脓毒症引起的急性肾损伤会导致高病死率、延长住院时间并增加治疗费用^[1]。目前关于脓毒症急性肾损伤临床依然没有特效治疗药物。因此，探索针对脓毒症引起的急性肾损伤新治疗和预防方法至关重要。据报道，炎症和细胞凋亡是导致急性肾损伤的重要发病机制^[2]。在脓毒症期间，肾脏的反复刺激会导致许多促炎细胞因子的产生^[3]。目前的研究表明，Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路是调控炎症和细胞凋亡的重要通路，并且已经被证实在脓毒症诱导的急性肾损伤中同样扮演重要角色^[4]。Hu等^[5]研究发现他克莫司可以通过干预TLR4/MyD88/NF-κB信号通路治疗脓毒症诱导的急性肾损伤。这表明在脓毒症诱导的急性肾损伤中干预TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制炎症和细胞凋亡可能是一个有效的治疗策略。

随着《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南（2014）》的发布，中药治疗首次被纳入脓毒症的治疗中^[6]。血必净注射液（XBJ）目前临床已经广泛用于脓毒症/因感染诱发的全身炎症反应综合征的治疗^[7]。吴丽红等^[8]研究的XBJ对脓毒症并发急性肾损伤疗效的Meta分析显示，XBJ有较好的抗炎、改善肾功能的效果，其与常规治疗联合应用，可以提高脓毒症并发急性肾损伤的疗效。但是关于XBJ治疗脓毒症诱导急性肾损伤的作用机制依然不清。笔者团队的前期研究发现XBJ可以通过调控TLR4/NF-кB信号通路改善脓毒症诱导心肌损伤的炎症和细胞凋亡^[9]。目前关于XBJ是否可以通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路改善脓毒症诱导急性肾损伤目前尚未见报道，因此，笔者拟通过盲肠穿孔结扎术（CLP）构建大鼠脓毒症诱导急性肾损伤模型，通过给予XBJ治疗后观察是否可以通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制炎症和细胞凋亡从而达到保护脓毒症诱导急性肾损伤的目的，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 动物动物

本研究所用成年雄性SD大鼠购买自宁夏医科大学实验动物中心。18只SD大鼠适应性观察结束后采用随机数字表法为3组：假手术组、模型组、血必净组，每组6只。

1.2 模型制备与给药

CLP制备脓毒症急性肾损伤模型方法为大鼠麻醉后下腹部采用电动剃毛器剔除毛后进行碘伏消毒。之后铺无菌洞巾后在腹部沿着正中线切开约2~3 cm切口以进入腹腔，使用非创伤钳分离取出盲肠，在盲肠长度50%处用4-0丝线结扎盲肠，并使用22G针头穿刺结扎盲肠，释放少量粪便后将盲肠放回腹腔，并逐层缝合切口。假手术组方法主要为开腹后不对盲肠进行穿孔结扎。血必净组大鼠在CLP术后1 h麻醉清醒后开始给予血必净尾静脉注射治疗（10 mL/kg），每12 h给药1次连续治疗2 d，假手术组和模型组大鼠给予等量生理盐水。XBJ主要由红花、赤芍、川芎、丹参和当归组成。药物购买于宁夏医科大学总医院（国药准字Z20040033，天津红日药业股份有限公司生产）。本研究获得了宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（KYLL-2021-667）。

1.3 肾脏指数

解剖前称量大鼠体质量并记录后获得肾组织，去除多余结缔组织后清洗，吸水纸吸干水分后称质量并记录。肾脏指数计算公式为：肾质量（mg）/体质量（g）×100%。

1.4 病理染色

大鼠肾组织固定包埋切片后按照苏木精-伊红（HE）染色试剂说明书（碧云天生物技术有限公司，货号：C0105S）对大鼠肾组织进行病理染色后在光镜下观察大鼠肾组织形态学变化（放大倍数为400倍）。

1.5 血清和尿液相关指标测定

大鼠取材前一晚使用代谢笼收集大鼠尿液样本在离心半径10 cm的离心机以3 500 r/min离心5 cm取上清液于-80 ℃冰箱保存备用；实验结束后大鼠麻醉采集大鼠心脏血液3 mL离心后分离血清，在离心半径10 cm的离心机以3 500 r/min离心10 cm取上清液于-80 ℃冰箱保存备用。肌酐（Cr，货号：RA20115），血尿素氮（BUN，货号：RA21054），肿瘤坏死因子α（TNF-α，货号：RA20035），白细胞介素-6（IL-6，货号：RA20607），中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL，货号：RA20783）和肾损伤分子1（Kim-1，货号：RA20306）浓度检测采用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法进行，所有试剂盒均购买自武汉贝茵莱生物公司。

1.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测

取不同组大鼠肾组织按照前期研究方法提取制备蛋白质样本，样本浓度定量到3 μg/μL。按照Western blot检测技术流程对p-NF-кB（抗体1∶1 000，货号：AF2006），NF-кB（抗体1∶1 000，货号：AF5006），MyD88（抗体1∶1 000，货号：AF5195），TLR4（抗体1∶1 000，货号：AF7017），B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2，抗体1∶1 000，货号：AF6139），Bcl-2相关X蛋白（Bax，抗体1∶1 000，货号：AF0120），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase 3，抗体1∶1 000，货号：AF6311），活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase 3，抗体1∶1 000，货号：AF7022）和三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）（抗体1∶15 000，货号：AF7021）的表达水平进行检测。二抗选择山羊抗兔IgG（H+L）HRP（抗体1∶5 000，货号：S0001）或者山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（抗体1∶5 000，货号：S0002）。ECL（货号：KF8003）发光液和抗体都购买于美国Affinity Biosciences公司。

1.7 统计分析

所有数据分析均使用GraphPad Prism 9软件进行，数据表示为至少3个独立实验的均数±标准差（x ± s）。数据采用方差分析，用LSD方法检验方差齐性，方差不齐用Tamhane’s T2检验。统计结果以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 XBJ对CLP诱导急性肾损伤的病理影响

假手术组大鼠肾组织HE染色结果显示未见明显异常病理学改变。模型组大鼠肾组织明显受损，出现水肿、炎性细胞浸润、及上皮细胞肿胀、变性、脱落等多种组织病理学改变。然而，XBJ治疗后减轻了肾脏的水肿和炎症浸润程度。见图 1。

2.2 XBJ对CLP诱导急性肾损伤大鼠肾功能及肾脏指数的影响

对各组大鼠血清中Cr和BUN表达水平进行了检测。结果表明与假手术组相比，模型组大鼠血清中Cr和BUN的表达水平明显升高（P < 0.05），而XBJ治疗降低了Cr和BUN的表达水平（P < 0.05）。肾脏指数结果也表明，与假手术组相比CLP组大鼠肾脏指数明显升高（P < 0.05），而给予XBJ治疗后可以降低大鼠肾脏指数（P < 0.05）。见表 1。

2.3 XBJ对CLP诱导急性肾损伤大鼠肾损伤标志物的影响

对各组大鼠尿液中NGAL和Kim-1表达水平进行了检测。与假手术组相比，模型组大鼠尿液中NGAL和Kim-1的表达水平明显升高（P < 0.05），而XBJ治疗降低了NGAL和Kim-1的表达水平（P < 0.05）。见表 2。

2.4 XBJ对CLP诱导急性肾损伤大鼠血清中TNF-α和IL-6表达水平的影响

对各组大鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-6表达水平进行了检测。结果表明与假手术组相比，模型组大鼠血清中TNF-α和IL-6的表达水平明显升高（P < 0.05），而给予XBJ治疗后降低了TNF-α和IL-6的表达水平（P < 0.05）。见表 3。

2.5 XBJ对CLP诱导急性肾损伤大鼠肾组织中凋亡相关蛋白表达的影响

与假手术组相比，CLP诱导的急性肾损伤大鼠肾组织中Bax和Cleaved Caspase 3蛋白表达增加，而Bcl-2蛋白表达明显降低（P < 0.05）。而给予XBJ治疗后可以明显降低Bax和Cleaved Caspase 3的表达水平，增加Bcl-2蛋白的表达水平（P < 0.05）。见图 2。

2.6 XBJ对CLP诱导急性肾损伤大鼠肾组织中TLR4/MyD88/NF-кB信号通路的影响

与假手术组相比，CLP诱导的急性肾损伤大鼠肾组织中TLR4、MyD88和p-NF-кB蛋白表达增加（P < 0.05），而给予XBJ治疗后可以明显降低TLR4、MyD88和p-NF-кB蛋白的表达水平（P < 0.05）。见图 3。

3 讨论

流行病学研究表明，约28.3%~41%的脓毒症住院患者死于多器官衰竭^[10]。肾功能不全是脓毒症的主要并发症之一，往往预示着不良的临床结果。因此，研究脓毒症致急性肾损伤的分子生物学机制，制定预防和治疗策略已成为危重医学领域的一个重要焦点。目前关于脓毒症诱导的急性肾损伤虽然在中医古籍中未见记载，但是现代中医名家根据疾病症状结合中医理论认为该病与“毒、瘀、虚、浊”密切相关^[11]。并且围绕相关理论应用对症中药制剂在脓毒症诱导的急性肾损伤患者治疗上取得了很好的疗效。研究发现黄连解毒汤治疗可以降低脓毒症诱导的急性肾损伤患者的炎症因子表达改善症状效果优于单纯西药治疗^[12]。XBJ具有活血化瘀、溃散毒邪和疏经通络的作用，它是在传统名方血府逐瘀汤的基础上改良研制而成。林传钦等^[13]研究发现XBJ治疗脓毒症诱导急性肾损伤疗效可靠，能抑制炎性因子，改善循环、呼吸功能，缩短重症监护室（ICU）住院时间，降低费用，提高疗效，降低28 d病死率。此外，宋永娜等^[14]研究发现XBJ与连续性肾脏替代治疗（CRRT）联合治疗脓毒症合并急性肾损伤患者效果良好，可改善患者凝血功能、肾功能、免疫功能，同时改善炎症反应并降低血清NGAL、金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）水平。张敏等^[15]基础研究发现XBJ可以通过减轻炎症反应从而减轻脓毒症诱导的急性肾损伤症状。在笔者的研究中表明，CLP构建的脓毒症急性肾损伤模型中出现了严重的肾损伤，血清Cr和BUN明显改变，尿中Kim-1和NGAL明显增加，同时肾脏指数也明显上升。而给予XBJ治疗后降低了血清中Cr和BUN的表达，也降低了Kim-1和NGAL在尿液中的表达水平。这进一步证明XBJ可以有效改善脓毒症诱导大鼠肾损伤程度，与前期他人研究结果一致^[15]。

研究表明TLR4是脂多糖（LPS）的受体，在由LPS诱导的脓毒症模型中TLR4是主要激活受体，在CLP诱导的脓毒症动物模型中TLR4同样可以被激活^[9]。通过CLP手术建立的脓毒症模型更加接近临床患者脓毒症发病情况，所以在脓毒症研究中通常采用CLP手术构建脓毒症动物模型。并且在笔者的研究中也表明TLR4被明显激活。目前研究表明TLR4与下游信号配体MyD88结合，然后激活NF-кB并形成TLR4/MyD88/NF-кB轴，进一步促进各种炎症介质的转录和释放，如TNF-α和IL-6等炎症因子，这种现象被称为细胞因子风暴^[16]。TNF-α和IL-6是重要的促炎细胞因子，也是急性肾损伤严重性的标志^[17]。郝书航等^[18]研究发现右美托咪定可以通过降低包括TNF-α和IL-6在内炎症因子表达水平，从而降低炎症反应达到缓解脓毒症诱导急性肾损伤的作用。此外，NF-кB磷酸化激活会发生核转位进一步促进了凋亡相关蛋白Bax的表达，抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而促进了细胞凋亡的发生^[19]。目前越来越多的证据表明，通过抑制TLR4/MyD88/NF-кB信号通路可以达到控制炎症和细胞凋亡的作用。史月欣等^[20]研究发现在脓毒症诱导的急性肾损伤中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被激活后促进了炎症和氧化应激反应，而给予芪黄解毒化瘀饮治疗后可以通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻炎症反应达到治疗脓毒症诱导急性肾损伤的作用。柴溥苒等^[21]研究也发现小青龙汤通过干预TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻炎症损伤程度从而达到治疗慢性肾小球肾炎的作用。此外，郭金明等^[22]研究也发现刺五加注射液可以通过干预TLR4/NF-κB信号通路抑制炎症和细胞凋亡改善糖尿病诱导的肾损伤严重程度。笔者发现在脓毒症诱导的急性肾损伤中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被激活后刺激炎症级联反应并导致了细胞凋亡的发生，给予XBJ治疗后可以通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路降低TNF-α和IL-6的表达水平，抑制炎症反应。此外，XBJ治疗后可以明显抑制凋亡相关蛋白Bax和Cleaved Caspase 3的表达水平，增加Bcl-2蛋白的表达水平，说明XBJ可以通过抑制细胞凋亡达到治疗脓毒症诱导的急性肾损伤。

综上所述，本研究发现XBJ连续治疗后可以缓解脓毒症诱导的急性肾损伤严重程度，改善肾功能，减轻病理性损伤程度，同时抑制了体内炎症因子表达和细胞凋亡程度，其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。但是XBJ作为中药注射制剂存在成分复杂，多靶点的治疗特点，后续围绕相关靶点通过基因编辑技术建立特异性脓毒症诱导急性肾损伤工具鼠，为明确其具体作用机制提供科学依据。