急性肺损伤（ALI）是一种由多种致病因素引起的急性、弥漫性、炎症性肺损伤，其高发病率和病死率对公众健康构成了严重威胁^[1-2]。目前，ALI主要的干预手段是机械通气，但该策略可能会导致呼吸机相关性肺损伤^[3-4]，患者的生活质量和病死率并没有显著改善。其他治疗方法，如皮质类固醇具有一些益处，但会带来许多毒副作用，包括皮肤萎缩、骨密度降低和胃肠不适^[5]。由于尚无特异性药物治疗，ALI常进展为急性呼吸窘迫综合征，其病死率高达40%~60%^[6]。因此，探索有效的保护性干预措施和防治策略具有重要意义。

《黄帝内经》有“肺与大肠相表里”之说，即肺与肠互相影响、互相依存^[7]。最近的研究表明，肠道菌群可以通过“肠肺轴”影响ALI的肺功能^{[3, 8-10]}。因此，改善肠道菌群结构可能成为防治ALI的重要途径。鱼腥草素钠（SH）具有包括抗菌和抗炎在内的多种生物活性，对肺组织有保护作用^[11]。有报道称，SH可通过调节肠道微生物群来缓解肺部疾病^[12-13]。然而，SH在调节ALI肠道微生物群及肺组织损伤中的作用仍不清楚。因此，本研究旨在探讨SH在体内对脂多糖（LPS）诱导的ALI小鼠肠道菌群的影响及可能机制。

1 材料与方法 1.1 主要材料及试剂

SH（K196584，纯度≥98%）购自西安开来生物工程有限公司。LPS（大肠杆菌055：B5，L118716）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。4%多聚甲醛固定液（BL539A）购自北京莱博科技有限公司。苏木精-伊红（HE）染色液（BA4097-500 mL）购自珠海贝索生物技术有限公司。肿瘤坏死因子-α（TNF-α，JL10484）、白细胞介素-6（IL-6，JL20268）、白细胞介素-1β（IL-1β，JL18442）和髓过氧化物酶（MPO，JL10367）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。一抗c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、丝裂原活化蛋白激酶（P38）和p-P38购自美国CST公司。二辛可宁酸（BCA）蛋白分析试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗、增强的化学发光试剂盒购自碧云天生物技术公司。

1.2 动物模型的建立和分组

18只SPF级雄性BALB/c小鼠，6~8周龄，体质量18~22 g，来自斯贝福生物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2019-0010]。小鼠饲养在标准实验室条件下，保持12 h光照/黑暗循环，温度为（25±1）℃，湿度为60%±5%，可自由饮水和进食。动物研究严格遵守实验动物护理和使用指南，并获得伦理委员会的批准（批号：wydw2023-0323）。适应1周后，将小鼠随机分为3组：对照组、模型组（LPS组）和SH组（LPS+SH 100 mg/kg），每组6只。SH组灌胃SH（100 mg/kg）^[13]，对照组和LPS组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续7 d。末次给药30 min后，除对照组外，其他组气管内注射LPS（5 mg/kg）溶液诱导ALI模型。对照组以生理盐水代替LPS^[14]。LPS注射后24 h对小鼠实施安乐死，并采集肺组织和粪便样本。

1.3 实验方法 1.3.1 组织学检查

将采集的肺右上叶在4% 多聚甲醛中固定过夜，脱水、石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，并用HE染色液染色。使用光学显微镜（OLYMPUS BX51）观察图像。

1.3.2 肺湿质量/干质量（W/D）比的测量

取小鼠右肺中叶，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，滤纸吸干表面多余水分，用精密电子天平称量肺组织，测定肺湿质量。然后将肺组织放入80 ℃干燥器中，充分干燥72 h，直至质量稳定。将干燥后的肺组织质量记录为肺干质量。最后计算肺湿质量/干质量（W/D）比值，以评估小鼠肺水肿程度。

1.3.3 肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和MPO活性的测定

按照制造商的说明，使用ELISA试剂盒测量肺组织中的TNF-α、IL-6、IL-1β和MPO水平。

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western blot）分析

取肺组织与RIPA裂解液混合，研磨10~15 min。样品在冰上搅拌30 min，然后收集上清液。用BCA蛋白分析试剂盒对蛋白质水平进行定量。然后，蛋白质样品经10%SDS-PAGE电泳分离蛋白条带。将蛋白质从凝胶中转移到聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂干奶封闭2 h。膜与一抗（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜。在室温下与HRP标记的二抗（1∶1 000）孵育1 h后，用增强的化学发光试剂盒检测蛋白表达，并使用Image J软件进行半定量分析。

1.3.5 肠道菌群分析

收集不同组别的粪便样本，用粪便DNA试剂盒（D5625-01，Omega Bio-Tek）提取每个粪便样本的总DNA。通过凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度，将DNA储存在-80 ℃下以备进一步分析。通过PCR扩增方法对样本DNA进行扩增，以富集细菌16S rDNA基因的V3-V4区。使用微孔板读数仪（FLx800，BioTek）和Agilent Bioanalyzer 2100系统（Agilent Technologies Inc.）对PCR产物进行定量。使用NovaSeq测序仪和NovaSeq 6000 SP试剂盒（500次循环）通过进行高通量测序。Chao指数反映物种丰富度，Shannon和Simpson指数反映样品内物种丰富度及均匀度，用于评估群体间的α多样性，使用基于非加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）来评估β多样性，分析肠道菌群的聚类特征。

1.3.6 统计学方法

使用GraphPad Prism软件8.0进行统计分析。正态分布的连续变量以均数±标准差（x ± s）表示，组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较检验进行分析。非正态分布的连续变量以中位数（四分位数）表示，使用非参数检验Kruskal-Wallis和Dunn’s Test多重比较进行分析。进行Spearman相关性分析以探索炎症标志物与肠道菌群组成之间的关系。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 SH对ALI小鼠肺组织的保护作用

造模后各组小鼠均出现体质量下降，但各组小鼠体质量变化无差异（图 2A），各组小鼠均未出现死亡。肺组织水肿是ALI的主要特征，其表现为肺W/D比值增加。与对照组相比，模型组小鼠在LPS刺激后肺组织W/D比值明显升高（Z=-3.298，P=0.002），而SH可降低LPS诱导的ALI小鼠肺组织W/D比值（Z= -2.541，P=0.017）。见图 1B。

接着探讨了每组小鼠的组织病理变化情况，见图 2。对照组肺组织结构完整，肺泡排列规则，未见组织病理学改变。与对照组相比，模型组肺泡和肺间质中可见大量炎症细胞浸润，伴有肺泡壁断裂、肺泡结构破坏及间质水肿，并可观察到局灶性肺泡出血及气道壁增厚。SH干预后，肺组织病变程度显著减轻，炎症细胞浸润明显减少，肺泡结构基本保持完整，间质水肿及出血情况明显改善。

2.2 SH对ALI小鼠炎症反应的影响

模型组小鼠肺组织MPO活性较对照组明显升高（Z=-3.353，P=0.001），而SH可明显逆转LPS引起的这种变化（Z=-2.487，P=0.019）。LPS诱导肺组织中TNF-α（Z=-3.461，P=0.000 8）、IL-6（Z=-3.678，P=0.000 4）和IL-1β（Z=-3.244，P=0.001 8）的产生显著增加，而SH组降低了LPS诱导的肺组织中TNF-α（Z= -2.379，P=0.026）、IL-6（Z=-2.163，P=0.046）和IL-1β（Z=-2.271，P=0.035）的水平（P < 0.05）。见图 3。

2.3 SH对ALI小鼠JNK信号通路的影响

模型组小鼠JNK/P38信号传导激活，p-JNK（Z=-3.708，P=0.000 3）和p-P38（Z=-3.569，P=0.000 5）蛋白表达显著升高，而SH抑制了JNK/P38信号传导（Z=-2.138，P=0.048；Z=-2.271，P=0.035）。见图 4。

2.4 SH对ALI小鼠肠道菌群多样性的影响

多样性指数分析显示，模型组肠道微生物组的α多样性显著低于对照组，即与对照组相比，模型组的Chao1、Shannon、Simpson和观察到的物种指数降低（Z=3.136，P=0.003；Z=3.244，P=0.002；Z=2.974，P=0.004；Z =2.866，P=0.006），SH组显著高于模型组（Z=2.541，P=0.017；Z=2.433，P=0.022；Z=2.866，P=0.006；Z =2.650，P=0.012）。见图 5A。PCoA图显示，3组的菌群组成明显分开，提示SH显著影响ALI小鼠的肠道菌群β多样性。见图 5B。

2.5 SH对ALI小鼠肠道菌群组成的影响

为了确定SH对肠道菌群的影响，研究比较了3组在门和属水平上的微生物分类群。在门水平上，与对照组相比，模型组Firmicutes的相对丰度降低，而Proteobacteria的相对丰度增加。与模型组相比，SH组Firmicutes的相对丰度升高，而Proteobacteria的相对丰度降低。见图 6A。在属水平上，与对照组相比，模型组unidentified_Enterobacteriaceae、Bacteroides和Klebsiella的相对丰度增加，而Ligilactobacillus、Lactobacillus和Akkermansia的丰度降低，而在SH组观察到了相反的趋势。见图 6B。

2.6 肠道微生物组成与炎症标志物的关系

此外，研究评估了肠道菌群与炎症指标及肺水肿之间的相关性，结果显示炎症指标及肺水肿与Proteobacteria、Klebsiella和g_unidentified_Enterobacteriaceae呈正相关（P < 0.05），与Akkermansia、Lactobacillus和Ligilactobacillus呈负相关（P < 0.05）。见图 7。

3 讨论

LPS诱导的ALI是一种高度可重复的模型，能够反映临床病理生理学^[15-16]。本研究通过LPS诱导建立ALI模型，证明了SH在保护ALI方面的有效性。肺水肿是ALI的一个典型症状，本研究使用肺W/D比来量化ALI的直接影响，结果发现SH可以显著减轻肺水肿，同时减少肺组织的炎症细胞浸润和肺组织的病理损伤，显著降低肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。这些变化与先前对ALI的改善研究一致^{[15, 17]}，这表明SH可以有效改善LPS诱导的ALI，但SH改善ALI的分子机制仍需进一步探讨。MAPKs家族包括c-Jun NH2末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）可调节炎症和先天免疫^[18-20]。通过抑制p38 /JNK通路可改善小鼠ALI并降低细胞因子表达^[21]。本研究发现SH可以显著抑制P-p38 MAPK和P-JNK蛋白水平。这些结果表明SH减弱了LPS诱导的肺组织炎症反应，可能是通过抑制p38 MAPK/JNK信号通路实现的。

肺与大肠相通是中医重要理论之一，人体肠道菌群的稳定性显著影响肺部疾病的发展^{[7, 16]}。大量研究支持肠道菌群通过传递肠肺轴激活与ALI的发生发展密切相关^{[3, 8-10]}。本研究中，SH组肠道菌群丰富度较模型组有所升高，提示SH改善了ALI引起的肠道菌群失衡，调节肠道菌群的丰富度和多样性。在门水平上，生物体的肠道菌群以Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria为主^[22]，微生物群落对LPS诱导的ALI的反应主要趋势是Firmicutes的减少和Proteobacteria的增加^[23]。Proteobacteria是一种革兰氏阴性需氧菌，被认为是肠道菌群失调的标志，也是LPS的重要来源，可诱发炎症并与多种慢性疾病有关^[24]。SH降低了ALI小鼠肠道中Proteobacteria的丰富度，表明其具有减轻致病菌积累的潜力。SH还能改善肠道中属水平的菌群组成，可有效增加Ligilactobacillus、Lactobacillus和Akkermansia的丰度。相关性分析发现ALI小鼠肺部环境中的促炎介质IL-1β、TNF-α、IL-6及肺水肿与肠道菌群组成密切相关。

综上所述，SH对LPS诱导的小鼠ALI具有一定的保护作用，其潜在机制可能涉及通过抑制JNK/p38信号通路减轻炎症反应以及改善肠道菌群紊乱。然而，本研究存在一定局限性：首先，虽然观察到SH处理组JNK/p38通路相关蛋白磷酸化水平下降，但目前仅基于蛋白水平变化推测其作用机制，尚缺乏特异性抑制剂干预、基因敲除或过表达等进一步直接验证，因此推测SH可能通过JNK/p38信号通路发挥作用的证据尚显不足；其次，肠道菌群如何具体调节肺部炎症反应的机制尚未深入阐明。未来将通过更多机制性实验（如信号通路特异性抑制剂干预）进一步验证JNK/p38信号通路的作用，以及探讨肠道菌群在肺保护作用中的具体机制。