天津中医药  2025, Vol. 42 Issue (9): 1168-1176

文章信息

王旭娜, 何琦, 张乃嘦, 等.
WANG Xuna, HE Qi, ZHANG Naijiao, et al.
3个不同产地种质甘草中8种主要活性成分合成累积动态变化规律的研究
Study on the dynamic changes of synthesis and accumulation of 8 main active ingredients in glycyrrhiza germplasm from 3 different germplasm sources
天津中医药, 2025, 42(9): 1168-1176
Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(9): 1168-1176
http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.09.12

文章历史

收稿日期: 2025-04-18
3个不同产地种质甘草中8种主要活性成分合成累积动态变化规律的研究
王旭娜1 , 何琦1 , 张乃嘦2 , 陈延国2 , 王雪媛2 , 袁宏宇2 , 李国辉1 , 李天祥1     
1. 天津中医药大学,天津 301617;
2. 盛实百草药业有限公司,天津 300301
摘要:[目的] 以中国甘草道地产区杭锦旗、赤峰和会宁3个野生种质甘草引种于天津为研究内容,于1年生长期内每隔15 d采收1次样品,对所含8种主要功效成分含量进行测定,系统考察3个产地不同种质甘草不同采收期药材中活性成分合成累积规律及特点,筛选优良种源。[方法] 半月采集1次样品,分别采用高效液相色谱(HPLC)法、NaNO2-Al(NO33-NaOH比色法、蒽酮-H2SO4法测定不同采收期样品中8种主要功效成分含量,考察功效成分合成累积动态变化趋势及规律。[结果] 不同采收期3个种质甘草引种天津药材样品中所含甘草素、甘草次酸、异甘草素、总黄酮和总多糖合成累积量变化趋势基本一致,但会宁甘草中甘草苷、甘草酸和异甘草苷含量在不同采收时间内均高于杭锦旗和赤峰甘草。[结论] 3个野生种质甘草引种天津后生长适应性良好,在1年生长周期内,不同采收期甘草主要活性功效物质合成功效成分动态合成量波动变化趋势差异并不显著,会宁种质甘草中功效成分合成累积量水平均高,具有较强的优良种质特性,因此,会宁甘草在天津盐碱土壤环境中规模化引种具有明显的潜力。
关键词甘草    采收期    高效液相色谱法    总黄酮    总多糖    

甘草来源于豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)或胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)的干燥根及根茎。首次载于《神农本草经》,其味甘,性平,列为上品,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效[1],在临床运用中多配伍理气药用于治疗气虚证[2-4]。现代药理学研究发现,甘草中有皂苷类、黄酮类及多糖类等100多种化学成分,多用于抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗动脉粥样硬化、镇痛等[5-10],也常作为甜味剂、优质饲料、表面活性剂及美白剂[11]被广泛运用。甘草是药食同源的品种之一,其含有的甘草甜素被美国药品监督管理局列为食品添加剂中“公认的安全物质”[12]。在抗击新型冠状病毒感染期间,甘草使用频率居首位[13]

随着市场用量的日趋增多,甘草野生资源极度减少,目前市场上流通的甘草主要是人工种植甘草。初步统计,栽培多分布于甘肃省、内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区等[14-15]。药材有效成分合成积累量差异是遗传因子、环境因子和人为因素共同作用的结果,当气候环境因子以及田间管理措施基本一致时,遗传基础是影响药材有效成分含量差异的主要因素[16-17]。有研究者通过对不同基原及不同种植生长环境的甘草进行研究[18-22],结果表明不同基原及不同生长条件下的甘草,其所含的化学成分含量差异明显。

天津濒临渤海,海拔低且地下水矿度高,其中滨海新区盐碱土面积达1 958.9 km2,占全区土壤总面积的86.3%,土壤盐渍化问题突出,植被生长受到抑制,严重限制天津地区农业发展[23-24]。因此,加强抗盐碱植物品种选育,大力开展耐盐碱栽培技术研究,修复盐碱化土壤结构,促进盐碱地农田改良利用,筛选耐盐碱植物,有效提高盐碱土地利用率,是提高天津地区农业经济发展水平的重要举措[25]。甘草作为西北荒漠地区的深根性多年生草本植物,有较强的耐盐性,且修复盐渍化土壤环境能力强,具有显著的经济价值与生态价值。因此,本研究基于甘草耐盐碱相关的研究基础上,收集道地产区杭锦旗、赤峰和会宁3种野生种质的甘草,开展引种天津研究,系统考察不同生长过程中所含的主要功效化学成分合成累积量动态变化的规律,以期阐明不同种质甘草药材的品质特征,拟筛选出适合天津盐碱地引种甘草的优良种源。

1 实验材料 1.1 实验药材

由盛实百草药业有限公司采集3种种源即内蒙古自治区杭锦旗、赤峰和甘肃省会宁的野生甘草种子,栽培于天津中医药大学中药种质资源圃,原植物经天津中医药大学李天祥教授鉴定为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Flsch.)。定期挖取其根及根茎药材样品,干燥,粉碎后过筛,粉末分别密封保存。

1.2 实验试剂

甲醇、乙醇均购自天津市科密欧化学试剂有限公司,磷酸、氢氧化钠均购自上海麦克林生化科技有限公司,浓硫酸购自天津利安隆博华医药化学有限公司,蒽酮购自上海科丰实业有限公司,无水乙醇购自天津市风船化学试剂科技有限公司,亚硝酸钠购自天津市江天化工技术有限公司,硝酸铝购自天津市大茂化学试剂厂,甘草苷购自四川省维克奇生物科技有限公司,D-无水葡萄糖、芦丁、甘草素、甘草酸单铵盐、18β-甘草次酸、异甘草苷、异甘草素均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验仪器

高效液相色谱(HPLC)仪(美国Alltech科技有限公司);SB25-12DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);FA 2104电子天平(上海舜宇恒平科技仪器有限公司);YHG-600-BS-Ⅱ型远红外快速干燥箱(上海贺德实验设备有限公司);UV-6100型紫外可见分光光度计(上海美普达有限公司);HH-ZK4二列四开智能水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)。

2 实验方法 2.1 实验设计

于2022年5月中旬,在中药种质资源圃播种3种种质的野生甘草种子,进行田间管理。2023年3月中旬开始至同年10月下旬,每隔半个月采收1次,具体采收时间见表 1。采收时,同一种质甘草尽量选择不同垄种植的植株,每次采收4~6株,方便后续的平行实验,以消除个体差异带来的影响。

表 1 甘草采收时间 Tab. 1 Harvesting time of Glycyrrhiza uralensis
样品 采收时段 具体日期 样品 采收时段 具体日期
M1 惊蛰—春分 2023.03.14 M9 小暑—大暑 2023.07.15
M2 春分—清明 2023.03.28 M10 大暑—立秋 2023.08.01
M3 清明—谷雨 2023.04.14 M11 立秋—处暑 2023.08.18
M4 谷雨—立夏 2023.05.01 M12 处暑—白露 2023.09.01
M5 立夏—小满 2023.05.14 M13 白露—秋分 2023.09.15
M6 小满—芒种 2023.05.29 M14 秋分—寒露 2023.09.30
M7 芒种—夏至 2023.06.14 M15 寒露—霜降 2023.10.14
M8 夏至—小暑 2023.06.29 M16 霜降—立冬 2023.10.31
2.2 样品处理

将甘草根及根茎剪碎,置于105 ℃烘箱中杀青15 min后,烘干至恒定质量,粉碎过筛,密封备用。

2.3 甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸含量测定 2.3.1 色谱条件

使用迪马C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;流动相:乙腈0.05 %磷酸水;流速:1 mL/min;波长:237 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。梯度洗脱程序见表 2

表 2 HPLC梯度洗脱程序(总黄酮) Tab. 2 HPLC gradient elution procedure(flavonoids)
时间(min) 乙腈(%) 0.05%磷酸水(%)
0 19 81
5 19 81
15 38 62
25 80 20
30 19 81
40 19 81
2.3.2 对照品溶液制备

精密称定甘草苷10.4 mg、甘草素2.1 mg、甘草酸铵10.0 mg、甘草次酸5.0 mg于4个容量瓶中,70%乙醇定容,得浓度分别为0.416、0.084、0.400、0.200 mg/mL的对照品储备液。

2.3.3 供试品溶液制备

称取0.1 g各样品粉末于100 mL锥形瓶中,加入50 mL 70%乙醇,40 ℃超声提取30 min,冷却后过滤,得供试品溶液。

2.3.4 方法学考察

线性关系考察:吸取各对照品储备液适量,制备含甘草苷66.56 μg/mL、甘草素8.40 μg/mL、甘草酸铵104.00 μg/mL、甘草次酸28.00 μg/mL的混合对照品溶液。将对照品溶液逐级稀释,进样洗脱,绘制标准曲线,其中标准品浓度(μg/mL)为X,峰面积为Y,计算得到甘草苷的回归方程:Y=11 997X+821.65,R2=0.999 8;甘草素的回归方程:Y=19 869X+208.35,R2=0.999 9;甘草酸的回归方程:Y=2 673.4X-5.044,R2=0.999 8;甘草次酸的回归方程:Y=5 498.3X+8 153.1,R2=0.999 3。结果表明,甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸分别在3.328~66.560、0.12~8.40、5.095~101.891、0.35~28.00 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

稳定性考察:供试品溶液分别在0、3、6、9、12、15、18 h进样洗脱,各成分峰面积代入标准曲线,计算甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸含量,RSD分别为1.16%、1.11%、1.30%、3.78%,表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。

重复性考察:称取同一植株甘草粉末共6份,制备供试品溶液,进样洗脱,各成分峰面积代入标准曲线,计算甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸含量,RSD分别为0.49%、1.89%、1.57%、3.09%,表明该方法重复性良好。

精密度考察:混合对照品溶液连续进样6针,甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸RSD分别为1.93%、1.03%、0.70%、1.71%,表明仪器的精密度良好。

加样回收率考察:称取已知含量的甘草粉末6份,加入各对照品溶液适量,制备待测溶液,进样洗脱,各成分峰面积代入标准曲线,计算甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸含量,根据原有量、加入量计算其加样回收率分别为100.52%、100.26%、99.21%、100.62%,RSD分别为1.08%、1.31%、1.25%、2.04%,表明该方法回收率良好。

2.3.5 样品含量测定

各供试品溶液进样洗脱,得甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸的峰面积,计算含量。混合对照品及供试品色谱图见图 1

注:1,甘草苷;2,甘草素;3,甘草酸;4,甘草次酸。 图 1 甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸混合对照品及供试品色谱图 Fig. 1 Chromatograms of the mixed reference standards and test sample of liquiritin, liquiritigenin gycyrrhizic acid and glycyrrhetinic acid
2.4 异甘草苷、异甘草素含量测定 2.4.1 色谱条件

使用迪马C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;流动相:乙腈0.05 %磷酸水;流速:1 mL/min;波长:360 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。梯度洗脱程序见表 3

表 3 HPLC梯度洗脱程序(多糖) Tab. 3 HPLC gradient elution procedure(polysaccharides)
时间(min) 乙腈(%) 0.05%磷酸水(%)
0 19 81
5 19 81
10 80 20
15 19 81
20 19 81
2.4.2 对照品溶液制备

分别精密称定异甘草苷、异甘草素于容量瓶中,用70%乙醇制备浓度分别为0.100 mg/mL的异甘草苷储备液和0.108 mg/mL的异甘草素储备液。

2.4.3 供试品溶液制备

同“2.3.3”。

2.4.4 方法学考察

线性关系考察:制备含异甘草苷24.00 μg/mL、异甘草素9.99 μg/mL的混合对照品溶液,逐级稀释,进样洗脱,各标准品浓度(μg/mL)为X,峰面积为Y,计算得到异甘草苷的回归方程:Y=18 297X+1 574,R2=0.999 6;异甘草素的回归方程:Y=34 356X+3 826.2,R2=0.999 7。结果表明,异甘草苷、异甘草素分别在0.48~24.00、0.199 8~9.990 0范围内与峰面积呈良好的线性关系。

稳定性考察:供试品溶液分别在0、3、6、9、12、15、18 h进样洗脱,各成分峰面积代入标准曲线,计算异甘草苷、异甘草素含量,RSD分别为2.07%、2.91%,表明所制备的供试品溶液在18 h内稳定性良好。

重复性考察:称取同一植株甘草粉末6份,制备供试品溶液,进样洗脱,各成分峰面积代入标准曲线,计算异甘草苷、异甘草素含量,RSD分别为0.24%、1.39%,表明该方法的重复性良好。

精密度考察:制备混合对照品溶液,连续进样6针,记录各成分峰面积,RSD分别为1.16%、0.91%,表明仪器的精密度良好。

加样回收率考察:称已知含量的甘草粉末6份,加入各对照品溶液适量,制备供试品溶液,进样洗脱,各成分峰面积代入标准曲线,计算异甘草苷、异甘草素含量,根据原有量、加入量计算其加样回收率分别为100.38%、99.13%,RSD分别为1.13%、1.33%,表明该方法回收率良好。

2.4.5 样品含量测定

各供试品溶液进样、洗脱,得异甘草苷和异甘草素的峰面积,计算含量。混合对照品及供试品色谱图见图 2

注:1,异甘草苷;2,异甘草素。 图 2 异甘草苷和异甘草素和混合对照品及供试品色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the mixed reference standards and the test sample of isoliquiritin and isoliquiritigenin
2.5 总黄酮含量测定 2.5.1 对照品溶液制备

称取芦丁于容量瓶中,80%乙醇定容至刻度线,制得浓度为0.9 mg/mL的芦丁对照品储备液。

2.5.2 供试品溶液制备

精密称取0.5 g甘草粉末,置于100 mL锥形瓶中,加入80%乙醇溶液,80 ℃水浴回流提取2 h,冷却后过滤,定容至25 mL,即得总黄酮供试品溶液。

2.5.3 显色剂配制

称取亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠适量于容量瓶中,加入蒸馏水,分别制成5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液和5%氢氧化钠溶液。

2.5.4 方法学考察

检测波长的确定:精密吸取1 mL对照品溶液进行显色实验,在200~800 nm范围内进行波长扫描,根据结果选用500 nm作为检测波长。

线性关系考察:稀释芦丁储备液,取各稀释液,分别加入5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液,每加入一种反应溶剂后静置6 min,最后加入5%氢氧化钠溶液,摇匀、静置15 min,加水定容至刻度,测定吸光度值,空白溶液为加显色剂的蒸馏水,芦丁终浓度为X,吸光度值为Y,绘制标准曲线,Y=10.025X-0.012 9,R2=0.999 5。

稳定性考察:供试品溶液显色,分别在0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度值,代入标准曲线得总黄酮含量,RSD为0.92%,表明所制备供试品溶液在60 min内稳定性良好。

重复性考察:称取6份同一甘草粉末,制备供试品溶液,显色、测定吸光度值,代入标准曲线计算得总黄酮含量,RSD为0.76%,表明该方法重复性良好。

精密度考察:吸取芦丁溶液进行显色实验,紫外分光光度计中测定6次得吸光度值,RSD为0.04%,表明仪器的精密度良好。

加样回收率考察:取已知总黄酮含量的甘草粉末6份,加入芦丁适量,制备供试品溶液,显色、测定吸光度值,代入标准曲线得总黄酮含量,根据原有量、加入量计算得加样回收率为100.10%,RSD为1.67%,表明该方法回收率良好。

2.5.5 样品含量测定

供试品溶液显色后测定吸光度值,计算总黄酮含量。

2.6 总多糖含量测定 2.6.1 对照品溶液制备

称定葡萄糖于容量瓶中,用水定容,得浓度为1.05 mg/mL的葡萄糖储备液。

2.6.2 供试品溶液制备

称取甘草粉末0.1 g于锥形瓶中,加入80%乙醇,浸泡过夜,超声提取2次,每次30 min,过滤后回收滤渣,加入蒸馏水100 mL,沸水加热回流提取2 h,将滤液定容至100 mL,即得甘草总多糖供试品溶液。

2.6.3 蒽酮-浓硫酸试剂配制

称取蒽酮粉末0.4 g加入200 mL 98%浓硫酸中,搅拌溶解,避光保存,现配现用。

2.6.4 方法学考察

检测波长的确定:吸取对照品溶液进行显色实验,在200~800 nm范围内进行波长扫描,根据结果选择625 nm为检测波长。

线性关系考察:葡萄糖储备液进行稀释,稀释液中加入蒽酮-浓硫酸试剂,先后进行沸水浴及冷水浴,625 nm测定吸光度值,以终浓度为X,吸光度值为Y,绘制标准曲线,Y=7.125 3X+0.097 6,R2=0.999 3。

稳定性考察:供试品溶液显色反应后在0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度值,代入标准曲线计算总多糖含量,RSD为0.72%,表明所制备供试品溶液在60 min内稳定性良好。

重复性考察:6份来自同一植株的甘草粉末制备供试品溶液,显色、测定吸光度值,代入标准曲线计算总多糖含量,RSD为1.07%,表明该方法的重复性良好。

精密度考察:吸取葡萄糖储备液,进行显色反应,在625 nm波长下连续测定6次吸光度值,RSD为0.03%,表明仪器的精密度良好。

加样回收率考察:取已知总多糖含量的甘草粉末6份,加入葡萄糖适量,制备供试品溶液,显色、测定吸光度值,代入标准曲线得总多糖含量,根据原有量、加入量计算得平均回收率为99.81%,RSD为1.55%,表明该方法回收率良好。

2.6.5 样品含量测定

供试品溶液显色后测定吸光度值,计算总多糖含量。

3 结果与分析 3.1 不同种质甘草中甘草苷含量动态变化

随着生长期的延长,3个种质甘草中的甘草苷含量变化趋势存在差异。在整个生长周期内:杭锦旗甘草的甘草苷含量上下波动,呈先上升后下降再上升的趋势,含量为0.48%~1.29%,5月14日含量达到最高,为1.29%,6月14日含量最低,为0.48%,仅6月14日采收的样品中甘草苷含量未达到药典标准规定的0.5%。赤峰甘草的甘草苷含量波动较为平稳,呈先下降后上升循环式变化,含量为0.90%~1.39%,5月14日含量达到最高,为1.39%,4月14日含量最低,为0.90%,不同生长期赤峰甘草中甘草苷含量均达到药典标准。会宁甘草的甘草苷含量呈先上升后下降再上升的趋势,上下波动较大,含量为1.10%~2.33%,5月1日含量达到最高,为2.33%,6月29日含量最低,为1.10%,所有会宁甘草样品中的甘草苷含量皆达到药典标准。3个种质甘草的甘草苷含量由高到低依次为:会宁>赤峰>杭锦旗。不同种质甘草生长过程中甘草苷含量动态变化见图 3

图 3 不同种质甘草中甘草苷含量动态变化 Fig. 3 Dynamic changes of liquiritin content of Glycyrrhiza uralensis from different origins
3.2 不同种质甘草中甘草素含量动态变化

随着生长期的延长,3个种质甘草中的甘草素含量均呈先下降后上升再下降并趋于平稳的变化趋势。在整个生长周期内:杭锦旗甘草的甘草素含量为0.03%~0.15%,6月29日含量达到最高,为0.15%,10月14日含量最低,为0.03%;赤峰甘草的甘草素含量为0.03%~0.22%,3月14日含量达到最高,为0.22%,10月31日含量最低,为0.03%;会宁甘草的甘草素含量为0.04%~0.21%,3月14日含量达到最高,为0.21%,8月1日含量最低,为0.04%。不同种质甘草生长过程中甘草素含量动态变化见图 4

图 4 不同种质甘草中甘草素含量动态变化 Fig. 4 Dynamic changes of liquiritigenin content of Glycyrrhiza uralensis from different origins
3.3 不同种质甘草中甘草酸含量动态变化

随着生长期的延长,3个种质甘草中的甘草酸含量均呈先上升后下降的趋势。在整个生长周期内:杭锦旗甘草的甘草酸含量为0.83%~2.17%,9月15日含量最高,为2.17%,7月15日含量最低,为0.83%,仅9月15日采收的样品中甘草酸含量达到药典标准规定的2.0%;赤峰甘草的甘草酸含量为1.38%~2.10%,9月15日含量最高,为2.10%,仅其中5批样品的甘草酸含量达到药典标准;会宁甘草的甘草酸含量为2.03%~3.79%,9月15日含量最高,为3.79%,采收的会宁甘草样品中的甘草酸含量全部达到药典标准。3个种质甘草的甘草酸含量由高到低依次为:会宁>赤峰>杭锦旗。不同种质甘草生长过程中甘草酸含量动态变化见图 5

图 5 不同种质甘草中甘草酸含量动态变化 Fig. 5 Dynamic changes of glycyrrhizic acid content of Glycyrrhiza uralensis from different origins
3.4 不同种质甘草中甘草次酸含量动态变化

在整个生长期中,3个种质甘草中的甘草次酸含量均呈缓慢上升的趋势。在生长周期内:杭锦旗甘草的甘草次酸含量为0.15%~0.43%,9月30日含量达到最高,为0.43%,5月1日含量最低,为0.15%;赤峰甘草的甘草次酸含量为0.18%~0.33%,8月1日含量达到最高,为0.33%,3月14日含量最低,为0.18%;会宁甘草的甘草次酸含量为0.08%~0.53%,9月15日含量达到最高,为0.53%,3月14日含量最低,为0.08%。不同种质甘草生长过程中甘草次酸含量动态变化见图 6

图 6 不同种质甘草中甘草次酸含量动态变化 Fig. 6 Dynamic changes of glycyrrhetic acid content of Glycyrrhiza uralensis from different origins
3.5 不同种质甘草中异甘草苷含量动态变化

随着生长期的延长,3个种质甘草中的异甘草苷含量上下波动,无明显变化规律。在整个生长周期内:杭锦旗甘草的异甘草苷含量为0.07%~0.32%,5月14日含量达到最高,为0.32%,9月1日含量最低,为0.07%;赤峰甘草的异甘草苷含量为0.16%~0.41%,5月14日含量达到最高,为0.41%,4月14日含量最低,为0.16%;会宁甘草的异甘草苷含量为0.32%~0.85%,5月14日含量达到最高,为0.85%,4月14日含量最低,为0.32%。3个种质甘草异甘草苷含量由高到低依次为:会宁>赤峰>杭锦旗。不同种质甘草异甘草苷含量动态变化见图 7

图 7 不同种质甘草中异甘草苷含量动态变化 Fig. 7 Dynamic changes of isoliquiritin content of Glycyrrhiza uralensis from different origins
3.6 不同种质甘草中异甘草素含量动态变化

随着生长期的延长,3个种质甘草中的异甘草素含量均呈先下降后上升再下降并趋于平稳的变化趋势。在整个生长周期内:杭锦旗甘草的异甘草素含量为0.02%~0.04%,6月29日含量达到最高,为0.04%,4月14日含量最低,为0.02%;赤峰甘草的异甘草素含量为0.02%~0.07%,6月29日含量达到最高,为0.07%,9月1日含量最低,为0.02%;会宁甘草的异甘草素含量为0.01%~0.08%,6月14日含量达到最高,为0.08%,8月1日含量最低,为0.01%。不同种质甘草生长过程中异甘草素含量动态变化见图 8

图 8 不同种质甘草中异甘草素含量动态变化 Fig. 8 Dynamic changes of isoliquiritigenin content of Glycyrrhiza uralensis from different origins
3.7 不同种质甘草中总黄酮含量动态变化

随着生长期的延长,3个种质甘草中的总黄酮含量均呈缓慢上升的趋势。在不同生长周期内:杭锦旗甘草的总黄酮含量为2.57%~4.97%,9月15日含量达到最高,为4.97%,3月14日含量最低,为2.57%;赤峰甘草的总黄酮含量为3.22%~4.64%,6月14日含量达到最高,为4.64%,5月1日含量最低,为3.22%;会宁甘草的总黄酮含量为2.67%~4.29%,10月14日含量达到最高,为0.53%,3月14日含量最低,为2.67%。不同种质甘草生长过程中总黄酮含量动态变化见图 9

图 9 不同种质甘草中总黄酮含量动态变化 Fig. 9 Dynamic changes of total flavonoids content of Glycyrrhiza uralensis from different origins
3.8 不同种质甘草中总多糖含量动态变化

随着生长期的延长,3个种质甘草中的总多糖含量均呈缓慢下降最后趋于平稳的趋势。在整个生长周期内:杭锦旗甘草的总多糖含量为16.79%~56.17%,3月28日含量达到最高,为56.17%,8月18日含量最低,为16.79%;赤峰甘草的总多糖含量为11.39%~41.11%,3月14日含量达到最高,为41.11%,7月15日含量最低,为11.39%;会宁甘草的总多糖含量为11.99%~50.89%,3月28日含量达到最高,为50.89%,8月18日含量最低,为11.99%。不同种质甘草生长过程中总多糖含量动态变化见图 10

图 10 不同种质甘草中总多糖含量动态变化 Fig. 10 Dynamic changes of total polysaccharide content of Glycyrrhiza uralensis from different origins
3.9 不同种质甘草的活性成分合成累积动态变化规律

3个种质甘草的物候期略有不同,在同一时间内采收的药材质量也会有所差异。本次实验中对所含8种主要功效成分含量进行测定、考察分析发现,3种种质甘草中单成分含量整体变化趋势相似,其中甘草苷含量在5月及9月中旬较高,甘草素含量在3月及5~6月有峰值。甘草酸含量在9月中旬较高,甘草次酸含量在7月中旬及9月中旬出现峰值,异甘草苷含量在5月中旬含量较高,异甘草素含量在5~6月有峰值;总黄酮结果分析,3种种质甘草总黄酮含量在各月中差异较小,总多糖含量在3月及5月含量较高。综合分析不同种质甘草,杭锦旗甘草在9月采收时质量较好,赤峰甘草在7月中下旬采收时质量较好,会宁甘草在6月中旬采收时各成分含量较高。

本次实验在天津引种3种种质甘草发现,杭锦旗甘草、赤峰甘草和会宁甘草在天津表现出良好的适应性,在1年内不同的采收期中,会宁甘草药效成分合成累积量表现优异,具有较强的优良种质特性,因此,会宁甘草在天津盐碱土壤环境中规模化引种具有明显的潜力,这对扩大甘草中药材产地来源有着借鉴意义。

4 讨论

药材有效成分含量的差异是遗传因子、环境因子和人为因素共同作用的结果。在同质条件下,气候环境因子以及田间管理措施基本一致,遗传基础是导致药材化学成分含量差异的主要因素。有学者[18]采用基因测序技术研究甘草、光果甘草和胀果甘草之间的遗传多样性,并采用HPLC检测其化学多样性,结果表明光果甘草中三萜类化合物含量显著高于甘草和胀果甘草,而甘草中的黄酮类化合物均高于光果甘草和胀果甘草。另有学者[19]比较了中国北方4个不同环境下种植的4种甘草中的5种化学成分含量差异,结果表明,环境和基因型能显著影响5种化学成分的含量,其中甘草苷和异甘草苷受遗传因子影响较大,而甘草素和异甘草素受环境因子影响较大,甘草酸则同时受到两者影响。综上所述,遗传与环境因素对甘草中化学成分的含量影响较大。在本研究中,根据甘草耐盐碱的特性,在天津引种3种种质甘草,分析不同种质甘草在相同的种植环境中不同采收期所含化学成分含量变化,结果分析可得,3个种质甘草在同质条件下8种药效成分含量变化趋势均表现出一定的差异性,其中会宁甘草的甘草苷、甘草酸和异甘草苷含量在各采收时间内均高于杭锦旗和赤峰甘草,质量优势明显,但3个种质甘草的甘草素、甘草次酸、异甘草素、总黄酮和总多糖含量无明显差异。

在本研究中,引种于天津3个种质甘草的物候期略有不同,在同一时间内采收的药材质量有所差异。本考察研究结果表明:其中杭锦旗甘草,9月15日采收的药材综合品质最好,适宜采收期在9月中旬,即白露至秋分时节;赤峰甘草8月1日采收的药材综合品质最好,适宜采收期在7月底至8月初,即大暑至立秋时节;会宁甘草7月15日采收的药材综合品质最好,适宜采收期在7月中旬,即小暑至大暑时节。在本研究中,活性含量测定结果分析表明3个种质甘草的适宜采收期在夏秋之交,与传统采收时间存在差异,推测与天津地区当年的温度和降水量等气候环境因子有关,其适宜采收期是否稳定仍需要进一步进行生长发育动态的连续观测。同时,本研究中的3个种质甘草春季采收的药材品质整体上不如秋季,这与大多数学者研究甘草采收期所得结果一致。

中药材品种选育应兼顾产量和质量。筛选出产量高但质量低的品种无法达到《中国药典》的质量标准,容易产生劣药,影响临床疗效。在本研究中,3个种质甘草引种天津后,在1年生长周期内,不同采收期甘草主要活性成分合成累积动态波动变化差异并不显著,但有效成分含量有显著差异。基于8种药效成分含量进行考察,3个种质甘草的药材质量由高到低依次为:会宁>赤峰>杭锦旗,会宁种质甘草在不同采收期内活性成分合成累积量水平均高,具有较强的优良种质特性。因此在天津地区引种栽培会宁甘草更易培育出优质的甘草中药材。

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Study on the dynamic changes of synthesis and accumulation of 8 main active ingredients in glycyrrhiza germplasm from 3 different germplasm sources
WANG Xuna1 , HE Qi1 , ZHANG Naijiao2 , CHEN Yanguo2 , WANG Xueyuan2 , YUAN Hongyu2 , LI Guohui1 , LI Tianxiang1     
1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China;
2. China Medico Corporation, Tianjin 300301, China
Abstract: [Objective] The study focuses on the introduction of three wild varieties of Glycyrrhiza uralensis, Hangjin Banner, Chifeng, and Huining, from the licorice authentic production areas in China, into Tianjin. Samples were collected every 15 days during the one-year growth period to determine the content of eight main functional components. The synthesis and accumulation patterns and characteristics of active components in medicinal materials of different qualities and harvesting periods of licorice from the three production areas were systematically investigated, and excellent sources were screened. [Methods] Collect samples every half month, and use HPLC, NaNO2-Al(NO3) 3-NaOH colorimetric method, and anthrone H2SO4 method to determine the content of 8 main active ingredients in samples at different harvesting periods. Investigate the dynamic changes and patterns of the synthesis and accumulation of active ingredients. [Results] The changes in the synthesis and accumulation of liquiritigenin, glycyrrhetinic acid, isoliquiritigenin, total flavonoids, and total polysaccharides in three germplasm licorice samples introduced to Tianjin at different harvesting periods were basically consistent. However, the content of liquiritin, glycyrrhetinic acid, and isoliquiritin Huining licorice was higher than that in Hangjinqi and Chifeng licorice at different harvesting times. [Conclusion] Three wild germplasm of Glycyrrhiza uralensis have good growth adaptability after being introduced to Tianjin. During the one-year growth cycle, there is no significant difference in the dynamic synthesis trend of the main active functional substances and functional components in licorice at different harvest periods. The Huining germplasm of licorice has a high level of cumulative synthesis of functional components and strong excellent germplasm characteristics. Therefore, the large-scale introduction of Huining licorice in Tianjin's saline alkali soil environment has obvious potential.
Key words: Glycyrrhiza uralensis    harvest period    high-performance liquid chromatography    total flavonoids    total polysaccharides