中药益智来源于姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果实，临床上多以益智去壳后的种仁益智仁入药。益智作为“四大南药”之一，主产于海南、广东、广西等地，具有暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾的功效。益智仁中含有挥发油、二苯庚烷、黄酮类等多种化学成分^[1]，其中挥发油作为益智仁中的主要活性成分，具有神经保护、提高学习记忆、改善认知障碍等功效^[2]，在治疗神经退行性疾病方面展现出良好的应用前景。

挥发油类成分具有抑菌、抗炎、抗氧化等多种药理活性，但由于成分复杂、稳定性差等因素，限制了其在临床中的广泛应用^[3]。在2020年版《中华人民共和国药典》中，益智仁的质量控制仅以挥发油含量作为评价指标，不足以充分反映其内在质量，难以保障药物在临床应用中的疗效。目前，关于益智仁挥发油质量控制的研究较为有限，相关质量控制标准尚不完善，因此筛选出合适的质量标志物对于益智仁挥发油的质量评价具有重要意义。

气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）结合网络药理学为中药挥发油的药效物质基础及作用机制研究提供了新的研究思路^[4]。GC-MS技术能够有效表征挥发油中的化学成分；网络药理学通过构建“成分-靶点-通路”网络拓扑学关系图，可以直观展示中药治疗疾病的作用机制，并充分体现中药多成分、多靶点的药效作用特点^[5-7]。近年来，质量标志物逐渐成为中药质量评价体系中的重要组成部分，能够更客观、全面地评估中药的质量^[8]。本研究通过GC-MS技术对益智仁挥发油的化学成分进行分析，并结合网络药理学方法预测益智仁挥发油的质量标志物，以期为益智仁挥发油的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，7890B-5977B，美国Agilent公司）；NIST 17.L质谱数据库（美国Agilent公司）；万分之一天平（ME204，瑞士METTLER公司）；十万分之一天平（MS105DU，瑞士METTLER公司）；智能超声波清洗器（DL-720B，上海之信仪器有限公司）；挥发油提取器（河南科信玻璃仪器厂）；调温电热套（杭州旌斐仪器科技有限公司）；中药粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）。

1.2 试药

甲醇（色谱纯，Sigma-Aldrich贸易有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，天津市汇杭化工科技有限公司）；共12批次益智仁饮片购自各地饮片公司，产地详细信息见表 1。根据2020年版《中华人民共和国药典》益智项下要求对样品进行检测，检测结果均符合药典要求。

2 方法与结果 2.1 益智仁挥发油化学成分研究 2.1.1 益智仁挥发油的提取

益智仁饮片粉碎过2号筛，取约50 g益智仁粉末，精密称定，置1 000 mL圆底烧瓶中，加8倍量水，按水蒸气蒸馏法提取，提取5 h（微沸开始计时），加入适量无水硫酸钠干燥，即得益智仁挥发油。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密移取益智仁挥发油100 μL于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，过0.22 μm滤膜，即得。

2.1.3 色谱条件

色谱柱为Agilent HP-5 MS弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色谱分离采用程序升温模式，初始温度50 ℃，先以15 ℃/min升至135 ℃并保持3 min，然后以1 ℃/min升至140 ℃并保持5 min，再以1 ℃/min升至145 ℃，最后以10 ℃/min升至250 ℃。

2.1.4 质谱条件

离子源温度230 ℃；电离方式EI；电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；色谱-质谱连接口温度280 ℃；溶剂延迟4 min；质量扫描范围30~550 amu；分流比：30∶1；流量：1.2 mL/min；进样量：2 μL；载气：高纯氦气（纯度 > 99.999%）。

2.1.5 益智仁挥发油的GC-MS分析

按照上述分析条件对益智仁挥发油的化学成分进行定性分析，采集益智仁挥发油的总离子流图。典型总离子流图色谱图信息量丰富，各色谱峰分离度良好，见图 1。通过NIST 17.L质谱数据库进行检索，以正向和反向匹配度均≥800为标准，并结合相关文献^[9-10]，从12批益智仁挥发油中共鉴定出50个化学成分，其中15个为共有成分，具体信息见表 2。将12批次挥发油中50个化学成分的峰面积标准化后绘制为热图，并采用峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量，将主要共有成分相对百分含量绘制为堆积直方图，结果详见图 2。巴伦西亚橘烯（12%~18%）、圆柚酮（9%~15%）、nootkatene（5%~9%）和蓝桉醇（5%~12%）在12批次中相对含量均较高且稳定，约占挥发油总量的40%，为益智仁挥发油中主要共有成分。

2.2 益智仁挥发油的网络药理学研究 2.2.1 化合物靶点预测

基于益智仁挥发油化学成分分析结果，通过SwissTargetPrediction数据库（https://www.swisstargetprediction.ch/）并结合TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/）对15个共有成分的靶点进行预测，共富集得到231个靶点。通过网络节点贡献度对其进行初步评估，为了精简网络，选取了相对含量较高、代表性较强、网络贡献度较大的4个主要共有成分，即巴伦西亚橘烯、圆柚酮、nootkatene和蓝桉醇作为候选质量标志物进行重点分析^[11]。候选质量标志物共富集138个靶点，去除重复后，使用UniProt数据库（https://www.uniprot.org）对靶点名称进行规范化处理，最终得到95个蛋白质靶点。

2.2.2 PPI网络的构建

将筛选出的95个靶点导入STRING 12.0数据库（http://string-db.org/cgi/input.pl）进行PPI分析，设置物种为“Homo sapiens”，蛋白交互分数（interaction score）阈值设定为大于0.4，其余参数保持不变，获得PPI网络图，并导出蛋白交互信息。通过Cytoscape 3.9.1对其进行网络可视化，并利用其中的“Network Analyzer”功能对结果进行拓扑学属性分析，以度值（degree）大于两倍中位数、介数中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）大于中位数作为核心靶点的评判标准。根据拓扑参数的度值设定节点大小，度值越大，节点越大（见图 3），最终筛选得到16个核心靶点，具体信息见表 3。

2.2.3 基因本体（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

通过DAVID数据库6.8（https://david.ncifcrf.gov/）对16个核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以显著水平P≤0.01对通路及功能进行筛选。GO分析共得到47个条目，其中生物过程（BP）占18条，细胞组成（CC）占2条，分子功能（MF）占27条；KEGG分析富集了10条通路。选取部分显著性强的条目进行展示，将结果载入R语言4.2.1，利用ggplot2绘制气泡图进行可视化展示。GO分析和KEGG分析的详细结果见图 4。

这些靶点在生物过程中参与了RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调节和负反馈、类固醇激素受体信号通路以及细胞对雌二醇和雌激素的反应等活动；在细胞组成上涉及染色质和线粒体；在分子功能上与相同蛋白质结合、RNA聚合酶Ⅱ与DNA的特异性识别和结合、转录因子与DNA的特异性识别和结合、酶结合、锌离子结合、DNA结合和雌激素反应元件结合等多种功能相关。

KEGG富集通路主要涉及癌症、神经系统、内分泌系统3个方面，癌症通路包括化学致癌-受体活化、癌症通路以及乳腺癌；神经系统涉及血清素能突触；内分泌系统涉及催乳素信号传导、雌激素信号通路以及卵巢类固醇的生成；此外，还与乙醇成瘾性、可卡因成瘾性及药物代谢-细胞色素P450存在有一定关联。

2.2.4 构建“成分-靶点-通路”网络

利用Cytoscape 3.9.1将筛选得到的4个成分、16个核心靶点和10条通路构建益智仁挥发油的“成分-靶点-通路”网络，结果见图 5，网络中的节点分别代表成分、靶点和通路。研究表明，各成分作用于多个靶点，并在多个通路上发挥不同的治疗作用，这与中医药的“多成分、多靶点”整体作用特点相符。其中，圆柚酮（degree=12）和巴仑西亚橘烯（degree=10）对网络的贡献度较高，nootkatene（degree=5）和蓝桉醇（degree=3）对网络的贡献度较小。进一步通过对节点的网络拓扑学分析发现，圆柚酮和巴仑西亚橘烯作用范围广泛，可通过靶点作用于预测的所有通路。

2.3 分子对接验证

通过PubChem数据库下载圆柚酮和巴伦西亚橘烯的sdf结构文件，通过OpenBabel 2.4.1软件将其转换为pdb格式。通过PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载排名前五的核心靶点蛋白的pdb格式，包括ESR1（PDBID：3UUD）、PTGS2（PDBID：5F19）、MAPK3（PDBID：3FHR）、DRD2（PDBID：5AER）和MAOB（PDBID：2C67）。采用AutoDock Tools 1.5.7软件对化合物进行加氢、扭转键检测等处理后保存为pdbqt格式；类似地，使用AutoDock Tools 1.5.7结合Pymol 4.6.0软件，对蛋白质进行去水、加氢、计算电荷等操作，并保存为pdbqt格式。使用Autodock Vina 1.2.5软件对化合物与靶点蛋白进行对接，并通过Pymol 4.6.0软件对结果进行可视化分析。

化合物与靶点蛋白的最低结合能小于0时，表明配体化合物与受体蛋白能够自发结合，而如果最低结合能小于-5 kcal/mol，则说明配体化合物与受体蛋白结合较为紧密^[12]。对接结果见表 4，圆柚酮、巴仑西亚橘烯与核心靶点蛋白的结合能均低于-5 kcal/mol，表明两者均与靶蛋白结合较为紧密。选取部分对接结果进行展示，具体的结合位点及相互作用力的结果见图 6。圆柚酮和巴仑西亚橘烯与核心靶点的结合能差异较小，但两者在结合口袋位置和结合键数量上存在差异。笔者认为这种差异主要源自化合物的结构特征，尤其是取代基的电子效应和空间位阻等因素。结合能差异较小可能因为两个化合物具有相同的母核，而对接模式差异性大的原因更多体现在圆柚酮中羰基的吸电子效应。值得注意的是，圆柚酮和巴伦西亚橘烯与靶点蛋白的对接主要依赖于疏水相互作用，而非氢键作用。

3 讨论 3.1 益智仁挥发油化学成分研究

挥发油的常见提取方法包括水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、压榨法、超临界流体萃取法等。在这些方法中，水蒸气蒸馏法由于技术成熟且易于放大生产，仍然是目前最为主流的提取方式。本实验采用水蒸气蒸馏法提取益智仁挥发油，并通过GC-MS分析鉴定出50个化学成分，主要为倍半萜类化合物，其中15个为共有成分。巴伦西亚橘烯（12%~18%）、圆柚酮（9%~15%）、nootkatene（5%~9%）和蓝桉醇（5%~12%）4个成分在各批次中相对含量较高且稳定，为益智仁挥发油的主要共有成分。进一步分析表明，各批次的共有成分比例较低，可能由以下几个原因造成。首先，不同产地的益智仁挥发油成分存在差异。其次，样品的采收时间、处理方法、储存和运输条件等因素可能影响挥发油成分。此外，微量成分的含量波动也可能导致共有成分的差异。在分析的过程中，背景的干扰可能导致部分成分匹配度较低，造成部分共有成分被错误排除。因此，应尽可能优化GC-MS数据库匹配，以提高共有成分的鉴定率。

3.2 益智仁挥发油核心靶点分析

从传统意义上讲，益智作为补阳药之一，具有温补脾肾的功效。在临床应用中，益智仁挥发油被认为具有改善认知功能、脑保护和抗氧化的作用，广泛应用于阿尔茨海默病（AD）和帕金森综合征（PD）的研究。根据KEGG通路富集结果，并结合益智仁挥发油的传统功效及临床应用，从神经系统、内分泌系统和癌症3个方面对核心靶点进行了分析。

在神经系统方面，多巴胺受体（DRD2）的表达对多巴胺信号通路的激活至关重要。单胺氧化酶（MAOA和MAOB）在体内生物胺的代谢中起关键作用，调节大脑神经递质水平，其中MAOB已成为阿尔茨海默病等神经退行性疾病重要干预靶点^[13]。AD的特征是淀粉斑块（Aβ）和过度磷酸化的神经纤维缠结在大脑中的积聚，核受体PPARA能调控糖脂代谢和炎症过程中的基因表达，是Aβ清除过程中自噬的关键调控因子^[14]。因此，益智仁挥发油在神经系统的作用靶点与其临床应用密切相关。

在内分泌系统及癌症方面，雌激素受体ESR1和ESR2共同参与体内雌激素水平的调控，关键酶芳香化酶（CYP19A1）在雌激素合成中同样发挥重要作用。有研究表明，雌激素缺乏可能干扰神经纤维缠结的延伸，进而增加患AD的风险^[15]，而过量的雌激素水平亦是罹患乳腺癌的重要决定性因素^[16]。环氧合酶-2（PTGS2）不仅促进雌激素合成^[17]，还可促进癌细胞的增殖、血管生成、炎症反应、侵袭和转移^[18]。丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）能够通过上下游信号级联反应抑制PTGS2的过表达，在癌症治疗中发挥重要作用。此外，DRD2在乳腺癌程序性细胞凋亡过程中也起着关键作用^[19]。研究表明，多种中药挥发油对乳腺癌具有治疗作用，益智仁挥发油也可能具有潜在的治疗价值，但由于癌症相关通路的靶点覆盖范围广泛，仍需进一步研究^[20]。

3.3 益智仁挥发油质量标志物筛选

益智仁挥发油具有神经保护、抗癌等多种药理活性。研究表明，益智仁挥发油能有效改善PD小鼠的运动协调性和学习记忆能力，可能通过抑制MAOB活性、提高脑内单胺类神经递质水平、减轻氧化应激反应、减少神经元凋亡等途径实现神经保护作用^[21-22]。此外，益智仁挥发油还通过调节乙酰胆碱酯酶（AchE）和胆碱转移酶（ChAT）来增加胆碱能神经活性，从而有效改善学习障碍小鼠的学习记忆能力^{[2, 23]}。此外，益智仁挥发油对多种癌细胞也表现出细胞毒作用^[24]。

巴伦西亚橘烯和圆柚酮均具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗肿瘤和心脏保护等多种药理活性^[25]。例如，巴伦西亚橘烯能够抑制卵巢癌细胞和淋巴母癌细胞的增殖^[26]；圆柚酮通过激活AMPK通路调节乳腺癌干细胞（MCF-7SCs）的葡萄糖代谢，降低其干性特征^[27]。此外，圆柚酮还具有神经保护的特性^[28]。He等^[29]通过评估AD小鼠行为学表现和病理学变化水平及脑内生化指标发现，圆柚酮能有效改善AD小鼠的神经行为表现，减少神经细胞的损伤，降低脑内丙二醛、Aβ和AchE水平，表明其改善AD小鼠记忆障碍的机制可能与抗氧化、抑制AchE活性以及抑制Aβ积累有关。Wang等^[30]发现圆柚酮可有效降低AD小鼠海马区高表达的炎症因子，其可能通过NF-κB-p65和NLRP3通路减弱神经炎症反应来改善学习记忆能力。在PD的相关研究中，圆柚酮能通过激活PI3K/Akt信号通路抑制MAPK3蛋白的表达，从而减轻神经炎症反应，减缓PD大鼠症状和脑组织损伤^[31]。

巴伦西亚橘烯和圆柚酮在所测益智仁挥发油中相对含量均较高（＞9%），且其药理作用与益智仁挥发油的药理作用相符合，推测巴伦西亚橘烯和圆柚酮可能是益智仁挥发油发挥药理作用的主要物质基础，与益智仁挥发油功效属性密切相关。由于巴伦西亚橘烯和圆柚酮兼具可测性和有效性，建议将其作为益智仁挥发油的质量标志物。

综上所述，本实验以益智仁挥发油化学成分研究为基础，结合网络药理学的分析方法，构建了益智仁挥发油“成分-靶点-通路”作用网络，并通过分子对接进行验证，最终预测出其潜在的质量标志物。通过文献佐证，建议将巴伦西亚橘烯和圆柚酮作为益智仁挥发油质量控制指标。通过对质量标志物的深入分析，有助于更好地理解和掌握益智仁挥发油的关键药效成分，确保其在传统和现代临床应用中的有效性、稳定性和质量可控性，为益智仁挥发油质量控制及后续研究提供重要参考。