、磷脂酶激活后促使膜磷脂降解[24-25]，这将部分引发MOMP的开放，最终部分导致MOMP驱动型心肌细胞凋亡为代表的多种死亡方式发生，且凋亡占有重要地位 [21-23, 26]。而再灌注阶段初期，由于肌浆网与胞质溶胶间Ca2+循环的加剧，ROS过度生成加剧（甚至超过缺血期），心肌细胞仍可能发生以MOMP驱动型心肌细胞凋亡为代表的重要死亡方式；特征包括细胞核皱缩、凋亡小体形成等[26-27]。随着再灌注时间延长，心肌细胞发生以MPTP驱动的坏死性凋亡（necroptosis）为代表的死亡方式；特征包括线粒体与肌膜破裂、收缩带形成，白细胞的早期浸润以及坏死小体形成[27]。在I/R后，小鼠心脏边缘区的RIP1和RIP3以及混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）等蛋白表达水平及磷酸化激活程度持续增加，形成坏死小体（坏死性凋亡的关键特征），这极大可能引发MPTP驱动的坏死性凋亡；该通路激活后，部分MLKL磷酸化并转位至线粒体诱导部分MCL1降解，释放部分BAK或BAX，进而诱发坏死性凋亡。在给予特异性坏死性凋亡抑制剂Nec-1处理后，小鼠心肌梗死的面积显著减少，且该抑制剂在28 d的观察期间内有效地抑制了心脏进一步的重塑过程[25, 28-31]。上述研究表明，坏死性凋亡在再灌注损伤的中后期显著激活，并持续数周，其在缺血I/R损伤后引发的不良心脏重塑和心力衰竭进程中发挥重要作用。
1.2.2 BCL2家族动态平衡对MOMP驱动型细胞凋亡和MPTP驱动型坏死性凋亡的影响在I/R过程中，心肌细胞死亡主要以MOMP驱动的凋亡和MPTP驱动的坏死性凋亡形式发生，这两者都与BCL2家族蛋白密切相关[27]。BCL2蛋白家族包含3个亚家族：以BCL2、MCL1、BCLXL为代表的抗凋亡蛋白；以BAK、BAX为代表的促凋亡效应蛋白；以BCL2相互作用细胞死亡介导因子（BIM）、p53上调凋亡调控因子（PUMA）、BCL2相关死亡促进因子（BAD）等为代表的仅含BH3蛋白。仅含BH3蛋白具有激活BAK/BAX的能力，而抗凋亡蛋白则对BAK/BAX有抑制作用[15]。这3类蛋白质相互作用，调节凋亡与存活之间的平衡[30-32]。正常生理状态下，当线粒体凋亡途径被激活时，BAK或BAX蛋白被BH3-only蛋白激活或自发启动激活，随后在线粒体外膜上发生寡聚化并聚合形成孔隙诱导MOMP；细胞色素C漏出至细胞质中，最终发生细胞凋亡[15]。
在I/R过程中，心肌细胞凋亡和坏死性凋亡的发生依赖于BCL2家族蛋白的动态平衡。在MI及再灌注早期，缺血缺氧环境部分介导BCL2、MCL1等抗凋亡蛋白减少，被释放或合成的BAK/BAX增多，BAK/BAX大量寡聚化诱导MOMP驱动的凋亡[33-35]。而再灌注中后期，大量炎症因子释放，BAK/BAX单体或少量寡聚体诱导MPTP驱动的坏死性凋亡[33-35]。在缺血和缺氧环境下，阻断电子传递链可能会导致BCL2水平升高，从而导致MOMP对凋亡信号的敏感性降低[36]。在坏死性凋亡方向，PUMA[37]、BAK[35]或BMF的缺失[38]抑制了RIP3/MLKL通路的激活，减少了坏死性凋亡的发生。类似地，MLKL的165-176位氨基酸段形成BH3样结构域，该结构域与BCL2的连接，减少了MLKL蛋白磷酸化和寡聚化过程，进而有效阻止了坏死性凋亡的发生[35]；过表达抗凋亡蛋白BCLXL同样能够减少坏死性凋亡，但其作用机制未知[38-39]。
上述研究提示，BCL2家族蛋白调控了缺血缺氧条件下的细胞凋亡以及坏死性凋亡。
1.2.3 MOMP驱动型凋亡和MPTP驱动型坏死性凋亡的关键靶标如前所述，在心肌缺血及再灌注早期，心肌细胞发生以凋亡为代表性的死亡方式，BAX或BAK依赖的MOMP是触发凋亡的关键步骤[20]。该凋亡过程特征在于BAK或BAX的大量寡聚化并在线粒体外膜上形成稳定膜孔，允许Cytc扩散到细胞质中，最终触发凋亡[15]，抗凋亡蛋白的高表达或促凋亡蛋白的抑制可以减少心肌缺血及再灌注早期的心肌细胞凋亡。再灌注损伤中后期，心肌细胞死亡方式以坏死性凋亡为主，BAX/BAK依赖的MPTP是触发坏死性凋亡关键蛋白[6, 23, 40]。该过程特征在于TNF-α等炎症因子增加，激活RIP1/RIP3和MLKL，磷酸化的MLKL易位至线粒体后促进MCL1降解，释放BAK或BAX，诱导BAK/BAX依赖，但非BAK/BAX寡聚化依赖的MPTP，进而引发坏死性凋亡[41-42]。抑制BAX或BAK介导的细胞死亡能够实现心脏功能保护。在BAK和BAX双敲除细胞中，仅恢复BAX单体表达即可重现MPTP依赖的细胞死亡，这可能与BAX的C端螺旋参与线粒体外膜通透性变化有关[42-44]。研究发现，在I/R模型中，与野生型小鼠相比，BAX-/-BAK-/-小鼠表现出梗死面积显著减小，说明细胞凋亡或坏死性凋亡的减少[45]。据报道，过表达BCL2[46]、BCLXL[47]（BAK/BAX抑制蛋白）或敲除PUMA[48]（BAK/BAX抑制蛋白）的小鼠具有防止心肌缺血再灌注损伤的作用，具体表现包括（LDH）释放量、梗死面积减少，心肌功能恢复、动物存活率提升等[49-50]。此外，Ca2+诱导线粒体出现MOMP现象，开启细胞凋亡；但BAK/BAX双敲除后，MEF细胞的MOMP现象变少，凋亡随之减少[10]。
上述内容提示，MOMP依赖的凋亡发生在I/R的缺血及再灌注的早期，启动于线粒体外膜，其特征包括BAK或BAX大量寡聚化并在线粒体上形成孔道，细胞色素C等物质释放、Caspase-3激活等。相比之下，MPTP依赖的坏死性凋亡发生在再灌注后期，启动于线粒体内膜，且可能持续较长；其特征过程包括RIP1/RIP3/MLKL的坏死小体形成、MLKL含量、活化程度增加并转位至线粒体、MCL-1减少、少量BAK或BAX单体或极少量的寡聚体通过诱导MPTP触发坏死性凋亡。BAK和BAX依赖的MOMP能够促进MPTP依赖的坏死性凋亡发生，但当BAK或BAX大量寡聚化时，细胞更有可能发生凋亡而非坏死性凋亡。因此，在I/R过程中，BAK/BAX是心肌细胞死亡的关键下游环节，靶向BAK/BAX是实现I/R心肌保护的潜在手段。
1.3 多通路调控BCL2蛋白对心肌细胞死亡的影响 1.3.1 多条途径调控BCL2蛋白磷酸化对细胞死亡的影响在心肌细胞死亡的调控过程中，BCL2蛋白的磷酸化起到了至关重要的作用。研究表明，JNK、p38/MAPK以及PKM2能够介导BCL2的磷酸化。JNK和p38/MAPK通过磷酸化作用诱导BCL2失活，降低了BCL2与BAX之间的亲和力，导致BAX的分离，从而在缺血后和氧化应激期间导致心肌细胞损伤[51-52]。不同的是，在热休克蛋白90（HSP90）的协同作用下，PKM2诱导BCL2磷酸化，这阻止了BCL2的降解，增强了BCL2与BAX结合的稳定性，抑制了细胞凋亡的发生[53]。BCL2具有3个磷酸化位点T69、S70和S87；这些磷酸化位点的差异能够导致抗凋亡活性方向相反。Song等[54]建立了基于细胞的p-BCL2计算方法，发现当所有BCL2蛋白中T69、S70和S87的3个位点的整体磷酸化水平低于50%时，BCL2活性降低，但当磷酸化水平超过50%时，BCL2活性升高。
1.3.2 多条途径调控BCL2家族蛋白表达对细胞死亡的影响PI3K/AKT通路是氧化应激相关蛋白合成的重要调节因子[55]，并通过多种方式影响BCL2家族蛋白平衡，进而调控细胞凋亡。1）AKT通过介导FOXO磷酸化下调BIM表达[56]。2）AKT促进P53的降解，从而降低PUMA和NOXA的表达。3）AKT抑制GSK的活性，减少了E3泛素连接酶对MCL1的识别和降解，从而增加抗凋亡蛋白的功效[57]。4）BAD在136 ser处被AKT直接磷酸化，随后与14-3-3蛋白结合，这将促使BAD与BCLXL等抗凋亡蛋白解离[58]。先前的研究表明，在I/R期间，大鼠心肌细胞中p-mTOR、PI3K和p-AKT的浓度显著降低[59]，Caspase-3和BAX表达含量在心肌细胞中显著升高，BCL2表达显著降低[60]。此外，在大鼠离体心脏中，七氟醚治疗后，AKT信号通路被激活，BAX/BCL2比值降低，显著改善了心肌细胞的再灌注损伤。JAK/STAT信号通路受细胞因子调控，参与细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节等许多重要的生物学过程。JAK家族有4个成员，STAT有7个家族成员，STAT3是心脏保护的核心成分[61-62]，而BCL2[63]和BCLXL[64]是STAT3的靶基因。JAK2/STAT3信号通路激活后能够发挥心肌保护作用，其作用机制主要是增加了抗凋亡BCL2的合成和抑制促凋亡蛋白BAX水平[65]。经JAK2抑制剂AG-490处理后，MI大鼠心肌组织STAT3磷酸化明显受到抑制，Caspase-3活性、BAX表达及凋亡细胞数明显增加[66]。与STAT3不同，JAK1/STAT1通路促进c-Fos和NFκB p65核转位[67]、上调Caspase-1[68]，诱导I/R中的心肌细胞凋亡；但采用siRNA技术沉默STAT1可抑制坏死诱导上清液所引发的心肌细胞死亡。AMPK是细胞能量的感受器，也是心肌保护的重要蛋白。缺血条件下，由于AMP/ATP比率变化，AMPK/GSK-3β通路被激活后，将上调GPX4表达、降低ROS含量，提升BCL2/BAX比率[69]，最终保护心脏免受I/R损伤[70]。此外，AMPK被激活后也能够通过诱导自噬，促进H9C2心肌细胞存活；使用AMPK抑制剂后，心肌细胞死亡情况增加[71]。
Notch信号通路的激活能够在I/R过程中实现心肌保护。在AMI后，心肌细胞中Notch信号通路相关蛋白水平明显升高，提示该通路参与了心肌损伤的调控[72]。此前研究表明，激活Notch信号可以限制心肌缺血范围，改善MI后的心肌功能[73]；该通路主要通过减少细胞凋亡和氧化应激促进血管生成[74-75]、降低纤维化程度[76]，进而实现心肌缺血损伤的修复和心脏保护。在体外细胞实验中，Notch1通过调控RBP-J或NF-κB等转录因子，以下调BAX和LDH含量，提高BCL2水平为特征，显著抑制了心肌细胞的死亡[77-79]。
上述分析表明，直接靶向BAK或BAX，可能是改善I/R损伤的有效方法；鉴于此，若能研发出一种能够直接作用于BAK/BAX，又能同时作用于多条通路与多个靶点的药物，则有望突破当前I/R治疗的局限性。BAK/BAX依赖的MOMP驱动型凋亡和MPTP驱动型坏死性凋亡示意图见图 1。
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| 注：MOMP驱动型细胞凋亡（左侧）可通过死亡受体途径或线粒体途径启动。在死亡受体或线粒体途径激活后，BIM、PUMA、NOXA或tBID等因子直接激活BAK或BAX，导致线粒体外膜通透性（MOMP）改变及细胞色素C的释放。细胞色素C与APAF1结合，激活CASP3和CASP7，从而诱导MOMP驱动型凋亡。坏死性凋亡（右侧）：在死亡受体、病毒或TLR3/4等信号激活的情况下，RIP3和RIP1形成磷酸化复合物（坏死小体），诱导MLKL磷酸化。磷酸化的MLKL转位至细胞膜或线粒体，在线粒体上促进MCL1降解，释放少量游离的BAK或BAX，刺激线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放，导致线粒体基质内容物释放并诱导MPTP驱动型坏死性凋亡。 图 1 BAK/BAX依赖的MOMP驱动型凋亡和MPTP驱动型坏死性凋亡 Fig. 1 BAK/BAX-dependent MOMP-driven apoptosis and MPTP-driven necroptosis |
现代分子生物学机制研究良好阐释了中药协同作用“多通路多靶点”特征的科学性，这与现代药物的研发或联合使用理念一致。从协同增效角度，以补阳还五汤为例，该组方由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁组成。其中，黄芪甲苷抑制肌钙蛋白、炎症因子、BAX的表达，促进抗凋亡蛋白BCL2的表达[80]；当归尾内有效成分提高大鼠心肌细胞内GSH-Px、SOD抗氧化物质等活性，提升BCL2含量并降低BAX含量[81]；红花降低I/R兔心肌酶活性，同样促进BCL2表达并抑制BAX表达[82]；川芎具有通过抗氧化应激、降低炎症进而改善I/R大鼠心肌损伤的作用[83]；以补阳还五汤为例，说明中药内多个药物发挥“多通路多靶点”作用，抑制心肌细胞损伤。从减毒层面，人参与乌头搭配时，人参皂苷能够改变毒性物质乌头碱的药代动力学，促进乌头碱由双酯型二萜生物碱快速代谢为毒性较低的单酯生物碱[84]；甘草与雷公藤搭配后，毒性物质雷公藤内酯酮代谢速度加快且组织分布浓度降低，减少了毒性物质在体内的暴露量。从药效学层面探究，丹参或红花对炎症和氧化状态、血管内皮损伤和心肌能量代谢具有互补作用；丹参减少了红花引起的肌酐的不良反应[85]。在大鼠关节炎模型中，乌头碱有效通过抑制NF-κB激活Nrf2降低炎症和氧化应激作用；而麻黄能够有效协同乌头抑制NFκB激活，黄芪有效协同乌头激活Nrf2通路降低氧化应激[86]。中药通过合理搭配，实现多组分-多靶点-多通路作用，同一信号通路协同增强，不同信号通路协作，共同增强药效。
因此，探索开发一种能发挥多通路多靶点治疗效应的中药制剂，可能为I/R损伤的治疗开辟一种新的策略。
2.2 中药调控BCL2家族改善I/R心肌损伤在I/R状态下，中药通过调控PI3K/AKT、JAK/STAT、AMPK、JNK、PKM2、Notch等多条信号通路，实现对心肌细胞保护的作用。这些通路均不同程度地以BCL2家族蛋白（如BCL2和BAX）为下游关键核心，体现了中药因其多靶点特征在心血管疾病治疗中的复杂机制与显著效果。以“Myocardial ischemia-reperfusion”“Traditional Chinese Medicine”和“PI3K/AKT或JAK/STAT或AMPK或JNK或PKM2或Notch”等通路为关键词，以Pubmed为主要数据库开展搜索进行讨论。
2.2.1 PI3K/AKTPI3K/AKT通路的激活具有心肌保护作用，中药调控该通路改善AMI或I/R的研究较多，代表性中药包括舒血宁注射液[87]、活心丸[88-89]等。例如，给予7.35 mg/kg舒血宁注射液[87]后，I/R大鼠心肌细胞内磷酸化PI3K以及磷酸化AKT、BCL2水平显著增加，BAX含量降低，说明舒血宁注射液通过PI3K/AKT通路降低了I/R对大鼠的心肌损伤。在缺血/缺氧条件下，丹蒌片[90]通过激活AKT-FOXO3α通路，降低了人AC16细胞和新生大鼠心肌细胞中BAX/BCL2比值、BIM和PUMA的表达，进而抑制了心肌细胞的凋亡。类似的，芪参益气滴丸[91]发挥心脏保护的机制是可能激活PI3K/AKT-mTOR信号通路，调节自噬相关蛋白，抑制BCL2含量、NLRP3炎症酶的激活和组装，进而改善心肌I/R损伤。此外，红景天颗粒[92]、通心络胶囊[93]、活血解毒方[94]等复方制剂，人参皂苷Rb1[95]、Rd[96]、丹参酮IIA[97]等中药组分或单体均具有通过PI3K/AKT通路调控BCL2家族蛋白平衡实现心肌保护的作用。上述研究表明，中药能够激活PI3K/AKT通路调控BCL2家族蛋白改善心肌I/R损伤。
2.2.2 JAK/STATJAK/STAT通路不同亚型对I/R损伤的心肌保护具有相反作用。Liu等[98]发现，槲皮素可以提高I/R大鼠JAK2/STAT3信号通路磷酸化水平，上调IL-10的表达，减轻I/R后心肌损伤；但这种保护作用能被IL-10R的抗体消除，说明JAK2/STAT3/IL-10是槲皮素发挥心肌保护的关键通路。灯盏花素[99]已被多项研究认为可以改善I/R带来的心肌损伤并剂量依赖性地减少I/R大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8和CK等促炎细胞因子的释放和ROS水平增加，降低BAX表达水平并提高BCL2蛋白的表达水平，上述作用可能通过JAK/STAT3通路实现。芹菜素[100]是较少被关注用于I/R治疗研究的中药单体，该药物可以下调miR-15b表达，增加JAK2表达并激活JAK2-STAT3通路，减少心肌细胞凋亡和ROS生成，进而减轻心肌I/R损伤。特别的，隐丹参酮通过JAK1/STAT3影响BCL2家族通路显著降低了I/R引起的梗死面积、凋亡细胞数量以及LDH和肌酸激酶同工酶的浓度[101]。上述研究表明，中药能够通过JAK/STAT通路调控BCL2家族蛋白改善心肌I/R损伤。
2.2.3 AMPKAMPK是产生ATP的能量感受器，也是减少I/R损伤的重要信号通路。心脉安片[102]能够显著减少I/R大鼠心肌梗死面积，提高ATP、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶水平、增加p-AMPK、SIRT1和PGC-1α的蛋白含量，说明心脉安片通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1通路，从而减轻线粒体氧化应激损伤。以中药配方生脉散为基础开发的中药益气复脉注射液[103]，经临床验证展现出显著的心血管疾病药理活性。体内外研究显示，益气复脉注射液减少I/R大鼠心肌细胞凋亡和梗死面积，降低血清中LDH、CK的生成，激活AMPK通路，增加BCL2/BAX的比例；而使用AMPK抑制剂干预时，益气复脉注射液的心肌保护作用消失；说明益气复脉注射液主要通过AMPK通路发挥心肌保护功效。经红景天注射液[104]处理心肌缺血再灌注损伤后的LC3转基因C57BL/6J小鼠，LC3-Ⅱ和p-AMPK表达降低、p-mTOR水平升高，BCL2/BAX的比例增加，说明红景天注射液通过激活AMPK/mTOR通路改善线粒体功能、调节自噬从而抑制细胞凋亡。此外，虫草素[105]、毛蕊花苷[106]、羟基红花黄色素[107]等中药成分也能通过AMPK通路实现I/R状态下的心肌保护作用。上述研究表明，中药能够通过激活AMPK通路调控BCL2家族蛋白改善心肌I/R损伤。
2.2.4 JNK在I/R条件下，阻断JNK通路激活显著降低了心肌细胞的死亡。Wu等[108]发现，在给予芍药苷后，I/R大鼠心肌细胞Caspase-3、BAX、p-ERK、p-JNK、p-P38等蛋白水平降低，BCL2蛋白水平升高，说明芍药苷通过抑制JNK通路调控凋亡通路相关蛋白表达来减少心肌细胞死亡。采用网络药理学结合动物模型研究发现，丹酚酸B[109]缩减了小鼠I/R损伤后的心肌梗死面积，其发挥作用可能是通过抑制JNK/P38磷酸化激活，降低BAX含量并提高BCL2表达水平，从而实现心肌保护作用。与上述两种中药成分稍有不同，6-姜辣素[110]的作用与炎症相关，抑制了I/R诱导的JNK/NF-κB激活，降低了炎症因子TNF-α的水平，进而减少了心肌细胞死亡。复方丹参滴丸[111]、芪仙颗粒[112]等复方中药也同样可以通过抑制JNK通路实现心肌保护作用。上述研究表明，中药能够通过抑制JNK通路调控BCL2家族蛋白改善心肌I/R损伤。
2.2.5 PKM2PKM2通路的激活显著改善I/R小鼠的心肌死亡情况。探究中药通过PKM2通路改善I/R的研究相对较少。前期研究认为，麝香的主要成分麝香酮[113]促进了PKM启动子区H3K4me3水平，抑制了启动子H2AK119Ub和H3K27me3表达和组蛋白的修饰，降低了NLRP3/IL-1β/IL-6等炎症相关通路的激活程度以及BAX/BCL2的比例，进而减少心肌细胞死亡。毛冬青三萜皂苷[114]调节HSP90/ITA/PKM2轴，对PKM2的Cys474、Cys424和Lys151位点修饰，减少了BCL2的降解，进而减轻I/R引起的心肌细胞凋亡。上述研究表明，中药能够通过激活PKM2通路调控BCL2家族蛋白改善心肌I/R损伤。
2.2.6 NotchNotch通路的激活能够诱导心肌损伤的修复。中药黄酮类物质山柰酚[115]对I/R诱导的H9C2细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能是通过上调miR-21进而激活Notch1/PTEN/AKT信号通路，降低促凋亡蛋白BAX，TNFα、IL-1β、IL-8、IL-10等炎症因子的表达，提高抗凋亡蛋白BCL2水平等多角度来减少心肌细胞死亡，实现心肌保护。
2.2.7 RIP1/RIP3/MLKL体内研究中，经补阳还五汤[116]处理的I/R大鼠心肌细胞死亡数目减少，RIP1/RIP3/MLKL等坏死性凋亡相关蛋白表达降低；体外研究中，经丹参酮I[117]或甘蔗叶多糖[118]处理，H9C2细胞RIP1/RIP3/MLKL等蛋白活化程度降低，减少了坏死性凋亡的发生。
综上所述，中药单体化合物改善心肌缺血/再灌注损伤的信号通路示意图见图 2。中药单体（表 1）、复方（表 2）通过PI3K/AKT、JAK/STAT、AMPK、JNK、PKM2、Notch和RIP1/RIP3/MLKL等多通路抑制心肌细胞死亡进而起到心肌保护作用，但上述信号共同构建的心肌保护作用网络下游关键节点及关键药材或组分仍不清晰，这将限制中药心肌保护的广泛应用。因此，明晰调控心肌细胞死亡的下游节点，发挥中药合理搭配“多通路多靶点”的增效减毒作用，有助于进一步解决I/R治疗领域未被满足的临床需求。
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| 注：心肌缺血/再灌注损伤涉及PI3K/AKT、JAK/STAT、AMPK、JNK、PKM2、Notch和RIP1/RIP3/MLKL等多通路，而中药通过抑制JNK以及RIP1/RIP3/MLKL通路或激活PI3K/AKT、JAK2/STAT3、JAK1/STAT3、AMPK、PKM2和Notch等通路，进而发挥显著的心肌保护作用。 图 2 中药单体化合物改善心肌缺血/再灌注损伤的信号通路 Fig. 2 Signaling pathways of monomeric compounds derived from traditional Chinese medicine in ameliorating myocardial ischemia/reperfusion injury(MI/RI) |
| 中药材 | 单体物质 | 物质类别 | 信号通路 |
| 人参 | 人参皂苷Rb1[95] | 糖苷类化合物 | PI3K/AKT |
| 人参皂苷Rd[96] | 糖苷类化合物 | PI3K/AKT | |
| 丹参 | 丹参酮[97] | 脂溶性菲醌类化合物单体 | PI3K/AKT |
| 丹酚酸B[109] | 酚酸类 | JNK | |
| 丹参酮I[117] | 脂溶性菲醌类化合物单体 | RIP1/RIP3/MLKL | |
| 灯盏花 | 槲皮素[98] | 黄酮醇类化合物单体 | JAK/STAT |
| 灯盏花素[99] | 黄酮类 | JAK/STAT | |
| 芹菜 | 芹菜素[100] | 黄酮类 | JAK/STAT |
| 蛹虫草 | 虫草素[105] | 嘌呤类生物碱类 | AMPK |
| 肉苁蓉 | 毛蕊花苷[106] | 环烯醚萜苷类化合物 | AMPK |
| 红花 | 羟基红花黄色素[107] | 查尔酮苷类化合物 | AMPK |
| 白芍、赤芍 | 芍药苷[108] | 单萜苷类化合物 | JNK |
| 姜黄 | 6-姜辣素[110] | 姜酚类化合物 | JNK |
| 麝香 | 麝香酮[113] | 酮类化合物 | PKM2 |
| 毛冬青 | 毛冬青三萜皂苷[114] | 三萜皂苷类化合物 | PKM2 |
| 银杏叶 | 山柰酚[115] | 黄酮类化合物 | Notch |
| 中药复方 | 组方药材 | 信号通路 |
| 舒血宁注射液[87] | 银杏叶 | PI3K/AKT |
| 活心丸[88-89] | 灵芝、人工麝香、熊胆、红花、体外培育牛黄、珍珠、人参、蟾酥、附子、冰片 | PI3K/AKT |
| 丹蒌片[90] | 瓜蒌皮、薤白、葛根、川芎、丹参、赤芍、泽泻、黄芪、骨碎补，郁金 | PI3K/AKT |
| 芪参益气滴丸[91] | 黄芪、丹参、三七、降香油 | PI3K/AKT |
| 红景天颗粒[92] | 大花红景天 | PI3K/AKT |
| 通心络胶囊[93] | 人参，水蛭，全蝎，赤芍，蝉蜕，土鳖虫，蜈蚣，檀香，降香，乳香（制），酸枣仁（炒），冰片 | PI3K/AKT |
| 活血解毒方[94] | 白芍、川芎、黄连 | PI3K/AKT |
| 益气复脉注射液[103] | 红参、麦冬、五味子 | AMPK |
| 红景天注射液[92] | 大花红景天 | AMPK |
| 心脉安片[102] | 人参、黄芪、丹参、赤芍、麦冬、冰片 | JNK |
| 复方丹参滴丸[111] | 丹参、三七、冰片 | JNK |
| 芪仙颗粒[112] | 黄芪、丹参、淫羊藿、扁豆 | JNK |
| 补阳还五汤[116] | 黄芪、当归尾、赤芍、地龙（去土）、川芎、红花、桃仁 | RIP1/RIP3/MLKL |
在中医理论指导下，中药发挥“多靶点”协同作用，被广泛应用于防治I/R的心肌损伤，临床疗效确切，安全性良好。当前，已有多种中药单体、提取物或复方被报道通过影响BCL2家族蛋白实现心肌保护；如丹参素[119]通过PI3K/AKT-ERK1/2、Nrf2/HO-1、eNOS等多种通路影响BCL2/BAX比例；麝香酮[113]通过PKM2通路影响BCL2/BAX水平；桂枝甘草汤[120]可能通过NF-κB、HIF-1α、MAPK、TNF以及PI3K/AKT等多通路影响了BAK/BAX依赖的细胞凋亡和坏死性凋亡；类似的，稳心颗粒[121]、活心丸[122]、复方丹参滴丸[123]、通心络胶囊[124]等均有调控BCL2家族蛋白实现心肌保护的作用（图 3）。但上述药物发挥功效影响BAK/BAX的分子机制、直接靶向作用情况、物质基础仍不十分清晰，未能充分体现中医理论结合现代分子生物学对中药的指导作用，这将限制中医药在I/R领域的临床应用。若以BAK/BAX为关键靶标，筛选出直接靶向BAK/BAX的中药（如针对表 1、2中的高频药物丹参、人参、红花、川芎及三七等开展探索），并结合中医理论对该中药进行指导，将更进一步推动中药的心肌保护作用。
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| 注：心肌梗死期间及缺血再灌注初期，心肌细胞主要发生BAK/BAX依赖的MOMP驱动型细胞凋亡；而缺血再灌注后期，心肌细胞主要发生BAK/BAX依赖的MPTP驱动型坏死性凋亡。中药能够通过抑制JNK以及RIP1/RIP3/MLKL或激活PI3K/AKT、JAK2/STAT3、AMPK、PKM2和Notch通路，进而抑制BAK/BAX依赖的细胞凋亡和坏死性凋亡。 图 3 中药改善心肌缺血再灌注细胞死亡的作用机制 Fig. 3 Mechanisms of traditional Chinese medicine in ameliorating myocardial ischemia-reperfusion-induced cellular death |
综上所述，I/R的病理生理机制中，涉及多环节、多因素、多靶点，是一个复杂的过程，BAK和BAX蛋白是I/R过程中多因素诱导心肌细胞死亡的下游关键蛋白之一。靶向BAK/BAX蛋白可能是提高I/R临床获益的重要手段，但当前缺乏直接靶向BAK/BAX蛋白的中药或西药。基于此，笔者提出一种药物研发的新思路，即发掘能直接作用于BAK/BAX蛋白的中药活性成分，并依据中医理论对这些直接靶向BAK/BAX的中药进行科学指导，以期实现多靶点协同、增效减毒作用；该方法可能既能最大限度发挥中药I/R心肌细胞保护作用，又是阐明中医药理论现代科学内涵的重要手段，并为I/R药物研发提供了新的方向。
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