2025, Vol. 42文章信息
- 韩朵, 田菲, 石书玮, 等.
- HAN Duo, TIAN Fei, SHI Shuwei, et al.
- 艾迪注射液通过ADAMTS8调控β-catenin/c-Myc通路增强宫颈癌细胞放疗敏感性并抑制其迁移研究
- Aidi Injection enhances radiosensitivity and inhibits migration of cervical cancer cells by regulating ADAMTS8-mediated β-catenin/c-Myc pathway
- 天津中医药, 2025, 42(8): 1046-1052
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(8): 1046-1052
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.08.15
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文章历史
- 收稿日期: 2025-02-19
2. 华北理工大学附属医院中医科, 唐山 063000
据统计，全球每年宫颈癌新发病例数高达53万，死亡病例数高达27万[1-2]。在中国，宫颈癌每年新发病例数高达14万，死亡病例数高达3.7万[3-4]。放疗作为宫颈癌的主要治疗手段，可有效控制患者病情，但部分患者由于放射抵抗或个体差异，治疗效果不尽如人意[5]。
艾迪注射液是一种中药制剂，其可降低放化疗期间不良反应的发生率[6-7]。本课题组前期研究[8]结果显示，艾迪注射液可增加宫颈癌细胞的放疗敏感性，然而其提高放疗敏感性的分子机制尚未完全阐明。有研究报道，具有血小板反应蛋白1型基序8的ADAM金属肽酶（ADAMTS8）在肺腺癌[9]、乳腺癌[10]和脑胶质瘤[11]等恶性肿瘤中低表达，且调控癌细胞的侵袭、转移及凋亡。然而，关于ADAMTS8在宫颈癌中的表达及其对肿瘤迁移与放疗敏感性的作用机制尚未被深入研究。癌症基因组图谱（TCGA）及基因表达谱交互式分析（GEPIA）数据库中的宫颈癌数据分析结果显示，ADAMTS8在宫颈癌中的表达下调。本研究推测艾迪注射液可通过上调ADAMTS8抑制宫颈癌细胞迁移，增加其对放疗的敏感性，遂开展以下实验进行验证，以期为宫颈癌的治疗提供新的参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株及主要试剂正常人宫颈上皮HcerEpic细胞株购自美国ATCC细胞库；人宫颈癌SiHa和HeLa细胞株购自中国科学院上海细胞研究所。
1.1.2 药物与试剂艾迪注射液购自贵州益佰制药股份有限公司；Trizol试剂和逆转录试剂盒购自日本TAKARA公司；ADAMTS8和三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物、阴性对照质粒和沉默ADAMTS8的质粒购自上海吉玛制药技术有限公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL发光液、CCK-8试剂及结晶紫购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人ADAMTS8抗体，兔抗人GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）购自台湾亚诺法生技股份有限公司；兔抗人β-连环蛋白（β-catenin）抗体和兔抗人c-骨髓细胞瘤癌基因（c-Myc）抗体购自上海碧云天生物技术股份有限公司；Lipofectamine 3000购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.1.3 主要仪器3111型37 ℃细胞孵育箱购自美国赛默飞世尔科技公司；EnSpire型酶标仪购自美国PerkinElmer公司；CKX41型倒置显微镜购自日本奥林巴斯株式会社；LightCycler 480 Ⅱ型PCR仪购自于德国Roche公司；电泳仪电源及配套电泳槽购自韦克斯科技（北京）有限公司。
1.2 方法 1.2.1 TCGA及GEPIA数据库中宫颈癌数据下载及分析从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）中下载宫颈癌数据，包含宫颈癌组织样本306例，正常宫颈组织样本3例。用R4.4.1软件中“limma”包分析其差异表达基因。用GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn）分析ADAMTS8在宫颈癌中表达情况。差异表达基因标准为|log2差异倍数（FC）|＞1且P＜0.05。
1.2.2 细胞培养及CCK-8法检测细胞增殖情况取对数生长期的SiHa细胞株，按1×106个/孔接种至6孔板中。分别在含0、1、5、10、30和50 mg/mL浓度艾迪注射液的培养基中培养48 h；然后，添加CCK-8试剂10 μL继续培养，4 h后读取450 nm波长的酶标仪光密度（OD）值。细胞增殖抑制率（%）=[1-（OD药物-OD空白）/（OD对照-OD空白）]×100%。
1.2.3 细胞转染将对数生长期的SiHa细胞培养至50%~70%汇合度，按Lipofectamine 3000说明书操作，将阴性对照质粒或沉默ADAMTS8的质粒转染至细胞，孵育24 h后进行后续研究。
1.2.4 细胞处理及细胞克隆形成实验评估放疗敏感性取对数生长期的SiHa细胞株，按1×106个/孔接种至6孔板中。分别给予空白对照（对照组）、10 mg/mL浓度艾迪注射液（艾迪组）、10 mg/mL浓度艾迪注射液和阴性对照质粒（艾迪+si-NC组）、10 mg/mL浓度艾迪注射液和沉默ADAMTS8质粒（艾迪+si-ADAMTS8组）处理，培养24 h；然后，用医用直线加速器分别给予0、2、4、6和8 Gy照射剂量处理，继续培养15 h。取经上述处理的细胞，更换培养液后继续培养，直至肉眼可见细胞克隆。然后，用甲醇固定，结晶紫染色，在显微镜下观察并记录大于50个细胞的克隆数。细胞存活分数（SF）=照射后细胞形成克隆数/未照射细胞形成克隆数×100%。用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，计算平均致死量（D0）、准阈剂量（Dq）、外推数（N）和放射增敏比（SER）。
1.2.5 细胞处理及Transwell小室法检测细胞迁移能力取实验1.2.4中未用医用直线加速器处理的细胞，用医用直线加速器给予4 Gy照射剂量处理，培养15 h。然后，将细胞加至Transwell小室上层腔，培养24 h。用4%多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，在倒置显微镜下观察小室底部膜上迁移的细胞，随机选择3个视野，记录每个视野中细胞数，并计算平均值。
1.2.6 实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测ADAMTS8 mRNA水平取细胞，用TRIzol试剂提取总RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，用PCR仪扩增cDNA，反应体系为上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL和ddH2O 8.5 μL，反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。用2-ΔΔCt法计算ADAMTS8相对GAPDH的水平。引物序列：1）ADAMTS8上游引物：5'-AGCCAAGTACCAGTCATGCC-3'，下游引物：5'-CTCGGCAGAACAACTTGCAG-3'；2）内参GAPDH上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。
1.2.7 蛋白质免疫印迹法检测ADAMTS8、β-catenin和c-Myc蛋白水平取细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒定量；12.5%的SDS-PAGE，80~120 V电压至溴酚蓝跑出胶面；300 mA电流转膜2 h，脱脂牛奶室温震荡封闭1 h；一抗ADAMTS8、β-catenin、c-Myc和GAPDH，稀释比分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000和1∶5 000，4 ℃摇床孵育过夜；二抗，稀释比为1∶5 000，室温孵育2 h；ECL发光液显影。ImageJ 1.54g软件读取蛋白条带。计算ADAMTS8、β-catenin和c-Myc相对GAPDH的水平。
1.2.8 统计学分析用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x ± s）表示，组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ADAMTS8在宫颈癌中表达情况TCGA数据库中宫颈癌数据分析结果显示，宫颈癌组织中差异基因共5 796个，其中上调3 709个，下调2 087个（见图 1A）。与正常宫颈组织比较，ADAMTS8在宫颈癌组织中表达下调（log2FC=-4.155，P＜0.001）。GEPIA数据库分析结果亦显示，ADAMTS8在宫颈癌组织中表达下调（见图 1B）。
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| 注：图A，TCGA数据库中宫颈癌组织中差异基因；图B，GEPIA数据库中宫颈癌组织和正常宫颈组织中ADAMTS8基因表达量的比较结果；图C，各细胞株中ADAMTS8 mRNA水平比较；图D，各细胞株中ADAMTS8的蛋白质免疫印记图；图E，各细胞株中ADAMTS8蛋白水平比较。与HcerEpic比较，*P＜0.05。 图 1 ADAMTS8在宫颈癌中表达情况 Fig. 1 ADAMTS8 expression in cervical cancer |
实时荧光定量PCR实验结果显示，HcerEpic细胞株中ADAMTS8 mRNA水平高于SiHa细胞株和HeLa细胞株（P＜0.05，见图 1C）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，HcerEpic细胞株中ADAMTS8蛋白水平高于SiHa细胞株和HeLa细胞株（P＜0.05，见图 1D、图 1E）。上述结果说明ADAMTS8在人宫颈癌细胞株中表达下调。后续实验用SiHa细胞株进行研究。
2.2 艾迪注射液的实验浓度CCK-8实验结果显示，艾迪注射液浓度在0~10 mg/mL，细胞增殖抑制率增幅较大；在10~50 mg/mL，细胞增殖抑制率增幅较小（见图 2）。艾迪注射液的半数抑制浓度（IC50）为7.264 mg/mL。后续实验艾迪注射液浓度为10 mg/mL。
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| 图 2 不同浓度艾迪注射液对SiHa细胞增殖抑制率的影响 Fig. 2 Inhibitory effect of Aidi Injection on SiHa cell proliferation at varying concentrations |
实时荧光定量PCR实验结果显示，艾迪组的ADAMTS8 mRNA水平高于对照组；艾迪+si-ADAMTS8组的ADAMTS8 mRNA水平低于艾迪+si-NC组（P＜0.05，见图 3A）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，艾迪组的ADAMTS8蛋白水平高于对照组；艾迪+si-ADAMTS8组的ADAMTS8蛋白水平低于艾迪+si-NC组（P＜0.05，见图 3B、图 3C）。上述结果说明艾迪注射液可使SiHa细胞中ADAMTS8 mRNA及蛋白表达上调；沉默ADAMTS8成功，可用于后续实验。
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| 注：图A，各组细胞中ADAMTS8 mRNA水平比较；图B，各组细胞中ADAMTS8的蛋白质免疫印记图；图C，各组细胞中ADAMTS8蛋白水平比较；图D，各组细胞的克隆形成实验结果；图E，单击多靶模型拟合对照组和艾迪组的细胞存活曲线；图F，单击多靶模型拟合艾迪+si-NC组和艾迪+si-ADAMTS8组的细胞存活曲线；图G，照射剂量为2 Gy时，各组细胞中β-catenin和c-Myc的蛋白质免疫印迹图；图H，照射剂量为2 Gy时，各组细胞中β-catenin和c-Myc蛋白水平比较。与对照组比较，*P＜0.05；与艾迪组比较，#P＜0.05；与艾迪+si-NC组比较，△P＜0.05。 图 3 艾迪注射液及沉默ADAMTS8对SiHa细胞放疗敏感性的影响 Fig. 3 Effect of Aidi Injection and ADAMTS8 silencing on the radiosensitivity of SiHa cells |
克隆形成实验结果显示，照射剂量为2~8 Gy时，艾迪组的SF均低于对照组，艾迪+si-ADAMTS8组的SF均高于艾迪+si-NC组（P＜0.05，见图 3E、图 3F）。单机多靶模型结果显示，与对照组比较，艾迪组的SER为1.320；与艾迪+si-NC组比较，艾迪+si-ADAMTS8组的SER为0.746（见表 1）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，照射剂量为2 Gy时，艾迪组的β-catenin和c-Myc蛋白水平均低于对照组；艾迪+si-ADAMTS8组的β-catenin和c-Myc蛋白水平均高于艾迪+si-NC组（P＜0.05，见图 3G、图 3H）。上述结果说明艾迪注射液可增加SiHa细胞的放疗敏感性，沉默ADAMTS8可抑制艾迪注射液对SiHa细胞放疗增敏作用及对β-catenin和c-Myc下调作用。
| 组别 | D0（Gy） | Dq（Gy） | N | SF2（%） | SER |
| 对照组 | 1.546 | 2.300 | 4.426 | 75.47±3.33 | - |
| 艾迪组 | 1.171 | 1.697 | 4.261 | 57.41±2.71* | 1.320 |
| 艾迪+si-NC组 | 1.149 | 1.828 | 4.908 | 61.26±2.18* | - |
| 艾迪+si-ADAMTS8组 | 1.540 | 2.177 | 4.111 | 72.43±1.08#△ | 0.746 |
| 注：D0，平均致死量；Dq，准阈剂量；N，外推数；SF2，照射剂量为2 Gy时的细胞存活分数；SER，放射增敏比；-，无此项。与对照组比较，*P＜0.05；与艾迪组比较，#P＜0.05；与艾迪+si-NC组比较，△P＜0.05。 | |||||
Transwell小室实验结果显示，艾迪组的细胞迁移数低于对照组；艾迪+si-ADAMTS8组的细胞迁移数高于艾迪+si-NC组（P＜0.05，见图 4A、图 4B）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，照射剂量为4 Gy时，艾迪组的β-catenin和c-Myc蛋白水平均低于对照组；艾迪+si-ADAMTS8组的β-catenin和c-Myc蛋白水平均高于艾迪+si-NC组（P＜0.05，见图 4C、图 4D）。上述结果说明艾迪注射液联合4 Gy照射可抑制SiHa细胞迁移；沉默ADAMTS8可抵消艾迪注射液联合4 Gy照射对SiHa细胞迁移的抑制作用及对β-catenin和c-Myc下调作用。
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| 注：图A，倒置显微镜下各组的迁移细胞图像（×200，标尺：50 μm）；图B，各组的细胞迁移数比较；图C，照射剂量为4 Gy时，各组细胞中β-catenin和c-Myc的蛋白质免疫印迹图；图D，照射剂量为4 Gy时，各组细胞中β-catenin和c-Myc蛋白水平比较。与对照组比较，*P＜0.05；与艾迪组比较，#P＜0.05；与艾迪+si-NC组比较，△P＜0.05。 图 4 艾迪注射液及沉默ADAMTS8对SiHa细胞迁移的影响 Fig. 4 Effect of Aidi Injection and ADAMTS8 silencing on SiHa cell migration |
艾迪注射液由斑蝥、人参、黄芪和刺五加组成，具有清热解毒、消瘀散结作用可提高妇科肿瘤短期治疗疗效，并降低放化疗引起的骨髓抑制、肝肾功能损伤等不良反应发生率[12]，但其作用机制鲜有研究报道，尤其在宫颈癌治疗方面。本研究结果显示艾迪注射液可通过上调ADAMTS8抑制β-catenin/c-Myc通路，抑制宫颈癌SiHa细胞迁移，提高其放疗敏感性，而沉默ADAMTS8则削弱了上述作用。
ADAMTS8在多种恶性肿瘤中表达下调，并且与不良生存预后有关[13-14]。Zhang等[15]研究表明上调ADAMTS8表达可抑制肺腺癌细胞增殖并促进其凋亡，同时可抑制血管形成。Xiao等[16]研究表明ADAMTS8可靶向细胞外基质调控肺腺癌抗肿瘤免疫反应及预后。本研究结果显示，HcerEpic细胞株中ADAMTS8 mRNA及蛋白水平均高于SiHa和HeLa细胞株，与TCGA及GEPIA数据库中宫颈癌生物信息学分析结果相符，提示ADAMTS8在宫颈癌中表达下调，干扰其表达或可对抑制宫颈癌进展有益。
放疗是局部晚期宫颈癌的重要治疗方式之一，具有不可替代的作用。但部分患者对放疗耐受性较强，临床治疗效果不佳[17]。抑制癌细胞迁移能力，以及增加其放疗敏感性对于控制宫颈癌进展和提高患者生存率具有重要意义。β-catenin和c-Myc是Wnt/β-catenin信号通路中的关键调控蛋白，在宫颈癌中，β-catenin可通过调控c-Myc参与癌细胞的增殖、凋亡、迁移及化疗耐药等过程[18-21]。此外，在肺癌、胶质母细胞瘤和肝癌等恶性肿瘤中，β-catenin/c-Myc通路还参与癌细胞的迁移及放疗抵抗过程[22-25]。β-catenin和c-Myc在乳腺癌及结直肠癌等恶性肿瘤中还受到ADAMTS8的调控[13, 26]。本研究中，艾迪注射液联合4 Gy照射可抑制SiHa细胞迁移；沉默ADAMTS8可抵消艾迪注射液联合4 Gy照射对SiHa细胞迁移的抑制作用及对β-catenin和c-Myc下调作用。此外，艾迪注射液可增加SiHa细胞的放疗敏感性，沉默ADAMTS8可抑制艾迪注射液对SiHa细胞的放疗增敏作用及对β-catenin和c-Myc下调作用。上述结果说明艾迪注射液可通过上调ADAMTS8抑制β-catenin/c-Myc通路发挥抗癌细胞迁移及放疗增敏作用。
本研究局限性：1）本研究主要基于体外细胞实验分析艾迪注射液对宫颈癌细胞迁移及放疗增敏作用的影响，关于其在体内的作用仍需进一步实验研究。2）艾迪注射液可抑制宫颈癌细胞迁移及增强放疗敏感性，但其是一种复方制剂，包含多种活性成分，具体何种活性成分起作用，抑或是不同成分间相互作用，仍需进一步实验明确。3）本研究揭示了ADAMTS8及其下游通路β-catenin/c-Myc在宫颈癌中的重要作用，但ADAMTS8调控的下游分子通路较多，关于其对其他通路的调控作用仍不明确。课题组后续将针对上述不足进行深入探究。
综上所述，艾迪注射液通过上调ADAMTS8抑制β-catenin/c-Myc通路，抑制宫颈癌SiHa细胞迁移，并提高其放疗敏感性；而沉默ADAMTS8则削弱了这些作用。
2. Department of Traditional Chinese Medicine, North China University of Science and Technology Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China