大肠癌（CRC）是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，包括结肠癌（CC）和直肠癌（RC），其起病隐匿，发病率和病死率逐年增高，发病率位列全球恶性肿瘤发病率第3位，病死率位列癌症相关死亡的第2位^[1]。在中国，大肠癌总体发病率约9.97%，位列第3位，仅次于肺癌（20.48%）、胃癌（10.61%）；大肠癌病死率约为7.86%，位列第5位^[2]。大肠癌严重影响了人民的生命健康，带来了严重生理、心理痛苦，因此，如何及早发现和干预大肠癌，以降低其发病率和病死率、提高患者生存质量一直是科研和医务人员研究的重点。

大肠腺瘤（CRAs）是大肠癌公认的、最常见的癌前病变，是大肠息肉（CRPs）的一种。CRPs是指起源于结直肠黏膜或黏膜下层、突出向腔内生长的良性上皮隆起性病变，包括结肠息肉（CPs）和直肠息肉（RPs）。从病理学的角度，大肠息肉分为非肿瘤性息肉和肿瘤性息肉^[3]。其中，CRAs性息肉是临床上最为常见、发病率最高的一种肿瘤性息肉，且癌变的风险也相对较高。Morson教授^[4]在1976年首次提出“息肉-腺瘤-腺癌”的病机演变学说后，越来越多的研究结果证实了这一观点。据流行病学统计^[5]，临床上约95%的大肠腺癌由CRAs癌变而来。因此，及早发现并治疗CRAs、预防其复发及癌变在大肠癌的早期诊治中扮演着重要角色。CRAs的常规治疗方法主要为内镜下治疗，包括内镜下活检钳钳除、氩离子凝固术（APC）、圈套器息肉切除术、射频消融、内镜下黏膜切除术（EMR）、内镜下黏膜剥离术（ESD）等^[6]；它们有着创伤小、操作简便、术后恢复快、经济成本低等优点，但临床医师也面临一些临床难题，如CRAs内镜治疗术后患者复发率高，目前尚缺乏公认的、疗效确切的药物用于预防CRAs复发。

中医强调“整体观念”，临床诊治中强调以“患者”为中心，在改善大肠腺瘤术后患者的临床症状、预防腺瘤复发、预防腺瘤癌变等方面有着良好的效果，在“未病先防”“既病防变”“瘥后防复”方面发挥着独特的优势。刘万里教授通过多年的临床诊治经验，总结出CRAs的发生及复发病机为“脾虚失运，湿毒内生，蕴结肠道”，并以此为理论基础，以已故名中医陈苏生著名药对“土忍翘薇”为基础加减，自拟健脾利湿解毒颗粒，其主要组成为党参、白术、土茯苓、忍冬藤、连翘、白薇。在临床上，运用健脾利湿解毒颗粒治疗CRAs内镜治疗术后的脾虚湿毒证患者，发现其不仅安全性高，并在改善患者术后临床症状、降低CRAs复发率方面展现了良好的效果。尤其是对患有数十枚甚至上百枚数量较多腺瘤且无法内镜下手术治疗的患者，屡见奇效^[7-8]。本研究收集了CRAs患者治疗前后的结肠组织，运用转录组学技术，进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，筛选关键差异基因及其可能作用的信号通路，并采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）法验证信号通路中相关基因和蛋白的表达，初探健脾利湿解毒颗粒的可能作用靶点，为临床应用提供科学依据。

1 材料 1.1 研究对象

收集2019年5月—2021年11月就诊于南京中医药大学附属南京市中西医结合医院脾胃病科门诊、病房及消化内镜中心，经电子肠镜及病理检验诊断为CRAs的患者。

样本量计算：据两样本率检验估算样本容量，检验水准为α=0.05，检验功效为1-β=0.9，故β=0.1。取α=0.05（双侧），β=0.1，Z_α/2=Z_0.05/2=1.96，Z_0.10=1.282，试验组及对照组的样本容量各占50%，则Q₁=Q₂=0.5。按既往文献CRAs复发率一般为30%左右（p₁≈0.30），对照组的CRAs复发率为40%左右（p₂≈0.40），据两样本率计算公式：

$ n=\frac{\left[\left[Z_{\alpha / 2} \sqrt{\left(p(1-p)\left(\frac{1}{Q_1}+\frac{1}{Q_2}\right)\right.}+\sqrt{\frac{p_1\left(1-p_1\right.}{Q_1}+\frac{p_2\left(1-p_2\right.}{Q_2}}\right]\right.}{\left(p_1-p_2\right)^2} $

最后的样本量n≈66，考虑到每组各约有15%的脱落率，最终样本量n=80，即试验组和对照组各40例。

1.2 中医辨证标准

参照《国家中医药管理局第2批24个专业105个病种中医诊疗方案》^[9]中“大肠息肉（结肠息肉）”部分以及《中药新药临床研究指导原则》^[10]中的相关证候论述，拟定脾虚湿毒证为本次研究的主题，其证候诊断标准如下。主症：大便不成形、黏液便或便秘，腹痛，腹胀，食欲不振，口干口黏；次症：神疲懒言，身重困倦，恶心欲吐，肠鸣；舌脉：舌质淡白或淡红，舌体胖大或有齿印，苔白腻或黄腻，脉象细弱、或细滑。证型判定标准：具备主症中的两项以上，次症中两项以上，符合舌脉即可确诊。

1.3 纳入标准

1）经肠镜及病理组织学检查符合西医CRAs诊断，被纳入前2周内行CRAs内镜下治疗（CRAs直径＜20 mm采用冷圈套器切除术或内镜下黏膜切除术，CRAs直径≥20 mm采用内镜下黏膜剥离术），且中医证型符合脾虚湿毒证患者。2）年龄18~75周岁，男女不限。3）患者充分知情同意，完全自愿接受观察，并签署知情同意书。

1.4 排除标准

1）不符合CRAs诊断标准或脾虚湿毒证的中医证候诊断标准。2）妊娠、哺乳期妇女或准备生育者。3）过敏体质或对多种药物过敏患者。4）合并有严重的心、肺、肝、肾、血液系统疾病患者。5）活检病理检查可疑癌变或已经发生癌变患者，或高级别上皮内瘤变发生血管或淋巴管转移的患者。6）正在服用药物或正在进行其他临床试验的患者。7）有严重身体残疾（如耳聋、失明、智力残疾、精神残疾等）而无法合作或不愿合作的患者。

1.5 剔除、脱落、终止标准

1）误纳入病例。2）资料不充分，无法进行疗效性及安全性评估患者。3）试验过程中失访或自行要求退出者。4）患者依从性差，试验期间不按规定用药或更改试验药物或使用禁用药品。5）患者试验过程中出现严重的病情变化或并发症。6）患者试验过程中出现严重的不良事件，不宜继续进行临床试验。

1.6 质量控制与伦理

本试验研究中，患者肠道准备由南京中医药大学附属南京市中西医结合医院内镜中心及脾胃病科住院部护士完成宣教及监控，确保患者肠道准备达到优良状态，波士顿肠道准备评分（BBPS）≥8分。患者行CRAs内镜下手术治疗，需2名高年资主治医师或副主任医师以上级别的医师共同在场，其中一名医师完成手术，另一名医师完成质量把控，2名医生均有每年200例以上肠镜及每年100例以上内镜下治疗的操作经验；结肠镜退镜时间需大于6 min，以确保手术完整切除、尽量降低CRAs的漏诊率。所有患者入组时均征得其知情同意。本研究已通过南京中医药大学附属南京市中西医结合医院伦理委员会审核（伦理号：201902）。

1.7 试剂与仪器

PrimScript TMR TreagentKi反转录试剂盒（Kyoto公司，批号：P600612）；BCA蛋白质定量试剂盒（Solarbio公司，批号：5188065）；兔抗Wnt5a多克隆抗体（abcam公司，批号：ab179824）；兔抗β-catenin多克隆抗体（abcam公司，批号：ab32572）；兔抗GSK-3β多克隆抗体（abcam公司，批号：ab32391）；兔抗Cyclin D1多克隆抗体（abcam公司，批号：ab134175）；兔抗GAPDH抗体（Engibody公司，批号：AT0002）；兔抗HRP二抗（Cell Signaling公司，批号：7074S）等。

TissueLyser Ⅱ（QIAGEN公司）；NanoDrop紫外分光光度计（Thermo scientific公司）；Agilent 2100 bioanalyzer生物分析仪（Agilent公司）；StepOnePlus Real-Time PCR sysem（ABI公司）；MGISEQ-2000基因测序仪（深圳华大基因公司）；Lightcycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（Roche公司）；微型垂直电泳槽、高电流电泳仪（Bio-Rad公司）；Image Quant LAS4000曝光仪（GE公司）等。

2 方法 2.1 随机与分组

将纳入患者编号信息录入SAS9.4软件并生成随机化序列表，并按1∶1配比，随机分为试验组和对照组。本研究为双盲研究，试验完成前所有患者及医师均不知晓分组结果，所有数据由南京中医药大学附属南京市中西医结合医院科教科和中心实验室组成的数据管理小组进行管理，待试验完成后，由数据管理小组统一揭盲；若试验过程中出现严重不良反应或紧急事件，经数据管理小组负责人同意后可予以紧急破盲。

2.2 服药方法

试验组：患者签署知情同意书，行内镜下大肠息肉切除治疗，待患者恢复饮食后，开始服用中药健脾利湿解毒颗粒（由江阴天江药业提供，批号：20190420）。其每剂主要组成包括：潞党参15 g，土茯苓30 g，炒白术10 g，连翘15 g，忍冬藤30 g，白薇10 g。每日服用2次（早晚饭后1 h服用），每次服用1包（每包颗粒剂溶于150 mL温水中饮用），疗程为3个月。

对照组：患者签署知情同意书后，行内镜下大肠息肉切除治疗、恢复饮食后，开始服用安慰剂颗粒剂（由江阴天江药业提供，批号：20190420），其颗粒质量、外观、颜色、口感与健脾利湿解毒颗粒相同，其主要成分包括：淀粉、麦芽糖、焦糖色素、糊精等，无任何治疗作用。每日服用2次（早晚饭后1 h服用），每次服用1包（每包颗粒剂溶于150 mL温水中饮用），疗程为3个月。

2.3 观察指标及方法 2.3.1 复查肠镜

所有患者在入组12个月后复查电子肠镜，并记录CRAs复发情况。CRAs复发标准：患者首次行电子肠镜下CRAs切除术，确保完全切除所有CRAs后，复查电子肠镜时再次发现结直肠任意部位出现CRAs，即为复发。复发率=CRAs复发患者数/总患者数×100%。

2.3.2 标本收集

入组时留取患者CRAs组织2枚，CRAs边缘5 cm正常大肠组织各2枚，记录CRAs部位（即CRAs距肛缘齿状线的距离）。入组第12个月后复查肠镜时若患者CRAs复发，则再次留取CRAs组织2枚，若未发现CRAs未复发，则无需留取大肠组织。

2.3.4 RNA提取、文库构建及转录组学分析

将收集到的患者CRAs组织置于对应编号研磨破碎管中，加入1.5 mL TRIzol裂解液，放入TissueLyser Ⅱ研磨机中，研磨30 s，取出静置5 min，使组织细胞充分裂解，并离心（4 ℃，12 000×g，离心5 min）。将上清液转入加有300 μL氯仿/异戊醇（24∶1）的EP管中，振荡混匀（4 ℃，12 000×g，离心8 min）。将上清转入加有600 μL异丙醇的离心管中，颠倒混匀置于-20 ℃冰箱静置后离心（4 ℃，17 500×g，离心25 min），弃上清，用0.9 mL 75%乙醇洗涤后再次离心（4 ℃，17 500×g，离心3 min）。用200 μL RNase-free水溶解沉淀。最后使用NanoDrop紫外分光光度计测定样品RNA含量，使用非变性琼脂糖电泳监测RNA完整性，使用Agilent 2100 Bioanalyzer检测Total RNA。

随机选取试验组、对照组各3名患者的CRAs及瘤旁正常组织制备Total RNA，将制备好的RNA文库使用Agilent 2100 bioanalyzer检测文库的插入片段范围，并使用ABI StepOnePlus Realtime PCR System（TaqMan Probe）对文库进行浓度定量。最后，将检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，与FlowCell上的接头杂交，然后在簇生成平台cBot上完成桥式PCR扩增，并进行上机测序。设定阈值为显著性水平P＜0.05，差异倍数fold change≥2。将测序得到的原始图像数据经base calling转化为原始序列数据（raw reads），使用Trimmomatic v0.36软件对原始数据进行过滤，去除raw reads中的低质量序列、Adaptor序列以及未知碱基N含量大于5%的序列等杂质数据。同时使用SOAP nuke v1.4.0软件对各样品的测序质量进行统计和评估，从而获得高质量的序列数据（Clean Reads）。使用HISAT2 v2.1.0软件将clean reads比对到晴参考序列（IRGSP-1.0）。随后，使用Bowtie2 v2.2.5软件将clean reads比对到参考基因序列。最后使用RSEM v1.2.8软件计算基因表达水平，用FPKM值表示。

2.3.5 qRT-PCR验证

选取试验组（治疗前35例、治疗后8例）、对照组（治疗前34例、治疗后16例）患者的CRAs及瘤旁正常组织，qPCR使用逆转录试剂盒生成cDNA，使用2X SG Fast qRCR Master Mix和Light cycler 480Ⅱ将cDNA进行扩增。基因引物见表 1。按如下成分配置qRT-PCR扩增体系：SYBR Green Mix 10 μL+cDNA 1 μL+上游引物（20 μmol）1 μL+下游引物（20 μmol）1 μL+ddH₂O 7 μL，总体系：20 μL。使用相对定量法计算样品中目标基因的原始拷贝数。

2.3.6 Western Blot验证

选取试验组（治疗前35例、治疗后8例）、对照组（治疗前34例、治疗后16例）患者的CRAs及瘤旁正常组织，按照BCA试剂盒说明操作，测定样品蛋白浓度。将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样10 μg，电泳分离蛋白。将蛋白质转移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层（300 mA恒流，2 h）。将封闭过的PVDF膜分别与兔抗Wnt5a多克隆抗体、兔抗β-catenin多克隆抗体、兔抗GSK-3β多克隆抗体、兔抗Cyclin D1多克隆抗体、兔抗GAPDH抗体封闭孵育；加入兔抗HRP二抗孵育1 h。采用ECL化学发光法将膜与化学发光底物孵育；采用PhotoShop CS v 6.0软件测定各蛋白条带的灰度值，各条带灰度值均需除以相应的GAPDH内参条带灰度值校正。

2.4 安全性评估

所有患者入组时、第3个月及第12个月完成血常规、尿常规、粪便常规、肝功能、肾功能和心电图检查；所有患者每4周接受1次电话或门诊随访，记录患者是否有不良反应及其他情况。

2.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计，定性数据用例数及率表示，组间比较采用χ²检验；定量数据用均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布的数据组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的数据组间比较采用非参数检验；组内前后比较采用配对样本t检验或非参数检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 患者CRAs复发情况

至本试验结束时，共有11例患者因无法电话联系、拒绝复查肠镜等原因脱落。最终试验组患者CRAs复发率低于对照组（22.86% vs 47.00%，P＜0.05）。见表 1。试验组和对照组患者治疗前后对比，CRAs直径减小（P＜0.05）；12个月后试验组患者复发的CRAs直径小于对照组复发的CRAs直径（P＜0.05）。见表 2。提示健脾利湿解毒颗粒治疗CRAs术后患者用来预防CRAs复发具有良好的效果。

3.2 各样本CRAs组织RNA文库及测序数据

本项目中随机选出6名患者的CRAs组织样本中，样品比对基因组的平均比对率为92.70%，比对基因集的平均比对率为55.24%；共检测到18 270个基因。所有样本的Q20（质量值≥20）占比均大于97%，Q30（质量值≥30）占比均大于92%，提示所有样本中的基因和碱基的序列的质量均合格，达到分析要求，其所得的数据可以用于后续的测序。

3.3 差异表达基因分析结果

RNA-seq测序结果表明，试验组患者治疗前后CRAs组织中筛选出的显著性差异基因共有51个，其中上调基因33个，下调基因18个；治疗前试验组与对照组相比，筛选出显著差异基因3个，上调3个，下调0个；试验组患者治疗前后对比，筛选出显著差异基因471个，上调315个，下调156个；治疗后试验组与对照组相比，筛选出显著差异基因1 518个，上调952个，下调566个。基因差异数对比见图 1，火山图（散点图）见图 2，聚类热图见图 3。

3.4 GO富集分析结果

差异基因的GO富集分析以P＜0.05为差异具有统计学意义，结果显示试验组治疗前后、试验组与对照组治疗后相比，在生物过程（biological process）方面，差异基因均主要集中在生物调节（biological regulation）、生物调控（regulation of biological process）、代谢（metabolic process）等过程；在细胞组成（cellular component）方面，差异基因均主要集中在细胞器（organelle）、细胞膜（membrance）、细胞外区（extracellur region）等部位；在分子功能（molecular function）方面，基因差异均主要体现在黏附（binding）、催化活性（catalytic activity）、分子功能调节物（molecular function regulator）等方面。GO富集图见图 4。

3.5 KEGG富集分析结果

差异基因KEGG pathway富集分析结果显示，试验组患者治疗前后的差异基因主要富集在Wnt signaling pathway、Pathways in cancer、Hippo signaling pathway等。治疗后试验组患者与对照组患者差异基因主要富集在DNA复制（DNA replication）、碱基切除修复（base exision repair）、抗原合成和传递（antigen processing and presentation）等方面。见图 5。

3.6 健脾利湿解毒颗粒对CRAs治疗术后患者关键差异表达基因的筛选

为了准确筛选出健脾利湿解毒颗粒治疗CRAs内镜治疗术后患者富集在Wnt/β-catenin信号通路上的关键基因，参考差异蛋白分析结果、GO富集分析结果和KEGG Pathway富集分析结果，最终筛选出健脾利湿解毒颗粒作用于Wnt/β-catenin信号通路上的关键基因，具体见表 3。

3.7 qRT-PCR验证健脾利湿解毒颗粒对Wnt/β-catenin信号通路上关键基因的影响

本研究提取了试验组和对照组患者治疗前CRAs组织及治疗后复发CRAs组织的总RNA，以正常大肠组织为对空白对照，以GAPDH为内参，采用qRT-PCR法测定基于Wnt/β-catenin信号通路上的关键基因，引物序列见表 4。qRT-PCR结果提示，试验组与对照组患者CRAs组织中的APC2基因表达量均低于正常大肠组织，FZD10、DVL1、GSK3B、LRP6、LRP5、WNT5、CCND1、MYC、MMP7基因表达量高于正常大肠组织（P＜0.05）。经治疗后，试验组患者复发的CRAs组织中APC2、FZD10、DVL1、GSK3B、WNT5、CCND1、MYC、MMP7基因表达量与正常大肠组织差异无统计学意义（P > 0.05）；而对照组患者治疗后结肠组织的APC2、FZD10、DVL1、GSK3B、LRP6、LRP5、WNT5、CCND1、MYC、MMP7基因表达量与正常大肠组织相比差异仍有统计学意义（P＜0.05）。具体基因表达量见表 5。

3.8 Western Blot法验证健脾利湿解毒颗粒对Wnt/β-catenin信号通路上的关键蛋白的影响

本研究中试验组和对照组患者治疗前CRAs组织及治疗后复发的CRAs组织的总蛋白，以正常大肠组织为空白对照，以GAPDH为内参，采用Western Blot法测定基于Wnt/β-catenin信号通路上的关键蛋白，结果显示治疗前试验组和对照组患者CRAs组织中的Wnt5a、β-Catenin、GSK-3β、Cyclin D1蛋白表达量均高于正常大肠组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）；经治疗后，试验组患者复发的CRAs组织中上述蛋白含量较治疗前CRAs组织下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组患者复发的CRAs组织中上述蛋白与治疗前CRAs组织相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 6。

3.9 安全性评估

至本试验结束时，所有完成试验患者的血常规、尿常规、粪便常规、肝功能、肾功能、心电图结果均未出现明显异常，且所有完成试验的患者均未出现不良反应。

4 讨论

中医尚无大肠腺瘤的病名，对于大肠腺瘤的诊治亦无统一认识和的辨证分型标准。本病患者临床症状纷繁多样，甚至部分患者无症状，导致无证可辨。临床诊治过程中，患者虽行内镜下大肠腺瘤切除术，但患者大肠腺瘤发病的病理状态尚未改变，故大肠腺瘤复发率高；且当今临床尚缺乏公认的、疗效确切的药物可预防腺瘤复发。中医药在预防大肠腺瘤术后患者腺瘤复发方面优势逐渐凸显，导师刘万里教授通过多年的临床诊治经验，对大肠腺瘤的发生、发展和复发有着独特的思考和认识。刘万里教授带领本研究团队在临床诊治中发现，CRAs内镜治疗术后的患者中，脾虚湿毒证占有较大比重。此证型虽病位在大肠，但根本在脾胃，与肺、肾等脏腑相关。脾胃为人体后天之本，气血化生之源，气机升降之枢纽，故脾胃亏虚是CRAs发病的“根本”；患者素体脾胃疲弱，运化水谷之力缺乏，升清降浊之功衰亏。患者后天饮食不节、嗜食肥甘、吸烟饮酒，久而复伤脾胃，水液代谢失调，湿邪内生，久而成痰。痰湿之邪在体内久聚，若患者病因不能及时得到祛除，或已病不能得到准确诊治，久则“内结”于肠道，而成腺瘤，故湿为CRAs发病的“核心”。CRAs患者若不及时切除腺瘤和祛除病因，久病则入络，继而瘀血内生、脾胃气机不利、肠腑传导失司，结于大肠的湿邪与气、瘀搏结到一定的深度而成“毒”。刘万里教授认为这种“毒”是“湿毒”，区别于普通的痰湿之邪，是介于痰湿与癌毒的中间状态，是CRAs疾病发展的“关键”。患者肠道结聚的“湿毒”若不能得到及时诊治，待日久量变引起质变，则成为“癌毒”。综上所述，刘万里教授认为治疗大肠腺瘤内镜治疗术后的患者，根本法为“扶正祛邪”，临床诊治应以调和脏腑功能为主，并应着力于祛除湿、毒之邪，以调和各脏腑阴阳气血平衡为要义，改善大肠腺瘤发生的土壤，祛除复发和癌变的危险因素，从而真正地达到“未病先防”“既病防变”“瘥后防复”。

健脾利湿解毒颗粒由已故名中医陈苏生著名药对“土忍翘薇”加减而来，具有“解毒利湿，搜风通络”的功效，刘万里教授在此基础上增加健脾益气之党参、白术而成健脾利湿解毒颗粒，恰合CRAs内镜治疗术后患者脾虚失运、湿毒内结之证。其中潞党参、土茯苓两药合为君药，共奏健脾扶正，解毒除湿之功，扶助脾胃之正气同时，可解蕴结于肠道之湿毒。炒白术、忍冬藤两药共为臣药，连翘、白薇共为佐药，辅佐君臣，加强解毒除湿散结之功。导师刘万里教授认为土茯苓健脾胃而利湿解毒，统领诸药；忍冬藤祛风解毒，连翘清热解毒，治邪之在气；白薇凉血解毒，治邪之在血；诸药合而共具解毒利湿、散结通络之功，加健脾之党参、白术，共奏健脾利湿、解毒散结之功效，正合CRAs患者脾虚失运、湿毒内结之证，从而改善CRAs生存之“土壤”，故湿毒不复，癌毒不生。

现代药理学研究结果显示，健脾利湿解毒颗粒中的潞党参、炒白术具有调节机体免疫、抗肿瘤的作用；研究发现潞党参的重要有效成分党参总皂苷具有增强细胞免疫、体液免疫的功效^[11]，国内外研究亦发现党参水提取物具有促进肿瘤细胞凋亡^[12]、抑制肿瘤细胞侵袭、黏附等功效^[13]；此外，国内外学者通过白术提取物对动物及细胞模型的影响发现，炒白术可能通过促进T淋巴细胞增殖、抑制免疫炎症信号通路^[14]、增强线粒体功能等功效而起到增强免疫力、抗肿瘤的作用^[15-16]。

此外，现代药理学研究亦发现健脾利湿解毒颗粒中核心药组“土忍翘薇”的有效提取物，均从不同角度、不同层面呈现出抗肿瘤、抑制免疫炎症反应、抑制下游炎症因子等功效。土茯苓的有效成分包括黄酮、苯丙素、甾体、有机酸、挥发油类化学物质^[17]。现代药理学研究发现土茯苓有效提取物可抑制无翅型MMTV整合位点家族（Wnt）、核因子-кB（NF-кB）、Jak/Stat等炎症、肿瘤信号通路，具有抗炎、抑制细胞免疫、抗肿瘤、抗心肌缺血、血栓等作用^[18]，国内外研究团队研究结果土茯苓有效提取物对结肠癌、胃癌、肝癌等肿瘤细胞均有抑制作用^[19]。忍冬藤的有效提取物主要包含有机酸类、黄酮类、挥发油类化合物^[20]，现代药理学研究结果主要发现其有抗病毒、抗炎、调节免疫、抗肿瘤等作用^[21]。研究学者发现^[22]忍冬藤有效提取物对结肠癌LOVO细胞、腹水癌EAC细胞和白血病HL-60细胞均有抑制作用，其机制主要与通过降低肿瘤细胞侵袭、转移能力和阻滞肿瘤细胞周期有关^[23]。连翘的有效成分包括苯乙醇苷类、萜类、有机酸类等^[24]，具有抗炎、抗病毒、保肝、抗肿瘤等作用^[25]。张明远团队发现^[26]连翘提取物可能通过调节肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平、诱导T淋巴细胞或自然杀伤（NK）细胞抑制肿瘤细胞的增殖。于晓东等^[27]研究发现连翘提取物连翘苷通过影响人外周血白细胞介素（IL）-2、IL-4和淋巴细胞环磷酸腺苷（cAMP）而发挥调节免疫的作用。白薇的有效提取物成分主要有C21甾体皂苷类、生物碱类、挥发油类、白薇素等^[28]，现代药理学具有理学研究发现其有抗炎、退热、镇咳平喘、抗肿瘤的作用^[29]。Hu等^[30]研究结果显示白薇水提取物可作用于NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，从而调节关键炎症因子（如IL-6、TNF-α等），起到调节免疫的作用。杨利红教授团队^[31]研究发现白薇有效成分直立白薇苷C可通过抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡而发挥抗肿瘤的作用。

本研究运用健脾利湿解毒颗粒治疗脾虚湿毒型CRAs内镜治疗术后的患者，结果显示试验组复发率低于对照组，复发率与既往研究结果对比有差异，这可能与本研究样本量偏少、周期偏短有关，今后将开展大样本多中心临床研究，以纠正可能存在的数据偏倚。此外，本研究中收集了试验组和对照组患者治疗前CRAs组织和经治疗后患者的复发CRAs组织，通过高通量测序技术和生物信息学分析，筛选了试验组和对照组患者治疗前后CRAs组织中的差异基因，并通过KEGG Pathway富集分析发现，健脾利湿解毒颗粒可能是通过干预Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，这一结果与前期国内外研究发现Wnt/β-catenin信号通路和CRAs及大肠腺癌发病密切相关的结果基本吻合。qPCR和Western Blot检验结果显示，健脾利湿解毒颗粒可升高患者CRAs组织中APC2基因的表达、抑制FZD10、DVL1、GSK3B、LRP6、LRP5、WNT5等核心基因及CCND1、MYC、MMP7等靶基因的表达；并能降低患者CRAs组织中的Wnt5a、β-Catenin、GSK-3β等核心蛋白和下游蛋白Cyclin D1的表达，这可能是其干预Wnt/β-catenin信号通路、抑制CRAs复发的机制之一。

综上所述，本研究结果表明健脾利湿解毒颗粒治疗CRAs术后患者安全、有效，可降低患者CRAs的复发率，即使部分患者CRAs复发，其CRAs的生长速度亦小于对照组患者，这可能与健脾利湿解毒颗粒可干预患者结肠组织中Wnt/β-catenin信号通路异常激活、减轻肠道免疫炎症反应、抑制大肠组织向CRAs组织分化、减慢CRAs生长速度有关。中医药治疗患者的疾病，是通过多靶点、多通路的途径发挥作用，本研究通过转录组学技术从侧面验证了这一观点。“整体观念”和“辨证论治”是中医临床诊治的理论核心，中医治疗的对象是“患者”而非“腺瘤”；健脾利湿解毒颗粒对患者体质进行整体调理，从不同角度去干预CRAs的发生、复发；除了抗炎、调节免疫、抑制信号通路等作用机制，其是否可调节人体自身免疫机能、改善肠道病理状态下的微环境变化、以促进CRAs及周围组织向正常结肠组织恢复，是今后研究的新的方向和切入点。