辅料是指药品当中除主药以外的非活性成分。辅料种类多样，更多的研究已表明其与药物活性成分可能会发生一些物理、化学等反应，从而可能导致对药物的安全性和有效性等产生不利影响^[1-2]。药用辅料及其当中含有的杂质与药物活性成分在物理、化学、生物等方面的这种相互作用称为药用辅料与药物间的相容性，即原辅料相容性，开展相容性研究已经成为新药研发当中的一项重要内容^[3-4]。目前，国内外药品监管机构均高度重视相容性研究，但是各国的相容性研究方法的指导原则还不完善。人用药品技术要求国际协调理事会（ICH）在指导原则Q8（R2）中提出，在药物研发阶段需要开展相容性研究^[5]。中国国家药品监督管理局在发布的《化学药物制剂研究基本技术指导原则》^[6]中明确了相容性研究的必要性，并以口服固体制剂为例，说明相容性研究的药辅用量比例和研究方法等内容，为原辅料相容性研究提供了方向。国家药典委员会也出台了《药用辅料与药物相容性研究指导原则》（征求意见稿）^[7]，将相容性研究分为物理相容性、化学相容性、生物安全相容性3个方面，其中物理相容性研究方法以《药用辅料功能性指标研究指导原则》形式收录在《中华人民共和国药典》2020年版四部指导原则中。

目前，相容性研究最常采用的方法是高效液相色谱法（HPLC）、差示扫描量热法（DSC）、傅里叶变换红外光谱法（FTIR）、X射线粉末衍射法（XRPD）等^[8-15]。另外，核磁共振（NMR）、液质联用技术（LC-MS）等已用于研究药物辅料相互作用机制，鉴定作用产物^[4]。近年来基于机器学习的人工智能技术应用到相容性预测研究，极大提高了相容性研究的全面性、准确性和效率^[16-18]。但是目前的相容性研究多用于分析辅料对化学药单一成分的影响，而关于中药原料的相关研究十分少。

二至方出自明代《扶寿精方》，由墨旱莲和酒女贞子组成，具有滋补肝肾、滋阴止血、壮筋骨、乌须发等功效，用于治疗妇科、肝病、肾病、骨质疏松、脱发等疾病^[19-21]。在中药制剂特别是颗粒剂当中，麦芽糊精和糊精常作为填充剂，二氧化硅常作为助流剂，三氯蔗糖和枸橼酸通常作为矫味剂。笔者拟开展上述常用辅料与二至方提取物原料的相容性研究。本实验尝试采用人工智能预测与HPLC、DSC、FTIR、XRPD多方法实测相结合的研究模式，以二至方提取物原料中化学成分特女贞苷为指标，探索考察原辅料相容性，阐明中药制剂常用辅料对中药原料的相容性影响，验证理论预测对相容性研究工作的作用，为中药原辅料相容性方法学、中药新药研发过程中辅料选择提供理论参考。

1 仪器和材料

FA124型万分之一天平（天津亿诺科学仪器有限公司）；AX224ZH型万分之一天平（常州奥豪斯仪器有限公司）；YP5001N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）；XP-205型十万分之一天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-400KDE型舒美高功率数控超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司）；1260型高效液相色谱仪（DAD检测器，美国安捷伦公司）；Millipore-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）；KMF240型恒温恒湿箱（德国宾得）；ICH260型恒温恒湿箱（德国美墨尔特）；BGZ-140型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；DSC3500型差式扫描量热仪（德国耐驰公司）；Bruker D8 advance X射线粉末衍射仪（德国布鲁克）；TENSOR//傅里叶变换红外光谱仪（德国布鲁克）。

二至方提取物（天津中医药大学实验室自制）；三氯蔗糖（批号：20220701，江西阿尔法高科药业有限公司）；枸橼酸（批号：20211201，成都华邑药用辅料有限公司）；二氧化硅（批号：220416，安徽山河药用辅料有限公司）；麦芽糊精（批号：10221101，山东聊城鲁西药用辅料有限公司）；糊精（批号：220804，安徽山河药用辅料有限公司）；溴化钾（KBr，光谱纯，天津光复科技发展有限公司）；特女贞苷对照品（批号：111926-201906，含量≥95%，中国食品药品检定研究院）；色谱级甲醇（天津康科德试剂公司）；娃哈哈纯净水。

2 方法与结果 2.1 相容性预测研究

PharmDE网站（https://pharmde.computpharm.org/home/index）由澳门大学欧阳德方教授团队开发，从228篇文章筛选出532条数据，并根据知识和处方研究经验形成了60条药物-辅料相互作用规则，最终基于数据库检索和相互作用规则构建了药物-辅料相容性预测平台^[18]。

首先在PubChem数据库输入特女贞苷的CAS号（39011-92-2），经查询得到特女贞苷的SMILES（C/C=C/1\\[C@@H]（C（=CO[C@H]1O [C@H]2[C@@H]（[C@H]（[C@@H]（[C@H]（O2）CO）O）O）O）C（=O）OC）CC（=O）OC[C@@H]3[C@H]（[C@@H]（[C@H]（[C@@H]（O3）OCCC4=CC=C（C=C4）O）O）O）O）。登录PharmDE网站，采用处方风险预测功能，在药物栏输入特女贞苷的SMILES，在辅料栏依次选择不同辅料，进行预测。预测结果显示，特女贞苷与二氧化硅、枸橼酸的相容性风险等级分别为中、高风险。糊精、麦芽糊精和三氯蔗糖未收载在网站中。

2.2 相容性实测样品制备方法

中药原辅料相容性样品制备方法参考国家药品监督管理局发布的《化学药物制剂研究基本技术指导原则》^[6]。本实验中，三氯蔗糖、枸橼酸、二氧化硅用量较少，二至方提取物原料与辅料的处方考察比例是20∶1；麦芽糊精、糊精等稀释剂用量较大，二至方提取物原料与辅料的处方考察比例是1∶5。将二至方提取物原料分别与上述辅料按表 1所述比例，以等量递增法依次进行混合，其中，混合比例指的是质量比（W/W），得到相容性研究样品。同时分别以二至方提取物、单一辅料以及所有辅料混合物作为原料对照、单一辅料对照、所有辅料对照。

2.3 相容性HPLC实测研究

相容性HPLC实测研究考察二至方提取物原料与不同辅料的处方组合，分别在高温、高湿、光照条件下的特女贞苷成分含量变化，用于评价不同辅料对特女贞苷的影响。

2.3.1 特女贞苷HPLC含量测定方法

采用HPLC法测定相容性研究样品中特女贞苷的含量，相关供试品溶液和对照品溶液的制备方法，色谱条件如下。

2.3.1.1 供试品溶液的制备

以相容性研究编号13为例，取样品3.0 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入40%甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率400 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用40%甲醇补足减失的质量，用0.22 μm的微孔滤膜过滤后即得，其他样品的称取量根据混合比例而定。

2.3.1.2 对照品溶液的制备

取特女贞苷对照品适量，精密称定，加40%甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液。

2.3.1.3 色谱条件

色谱柱选用Agilent ZORBAX SB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦公司），流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温40 ℃，检测波长224 nm，以纯水为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱程序：0~20 min，以65%A进行等度洗脱。

2.3.2 高温相容性研究

称取表 1中相容性研究样品粉末和对照样品粉末适量，置于干燥的开口玻璃器皿中，厚度不超过3 mm，放置在60 ℃、15% RH的恒温恒湿箱中，分别于0、5、10、30 d取样，HPLC法测定特女贞苷的含量。

提取物以及提取物与辅料的混合物在高温下的特女贞苷含量变化情况见图 1。每个数据点由3个平行测定的数据组成，求取含量均值并计算含量均值的变化。《中华人民共和国药典》2020版四部^[22]的9001原料药物与制剂稳定性实验指导原则中指出，一般当含量与初始值相差5%，则认为制剂质量发生了“显著变化”。结果显示，提取物原料对照样品中特女贞苷含量在第30天下降了7.34%；提取物原料分别与三氯蔗糖、枸橼酸、糊精的处方组合样品中特女贞苷含量在第30天分别下降了13.61%、17.52%、11.35%；提取物原料分别与二氧化硅、麦芽糊精处方组合中特女贞苷含量在第30天分别变化了-3.53%、-5.97%；提取物原料与所有辅料的处方组合在第30天特女贞苷含量下降了13.35%。由此可以看出，二氧化硅、麦芽糊精与提取物原料的处方组合在高温下较稳定，而其他辅料特别是枸橼酸与提取物原料的混合物在高温下不稳定。

2.3.3 高湿相容性研究

称取表 1中相容性研究样品粉末和对照样品粉末适量，置于干燥的开口玻璃器皿中，厚度不超过3 mm，放置在温度25 ℃、75% RH的恒温恒湿箱中，分别于0、5、10 d取样，测定样品特女贞苷成分含量。

提取物以及提取物与辅料的混合物在高湿下特女贞苷含量变化情况见图 2。每个数据点由3个平行测定数据组成，求取含量均值并计算含量均值的变化。结果显示，提取物原料分别与三氯蔗糖、糊精的处方组合样品中特女贞苷含量均值在第10天分别下降了5.69%、7.44%；而提取物原料自身以及与其他辅料的处方组合中特女贞苷含量均值变化均小于5%。说明提取物原料分别与三氯蔗糖、糊精的混合物在高湿下不太稳定，需要注意湿度的控制。

2.3.4 光照相容性研究

称取表 1中相容性研究样品粉末和对照样品粉末适量，置于干燥的开口玻璃器皿中，厚度不超过3 mm，放置在温度25 ℃、30% RH、照度为5 000 Lux的恒温恒湿箱中，分别于0、5、10 d取样，测定特女贞苷成分含量。

提取物以及提取物与辅料的混合物在光照下的特女贞苷含量变化情况见图 3。每个数据点由3个平行测定的数据组成，求取含量均值并计算含量均值的变化。结果显示，所有样品在第10天特女贞苷含量均值变化均小于5%，说明提取物原料以及与辅料的混合物在光照下较稳定。

2.4 相容性DSC实测研究

分别取提取物原料、辅料和第0天的处方组合物以及高温第10天条件下的处方组合物进行DSC测试。测定条件：参比物采用空铝坩埚，气氛为氮气，升温范围为20~400 ℃，升温速率为10 ℃/min，称量范围1~5 mg。

DSC测试可以反映原辅料混合前后热力学性质的变化，具体体现为峰形、峰位等变化。具体结果见图 4，每个曲线右侧的数字代表着相容性样品编号，如表 1所示，H开头的编号指高温第10天提取物与辅料的混合物，例如图 4A所示，2指辅料三氯蔗糖，1指二至方提取物，8指第0天两者的物理混合物，H8指高温第10天三氯蔗糖和二至方提取物的混合物。提取物原料本身在79.67 ℃有1个吸热峰，在207.83、335.79 ℃处有两个放热峰；提取物原料分别与三氯蔗糖、枸橼酸、二氧化硅混合后，DSC特征峰与提取物原料特征峰基本保持一致，说明上述辅料对提取物整体的热力学性质没有影响；与麦芽糊精、糊精、所有辅料混合之后，DSC特征峰与相应辅料基本一致，并没有新的特征峰出现。另外，第0天和高温第10天处方组合的DSC特征峰基本一致，说明样品经过高温处理10 d后，整体的热力学性质没有发生改变，通过DSC可以看出提取物原料与上述辅料整体上相容性较好。

2.5 相容性FTIR实测研究

分别取提取物原料、辅料和第0天的处方组合物以及高温第10天条件下的处方组合物进行FTIR测试。采用压片法制备红外测试样品，首先将KBr颗粒进行干燥处理备用，取适量的待测样品与KBr颗粒于玛瑙研钵中，KBr与样品的比例约为150∶1，朝一个方向一直研磨至KBr颗粒成细小均匀的粉末，填充到模具中进行压片，压力24 MPa，时间1 min，得到均一、透明的片体。测试条件：光谱扫描范围为4 000~400/cm，扫描次数为16次，光谱分辨率为4/cm。

FTIR结果显示，每个曲线右侧的数字的意义与DSC相同，见图 5。提取物原料在3 424/cm处、2 927/cm处、1 715/cm处、1 628/cm处、1 384/cm处、1 049/cm处有特征峰，推测分别是缔合羟基的伸缩振动、烷烃C-H伸缩振动、酮羰基的伸缩振动、烯烃碳碳双键的伸缩振动或者共轭羰基的伸缩振动、甲基的弯曲振动、苯环C-H的面内弯曲振动、醚键C-O-C的对称伸缩振动或醇的C-O的伸缩振动。图 5A、5B、5C显示，第0天与第10天的各处方组合物特征峰与提取物原料保持一致；图 5D、5E、5F显示，第0天和第10天各处方组合物特征峰与相应辅料的峰位保持一致。由此可见原辅料混合前后，整体的化学键性质没有发生较大变化，原辅料相容性较好，高温10 d的原辅料相容性也没有发生显著变化。

2.6 相容性XRPD实测研究

分别取提取物原料、辅料和第0天的处方组合物以及高温第10天条件下的处方组合物进行XRPD测试。测定条件：采用广角衍射测试，Cu靶（λ=1.540 6?魡），管电压40 kV、管电流40 mA，连续扫描，步长0.020°，扫描范围2θ=15°~70°，扫描速度4°/min。

XRPD结果显示，每个曲线右侧的数字的意义与DSC相同，见图 6。结果显示，提取物原料在28.305°、40.475°处有两个较强的衍射峰，29.413°、50.139°、66.393°处有3个较弱的衍射峰。提取物原料与三氯蔗糖、枸橼酸、二氧化硅混合后，第0天样品中原料的5个衍射峰依旧存在，且衍射峰的晶面间距与原料保持一致。提取物与麦芽糊精、糊精以及所有辅料混合后，第0天样品中对应原料中较弱的衍射峰部分消失，但是原料两个最强衍射峰的峰位以及峰的晶面间距均没有发生改变。高温处理10 d后，所有衍射峰强度均增加，考虑是高温提高了样品的结晶度导致的。通过XRPD测试发现辅料的加入对原料两个主要衍射峰没有影响，此外没有新的衍射峰出现，提示原辅料之间的相容性较好。

3 讨论 3.1 相容性实测与预测的对比分析

相容性预测显示，特女贞苷与辅料枸橼酸配伍属于高风险，与辅料二氧化硅配伍属于中风险。与预测结果相比较，实测结果有3个方面的发现：首先，HPLC实测枸橼酸在高温条件下能显著降低二至方提取物原料中特女贞苷含量，与相容性预测结果一致。原因可能是二至方提取物原料与枸橼酸配伍，使得原料中特女贞苷处于酸性环境下，内酯键发生裂解从而导致成分的降解^[23-24]。其次，HPLC实测显示二氧化硅能显著提高二至方提取物原料中特女贞苷的稳定性，与平台预测的中风险不一致。预测平台认为，二氧化硅表面有极性基团羟基，可能会促使特女贞苷的酯键水解，不过特女贞苷的反应活化能较高（105.24 kJ/mol）^[23]，在相容性考察条件下难以越过能量壁垒，降解化学反应未发生。再次，预测平台未收载糊精、麦芽糊精和三氯蔗糖，需要实测数据来进一步充实完善。例如，麦芽糊精和糊精是两种十分常用的填充剂，虽然都是淀粉的不完全水解产物，但是HPLC实测显示两者对二至方中特女贞苷的影响却是有差异的，麦芽糊精能够抑制特女贞苷的降解，可能与麦芽糊精中还原糖含量高有关^[25-27]。最后，相容性预测研究与实测形成相互补充和验证，为中药原辅料相容性研究提供了一个很好的研究思路。

3.2 中药原辅料相容性研究方法的适用性

当前相容性研究有多种方法，但每种方法都有一定的局限性。比如采用HPLC法能够准确测量出中药原料中成分的含量变化，专属性强，但是由于中药的复杂性，无法表征出中药原料整体的变化。在本实验中，特女贞苷成分含量的下降并没有影响中药原料整体的热力学性质、化学键性质、结晶性质，DSC、FTIR和XRPD的结果证明了这一点。因此，中药原辅料相容性研究应该结合多种方法，从物理、化学多个层面进行综合考察。未来还应该针对化学成分的变化，采用液质联用、核磁等技术鉴定出相容性反应产物，阐明辅料与成分的反应机制，为中药新药处方辅料选择提供更深入的理论依据。

4 结论

处方中辅料的确定，不仅要考虑辅料对制剂成型性的重要作用，更要考虑辅料对处方中成分的稳定性、口感、溶出等因素，是一个多方面综合考量的结果。药辅相容性研究是根据相容性研究相关的指导原则，以极端的药辅比例开展的药物与辅料的相互作用关系研究，加大辅料与原料相互作用程度，从而发现辅料对处方的风险，是处方中辅料确定的重要依据之一。三氯蔗糖、糊精在高温、高湿条件下显著影响二至方提取物中的特女贞苷，引起成分降解。然而二氧化硅和麦芽糊精的加入可以显著提高特女贞苷的稳定性，二至方拟采用处方（表 1中样品13）中辅料是三氯蔗糖、糊精与二氧化硅、麦芽糊精的混合辅料，其相容性显著优于三氯蔗糖、枸橼酸单一辅料处方。三氯蔗糖和枸橼酸作为常用的矫味剂，可改善中药口感，提高患者依从性，同样对处方具有重要作用。本研究显示，辅料种类和药辅比例是影响相容性的重要因素，在某种高辅料含量比例下（例如表 1中样品9）相容性风险可能较高，而在拟采用处方的低辅料含量比例下相容性则没有风险，可见全面系统优选辅料的种类和用量，才能保证高质量的制剂。