2025, Vol. 42文章信息
- 朱婷, 陈欣, 赵鑫, 等.
- ZHU Ting, CHEN Xin, ZHAO Xin, et al.
- 健脾养肝丸调控肠嗜铬细胞及其TPH1-5-HT信号通路治疗IBS-D大鼠的机制研究
- Mechanism study on Jianpi Yanggan Pill in regulating enterochromaffin cells and TPH1-5-HT signaling pathway in treating IBS-D rats
- 天津中医药, 2025, 42(9): 1192-1201
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2025, 42(9): 1192-1201
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2025.09.15
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文章历史
- 收稿日期: 2025-04-28
引用本文 |
2. 会泽县中医院脾胃病科，会泽 654200;
3. 云南中医药大学第一附属医院，昆明 650500
腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是一种功能性胃肠病，发病时以腹痛、腹胀、大便性状异常等症状为主[1]。内脏高敏感（VH）在IBS-D发病机制中十分常见，研究表明，约有94%的IBS-D患者均有内脏高敏感的症状[2]。
5-羟色胺（5-HT）主要分布在胃肠道中，主要由肠嗜铬细胞（EC）分泌，其主要储存于EC的致密核心囊泡中。5-HT作为一种神经递质，在脑肠轴通路信息的传递中起着重要作用[3]。色氨酸羟化酶（TPH）是5-HT合成过程中的关键限速酶，可影响到肠道中5-HT的产生，因此，EC及其TPH1-5-HT信号通路在IBS-D内脏高敏感发病机制中扮演着重要角色。
目前，针对IBS-D的治疗包括良好的医患关系、生活及饮食习惯的调整、药物治疗（解痉剂、止泻剂、胃肠动力剂、通便剂、不被肠道吸收的抗生素、肠道微生态制剂等）[4-5]。针对焦虑或抑郁状态的患者，可选择心理干预或应用神经递质调节剂如三环类抗抑郁药（TCAs）和5-HT再摄取抑制剂（SSRIs）等[6]，但部分患者临床疗效尚不能令人满意，症状的反复发作及肠外症状也是本病治疗的难点[7-8]。因此，需要在更多的高质量研究和临床实践经验中继续探索IBS-D更优的治疗策略。中药制剂具有多成分、多靶点、多途径、整体性等特点，具有治疗方法丰富、不良反应较少、应用广泛等优点。从现有证据来看[9]，中医药在IBS-D治疗领域无论是短期的单一症状改善，如腹痛、腹泻、便秘等，还是维持疾病的缓解，中医药辨证论治对于IBS-D核心病机都表现出了一定的特色和优势。
健脾养肝丸由参苓白术散加减化裁而来，功能上健脾和胃，疏肝理气，化湿止泻[10]，作为云南省中医医院院内制剂，健脾养肝丸在脾胃病科门诊及住院部广泛应用于治疗IBS-D多年，具有坚实的临床应用基础。
在此基础上，本研究为探索健脾养肝丸治疗IBS-D的VH机制，建立IBS-D大鼠模型，在此模型上研究健脾养肝丸对IBS-D大鼠EC/5-HT通路的调控作用，从分子层面及细胞超微结构层面来探讨健脾养肝丸改善VH的可能作用机制，为其临床应用提供实验依据，现报告如下。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级大鼠购于昆明医科大学[生产许可证号：SCXK（滇）K2020-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（滇）K2020-0006]，研究使用出生2 d的SPF级雄性SD幼鼠，体质量为3~8 g，幼鼠36只，母鼠6只（为幼鼠提供母乳，不参与造模、给药等相关实验操作），饲养于云南中医药大学动物实验室，在20~26 ℃的室温，40%~70%的相对湿度以及12 h /12 h昼夜明暗交替饲养，进行实验。本研究动物实验相关操作均获得云南省中医医院动物伦理委员会的批准，项目批准号：DW-2023-025。
1.2 实验药物健脾养肝丸由山药15 g，白术（麸炒）15 g，北沙参15 g，银柴胡15 g，白芍15 g，茯苓15 g，薏苡仁15 g，砂仁10 g，乌药5 g，黄芩5 g，乌梅10 g，山楂10 g，陈皮10 g，甘草5 g组成。健脾养肝丸购自云南省中医医院（云南中医药大学第一附属医院）中药房，剂型为丸剂。将本方剂人单日使用剂量按照实验动物研究“等效剂量”计算方法（按70 kg成人体表面积换算标准剂量）换算成大鼠单日用量为2.1 g/（kg·d）。得舒特（匹维溴铵）规格：50 mg/片；批准文号：HJ20160396。用灭菌蒸馏水将其溶解成1.5 mg/mL的溶液，并将其放于4 ℃冰箱低温保存备用。
1.3 试剂与仪器 1.3.1 主要实验试剂5-HT酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（武汉贝莱茵生物科技有限公司，货号：RA20031）；Total RNA Extractor（Trizo1，上海生工生物工程股份有限公司，批号：B511311-0100）；反转录试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司，批号：CGC101）；BestarTM实时定量聚合酶链反应（qPCR）Mastemmix（SYBR Green，DBIBioscienceDBI，德国，批号DBI-2043）；10%水合氯醛（上海源叶生物科技有限公司，JR22837A）、4%多聚甲醛通用型组织固定液（白鲨生物科技有限公司，23234596）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，武汉赛维尔生物科技有限公司，G4202-500 mL），电镜固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：240003004）；苏木素染液、伊红染液等所有其他化学品均为分析级，均来自标准商业供应商。
1.3.2 主要仪器RM6240E多道生理信号采集处理系统（四川成都仪器厂）；BiofugePrimoR台式高速离心机（Thermo Fisher美国）；KZ-5F-3D研磨仪（武汉塞维尔）；Applied Biosystems VaitiPCR仪（Thermo Fisher美国）；LightCycler 96荧光定量PCR仪（Roche瑞士）；RM2235切片机（德国Leica）；ASP300S（德国Leica）；EG1150H+EG1130C组织包埋仪（德国Leica）。
2 研究方法 2.1 模型的制备采用母婴分离结合束缚应激[11-13]的方法进行造模。自新生大鼠出生后第2天开始，每天定时将新生大鼠与哺乳期母鼠分开3 h，持续14 d。当新生大鼠7周龄时，每天定时给予束缚应激2 h，连续刺激14 d。当新生大鼠9周龄时，在20、40、60、80 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa，下同）压力下给予结直肠扩张（CRD）刺激，引起大鼠的疼痛，表现为不同程度内脏痛引起的行为学反应，称为腹部回撤反射（AWR）。根据模型组大鼠一般状态变化、粪便Bristol性状评分、粪便含水率及腹泻指数高于空白组为造模成功的参考[14]，具体评价标准[15-16]：1）大鼠稀便率≥60%。2）AWR≥3分。
2.2 分组与给药大鼠造模期间，没有经母婴分离的大鼠作为空白组，母婴分离大鼠随机分为模型组、健脾养肝丸低剂量组、健脾养肝丸中剂量组、健脾养肝丸高剂量组和匹维溴铵组，每组6只，造模结束后开始对各组大鼠进行灌胃给药，参考《药理实验方法学》[17]的换算公式，将各组药物按体表面积换算成大鼠的等效剂量。每天分别给予健脾养肝丸高剂量组4.2 g/（kg·d）、健脾养肝丸中剂量组2.1 g/（kg·d）、健脾养肝丸低剂量组1.05 g/（kg·d）、匹维溴铵0.015 g/（kg·d）灌胃，空白组以及模型组大鼠则用等体积生理盐水灌胃，连续给药14 d。
2.3 标本采集与处理实验结束前1 d，各组大鼠禁食不禁水。实验结束当天用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射进行麻醉。于大鼠心尖取血后，4 ℃静置1 h后3 000 r/min离心10 min，离心半径为15 cm，分离血清。再将标本放置-80 ℃冰箱保存，后续用于5-HT ELISA试剂盒检测。解剖分离大鼠结肠末端，部分放置于浓度为4%多聚甲醛通用型组织固定液中固定，用于结肠苏木精-伊红（HE）染色；另一部分放于电镜固定液中固定；其余部分放置-80 ℃冰箱保存用于ELISA、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）实验。
2.4 观察指标 2.4.1 一般状态变化实验过程中记录各组大鼠的体质量、精神状态、皮毛色泽、反应力、活动度、肛周和尾部是否可见稀便等污渍。
2.4.2 粪便Bristol性状评分在造模后和治疗后对各组大鼠粪便进行Bristol性状评分[18]。大鼠粪便Bristol形状评分表见表 1。
| 分数 | 粪便图片 | 性状评分 |
| 1 |  |
粪便为分散的干球便，且难排出 |
| 2 |  |
粪便的性状为多块状、腊肠状 |
| 3 |  |
粪便呈腊肠样，但表面有裂隙 |
| 4 |  |
粪便为腊肠样或蛇状，表明光滑而柔软 |
| 5 |  |
粪便容易排出，呈柔软团块，其边缘清楚 |
| 6 |  |
粪便呈软片状或糊状便，其边缘毛躁 |
| 7 |  |
粪便为水样便，无固态成分 |
分别于造模后和治疗后收集各组大鼠24 h粪便，立即对其称质量，即为粪便湿质量，随后将粪便放于烘箱中，每间隔4 h干燥后再次称质量，直至粪便质量无变化则记为粪便干质量，计算出粪便含水率=（粪便湿质量-粪便干质量）/粪便湿质量×100%[15]。
2.4.4 稀便率、稀便级和腹泻指数的测定分别在造模后及给药后第7、14天进行腹泻指数[19]检测，检测当天给药结束后，将大鼠置于垫有裁剪后的A4白纸的代谢笼内，每笼1只，每隔1 h更换白纸，连续检测5 h，记录每只大鼠的稀便粒数以及粪便总粒数。干便与稀便的区分方法：以白纸上有无污迹为标准，观察并记录5 h内大鼠排出的粪便颗粒数及粪便的稀便率（黏纸点数/排便点数×100%）。稀便率＝大鼠所排稀便粒数/粪便总粒数。若粪便形状近似圆形则测量直径，若非圆形则测量最长的与近似圆的长度，取其平均值；若粪便边界模糊，粒数不清，则视为1粒。稀便级按滤纸污迹的直径分为4级，< 1 cm为1级，≥1 cm且＜2 cm为2级，≥2 cm，腹泻指数＝稀便率×平均稀便级。
2.4.5 大鼠内脏敏感性评分实验前24 h将大鼠禁食不禁水，并用棉球蘸取少量乙醚在密闭装置中麻醉大鼠。将医用导尿管用石蜡油润滑，然后将其插入大鼠肛门至距离肛缘7 cm的位置，随即用医用胶带将导管和大鼠尾端根部包裹起来以便固定带球囊的导管。然后将大鼠置于不能转身的透明塑料笼子里，仅允许大鼠前后运动，待大鼠苏醒后，将导尿管与三通管连接、三通管另外两头分别连接50 mL注射器与压力传感器，压力传感器连接压力信号采集器，并利用RM6240E多道生理信号采集处理系统E2.6版采集实时结肠内压力。实验时，利用注射器向球囊内充气进行结直肠扩张刺激，通过分阶段加压使结肠内气囊压力稳定于为20、40、60、80 mmHg，并记录各压力下AWR评分，每次扩张20 s，每种压力测量3次，取平均值。结直肠扩张时按照AWR评分标准进行评分[16]，具体评价标准[20]：AWR≥3分。AWR评分越高则表明大鼠对直肠扩张的刺激越强，且内脏敏感性越高。AWR评分标准见表 2。
| 分级 | 状态 | 大鼠反应 |
| 1 |  |
大鼠有动作停顿后出现短暂的头部运动行为 |
| 2 |  |
可见腹部肌肉收缩 |
| 3 |  |
有腹部抬起行为 |
| 4 |  |
身体拱起，并抬起盆腔和阴囊 |
取4%多聚甲醛通用型组织固定液固定结肠组织，标本常规脱水、石蜡包埋、组织切片。切片常规脱蜡；采用苏木精-伊红进行染色；乙醇、二甲苯脱水；中性树胶封片。光镜下观察大鼠结肠组织形态病变情况。
2.4.7 ELISA检测大鼠血清及结肠组织中5-HT含量剪取各组大鼠结肠组织，制备匀浆，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，制备上样品，检测大鼠血清及结肠组织中5-HT水平。
2.4.8 荧光定量PCR法检测TPH1的mRNA表达定制合成目的基因所需引物，利用低温高速研磨仪制备组织匀浆，利用Trizol提取保存在-80 ℃中大鼠结肠组织中的总RNA，利用cDNA逆转录试剂盒操作将提取的RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green Supermix kit（Takara）在RT-qPCR扩增仪上检测并计算目的基因的相对表达。PCR反应体系（共10 μL）包括：cDNA模板1 μL，Green定量PCR SuperMix试剂5 μL，正、反向引物（由上海欧易生物医学科技有限公司设计，由北京擎科新业生物科技有限公司合成，具体序列及产物长度见表 1）各0.2 μL，无核酶水3.6 μL。反应条件如下：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，共45个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法以GraphPad Prism 10.0软件计算TPH1 mRNA的表达水平，结果以对照组为标准进行归一化处理。引物序列见表 3。
| 基因 | 引物序列（5’-3’） | 产物长度 |
| GAPDH | 正向引物：GCCTTCTCTTGTGACAAAGT | 102 |
| 反向引物：CTTGCCGTGGGTAGAGTCATA | ||
| TPH1 | 正向引物：GATGGTCAGTCTGGATGCTATG | 83 |
| 反向引物：GTCTCCTTGAAGTCTAGTGTGTG |
组织切片经68 ℃烤箱烤片2 h，二甲苯脱蜡，100 %、85 %、75 %梯度乙醇水化，PBS洗涤。3 %的H2O2封闭内源性过氧化氢酶15 min，柠檬酸缓冲液（pH 6.0）修复。经PBS洗涤后滴加稀释好的CgA抗体，4 ℃孵育过夜。第2天用PBS洗片，依次滴加反应增强液和酶标山羊抗鼠/兔IgG聚合物，分别在37 ℃保温箱中孵育20 min和30 min。然后经PBS洗片后用试剂1二氨基联苯（DAB）染色，苏木素复染，氨水反蓝。经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性胶封片，晾干后扫片。
2.4.10 荧光显微镜下检测大鼠结肠组织中CgA的阳染情况石蜡切片置于修复缓冲液中修复。加入自发荧光淬灭剂，流水冲洗。然后用0.01 mol/L PBST漂洗5 min×3/次；2 % BSA 37 ℃湿盒内封闭30 min；加CgA一抗在4 ℃孵育过夜，在脱色摇床轻轻摇动。然后在PBS中清洗切片3次，并在湿盒中用荧光素偶联的二抗避光染色2 h，再在PBS中清洗切片3次。切片稍甩干后在圈内滴加DAP染液，避光室温孵育。玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片，切片于荧光显微镜下观察并采集图像。
2.4.11 电镜下检测结肠嗜铬细胞超微细结构的改变取结肠组织中段将其修剪成大小约1 mm×1 mm×1 mm体积，放入2.5%戊二醛中固定2 h，PBS漂洗10 min，1%锇酸固定2 h，PBS漂洗15 min，饱和醋酸铀染色2 h，梯度丙酮脱水（70%、80%、90%、100%丙酮各10 min，其中100%丙酮2次，10 min/次），浸透包埋，精确定位，超薄切片，并将其置于透射电镜下观察拍照。
2.5 统计学方法通过SPSS 26.0软件分析数据，所有数据资料以均数±标准差（x ± s）表示，若数据符合正态性分布，方差齐，采用参数统计的单因素方差分析（One-WayANOVA）对多组统计处理，多组之间的两两比较采用LSD法。若方差不齐或偏态分布，则采用非参数检验中的多个独立样本Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用SNK-q法进行统计学处理。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 造模前后大鼠一般情况比较造模前大鼠体质量匀速增长、精神状良好、行动活跃敏捷、温顺、易捉拿、毛发柔顺发亮、粪便成形、肛周及尾部未见稀便及污渍附着。造模后大鼠精神萎靡易激怒、难捉拿、毛发枯泽、肛周及尾部可见或多或少的稀便及污渍附着，散发臭味，各组大鼠无死亡或脱落。
3.2 造模及治疗前后大鼠体质量变化本研究测量了母婴分离结合束缚应激前后（第7、8周）及治疗前后（第9、10周）各组大鼠的体质量，取每周平均值做表。见表 4。
| g | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 第7周 | 第8周 | 第9周 | 第10周 | ||||||||||||||||||||||||
| 空白组 | 6 | 213.48±13.26 | 253.92±10.91 | 309.55± 9.05 | 352.22±8.42 | ||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 6 | 212.36±14.21 | 232.16±13.07* | 259.55±11.42** | 302.49±9.53** | ||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸低剂量组 | 6 | 207.26± 7.99 | 231.13±10.78* | 270.45±11.30** | 321.37±7.42** | ||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸中剂量组 | 6 | 210.93±10.54 | 233.10±11.59* | 276.95± 9.41** | 325.38±3.54# | ||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸高剂量组 | 6 | 209.26± 8.80 | 231.21±10.60* | 276.95± 9.41** | 323.00±3.90** | ||||||||||||||||||||||||
| 匹维溴铵组 | 6 | 212.51±14.87 | 223.83± 8.66** | 268.61±10.57** | 313.53±8.65 | ||||||||||||||||||||||||
| 注：与空白组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05。 | |||||||||||||||||||||||||||||
结果表明，母婴分离结合束缚应激前各组间大鼠体质量无明显差异；造模后，模型组的体质量低于空白组大鼠，而健脾养肝丸高、中、低剂量组较模型组体质量有所回升，其中健脾养肝丸中剂量组体质量回升最为明显（P < 0.01），匹维溴铵组体质量回升虽较模型组高，但是较健脾养肝丸高、中、低剂量组低。
3.3 各组大鼠Bristol粪便性状评分、粪便含水率、腹泻指数比较给药前，与空白组比较，模型组大鼠Bristol粪便性状评分显著升高（P < 0.01）；给药后，与模型组比较，健脾养肝丸中剂量组大鼠Bristol粪便性状评分显著降低（P < 0.05），且健脾养肝丸高、中、低剂量组改善大鼠粪便性状的作用优于匹维溴铵组；给药后，健脾养肝丸中剂量能明显降低IBS-D大鼠粪便含水率，促进肠道对水分的重吸收，与模型组比较有明显差异（P < 0.01），而匹维溴铵组降低IBS-D大鼠粪便含水率仅次于健脾养肝丸中剂量组，健脾养肝丸高、低剂量组降低IBS-D大鼠粪便含水率次于健脾养肝丸中剂量及匹维溴铵组。给药前，与空白组比较，模型组、健脾养肝丸高、中、低剂量组、匹维溴铵组大鼠腹泻指数显著升高（P < 0.01）。给药后，与空白组比较，模型组大鼠腹泻指数仍升高（P < 0.01）；与模型组比较，健脾养肝丸高剂量、低剂量组大鼠腹泻指数显著降低（P < 0.01），健脾养肝丸中剂量组次之（P < 0.01），匹维溴铵组腹泻指数下降趋势较于健脾养肝丸高、中、低剂量组低。见表 5。
| 组别 | 动物数 | 粪便评分（分） | 粪便含水率（%） | 腹泻指数 | |||||
| 给药前 | 给药后 | 给药前 | 给药后 | 给药前 | 给药后 | ||||
| 空白组 | 6 | 3.67±0.47 | 4.33±0.47 | 38.50±3.40 | 39.50±3.69 | 0.00 | 0.00 | ||
| 模型组 | 6 | 5.67±0.75** | 5.33±0.47** | 78.67±4.03** | 79.17±2.11** | 1.42±0.13** | 1.42±0.15** | ||
| 健脾养肝丸低剂量组 | 6 | 5.17±0.37 | 4.50±0.5 | 78.68±6.26** | 66.60±7.66## | 1.40±0.17** | 1.01±0.12## | ||
| 健脾养肝丸中剂量组 | 6 | 5.17±0.69** | 4.33±0.47# | 78.00±5.32** | 57.67±3.64## | 1.40±0.14** | 0.94±0.13## | ||
| 健脾养肝丸高剂量组 | 6 | 5.00±0.82 | 4.50±0.5 | 78.99±7.48** | 65.07±5.48## | 1.41±0.11** | 0.99±0.14## | ||
| 匹维溴铵组 | 6 | 5.33±0.47** | 4.67±0.47 | 78.67±4.11** | 64.5±2.99 | 1.46±0.10** | 1.13±0.12** | ||
| 注：与空白组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 | |||||||||
给药前，与空白组比较，各组大鼠80 mmHg压力下AWR评分显著升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。给药后，与模型组比较，在60 mmHg压力下，健脾养肝丸中、高剂量组AWR评分显著降低，健脾养肝丸低剂量组及匹维溴铵组AWR评分降低较健脾养肝丸中、高剂量组次之，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表 6。
| 分 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 给药前 | |||||||||||||||||||||||||||
| 20 mmHg | 40 mmHg | 60 mmHg | 80 mmHg | ||||||||||||||||||||||||||
| 空白组 | 6 | 0.50±0.50 | 1.50±0.50 | 2.17±0.69 | 2.33±0.94 | ||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 6 | 0.50±0.50 | 2.17±0.69 | 3.17±0.69 | 3.83±0.37** | ||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸低剂量 | 6 | 0.67±0.47 | 2.17±0.37 | 3.50±0.50*# | 3.67±0.47** | ||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸中剂量 | 6 | 0.83±0.37 | 2.33±0.47 | 3.33±0.47## | 3.83±0.37** | ||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸高剂量 | 6 | 0.67±0.47 | 2.00±0.58 | 3.00±0.58## | 3.83±0.37** | ||||||||||||||||||||||||
| 匹维溴铵组 | 6 | 0.33±0.47 | 2.17±0.69 | 3.00±0.82## | 3.67±0.75* | ||||||||||||||||||||||||
| 注：与空白组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
空白组结肠黏膜形态完好，无炎症细胞浸润，无充血，无水肿，上皮排列整齐，腺体结构排列规则；模型组大鼠结肠偶见黏膜下层轻微水肿，少量炎症细胞浸润；经健脾养肝丸治疗后，结肠黏膜下层轻微水肿得到改善，极少见到炎症细胞浸润，上皮表面微绒毛完整，排列整齐，上皮细胞紧密连接，腺体结构排列规则，无其他病理损害；匹维溴铵组的改善作用较健脾养肝丸高、中、低剂量组次之。见图 1。
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| 注：标尺=50 μm。 图 1 各组大鼠结肠组织病理学变化（HE染色） Fig. 1 Histopathological changes of colon tissues of rats in each groups(HE staining) |
CgA是胃肠道EC分泌颗粒中含量最多的蛋白之一，是EC的经典标志物[21]，且肠道CgA密度的降低被视为肠道EC总量的减少[22]。为了进一步探讨5-HT的分泌在IBS-D内脏高敏感中的关系，本课题组采用免疫组化检测结肠组织中CgA的表达情况（图 2A），与空白组大鼠相比，IBS-D大鼠结肠组织中出现CgA阳性表达，此外，通过采用免疫荧光检测结肠组织中CgA及TPH1的表达情况（图 2B）发现，与空白组大鼠相比，IBS-D大鼠结肠组织中出现CgA、TPH1阳性表达且荧光强度增加，健脾养肝丸高、中、低组大鼠结肠组织中CgA及TPH1阳性表达降低且荧光强度减弱。以上结果显示IBS-D大鼠的EC细胞正处于活跃合成5-HT的状态，这可能是IBS-D大鼠内脏高敏感的重要原因，通过健脾养肝丸治疗后EC异常的分泌状态得到改善。见图 2。
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| 注：图A为CgA免疫组化染色图像；图B为TPH1+CgA免疫荧光图像。 图 2 各组大鼠结肠组织免疫组化染色、免疫荧光染色代表性图像（×200） Fig. 2 Representative images of immunofluorescence staining and immunohistochemical staining of colon tissues of rats in each group(×200) |
在超微结构下EC细胞的分泌颗粒小（100~200 nm），电子密度高，呈现圆形、椭圆形、肾形、梨形等；其分泌颗粒常位于细胞的基底部的细胞质的小泡中，细胞顶端开放于肠腺腔内，有微绒毛伸入肠腔面[23]。本课题组采用透射电镜发现，在空白组中，EC细胞数量较少，且形态以圆形或椭圆形较多见，分泌颗粒少。模型组中可见肠腺隐窝内呈锥形的EC细胞，一端有微绒毛伸向肠腔面，EC细胞内含有大量的内分泌颗粒位于细胞基底部。而健脾养肝丸高、中、低剂量组EC细胞整体呈现椭圆形，分泌颗粒减少，其中健脾养肝丸中剂量组的EC细胞表现更明显。这提示健脾养肝丸可能是通过影响肠嗜铬细胞中5-HT的分泌，减轻了IBS-D大鼠的内脏高敏感。见图 3。
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| 注：红色箭头代表分泌颗粒。 图 3 各组大鼠结肠嗜铬细胞电镜下代表图像比较 Fig. 3 Representative electron micrographs of colonic enterochromaffin cells of rats in each group |
通过观察各组大鼠结肠组织中5-HT浓度，与空白组对比，模型组大鼠结肠5-HT的浓度显著增加，差异具有统计学意义（P < 0.01）；健脾养肝丸高、中、低剂量组大鼠5-HT的浓度显著低于模型组，差异具有统计学意义（P < 0.01），匹维溴铵也可降低大鼠结肠中5-HT的浓度，但相较于健脾养肝丸高、中、低剂量作用弱（P < 0.01）；血清中检测的5-HT浓度，模型组大鼠较空白组对比，5-HT的浓度显著增加，差异具有统计学意义（P < 0.05），健脾养肝丸中剂量组大鼠5-HT的浓度低于模型组，差异具有统计学意义（P < 0.05）。见表 7。
| ng/mL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | 动物数 | 结肠5-HT浓度 | 血清5-HT浓度 | ||||||||||||||||||||||||||
| 空白组 | 6 | 6.94±0.85 | 1.01±0.28 | ||||||||||||||||||||||||||
| 模型组 | 6 | 16.18±1.55** | 1.57±0.31* | ||||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸低剂量组 | 6 | 11.15±0.94## | 1.35±0.29 | ||||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸中剂量组 | 6 | 10.45±1.10## | 1.11±0.10# | ||||||||||||||||||||||||||
| 健脾养肝丸高剂量组 | 6 | 10.93±1.37## | 1.19±0.14 | ||||||||||||||||||||||||||
| 匹维溴铵组 | 6 | 12.29±1.49## | 1.34±0.27 | ||||||||||||||||||||||||||
| 注：与空白组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，与模型组比较，##P < 0.01。 | |||||||||||||||||||||||||||||
TPH1是5-HT合成的限速酶，为进一步探讨5-HT异常升高的原因，研究比较了大鼠结肠组织TPH1 mRNA的表达情况，发现模型组大鼠TPH1的mRNA相对表达量与空白组相比呈现明显增多趋势（P < 0.01），而健脾养肝丸高、中、低剂量组大鼠TPH1的mRNA相对表达量较模型组显著降低（P < 0.01），匹维溴铵组次之。见表 8。
| 分组 | 动物数 | TPH1的mRNA相对表达量 |
| 空白组 | 6 | 0.62±0.60 |
| 模型组 | 6 | 2.16±0.21** |
| 健脾养肝丸低剂量组 | 6 | 1.25±0.17## |
| 健脾养肝丸中剂量组 | 6 | 1.12±0.09## |
| 健脾养肝丸高剂量组 | 6 | 1.23±0.23## |
| 匹维溴铵组 | 6 | 1.44±0.29## |
| 注：与空白组比较，**P < 0.01，与模型组比较，##P < 0.01。 | ||
中医没有IBS-D这一病名，但根据IBS-D的临床症状，可将其归属于“泄泻”“腹痛”等范畴，关于泄泻病因包括：外感邪气、饮食不节、情志失调、素体阳虚阴虚。明代吴昆的《医方考》中指出：“泻责之脾，痛责之肝，肝责之实，脾责之虚。”脾虚则水谷精微无法正常运化，导致清浊不分，水谷混杂而下，从而发生泄泻，当肝气郁滞或肝实时，会导致气机失调，出现腹痛等症状。肝气横逆乘脾，可致脾失健运，痰湿内生，导致腹痛、腹泻加重。可见在脾胃病的发病中，肝脾关系最为密切。肝脾失调则致气机不畅，运化失常，湿邪下趋于大肠而导致腹痛、泄泻，因而龙祖宏教授在治疗慢性腹泻时常常以健脾和胃、疏肝理气、调畅气机为基本治法。
健脾养肝丸是云南省中医医院的自制剂，源于国家级名中医龙祖宏教授50多年来治疗肝郁脾虚型慢性腹泻的经验总结。健脾养肝丸由参苓白术散加减化裁而来，参苓白术散源于宋代的《太平惠民和剂局方》，是治疗脾虚泄泻的代表性方剂，健脾养肝丸在此基础上加减后在功能上健脾和胃，疏肝理气，调畅气机。健脾养肝丸方药组成如下：山药、白术（麸炒）、北沙参、银柴胡、白芍、茯苓、薏苡仁、砂仁、乌药、黄芩、乌梅、山楂、陈皮、甘草。方中山药、白术（麸炒）、北沙参、茯苓、薏苡仁、砂仁、陈皮、甘草组成参苓白术散健脾化湿止泻，柴胡味苦、性平、入肝胆经，解表退热、疏肝解郁、升举阳气，大剂量（20~30 g）主要起解表退热的作用，尤善于疏散少阳半表半里之邪。黄芩味苦、性寒、入肝胆经，清热燥湿，泻火解毒。两药相伍，一散一清、一升一降，转变阴阳升降之枢纽，从而升中清热，降中散郁，进而助运脾胃。白芍味苦、酸，性微寒，归肝脾经，方中柴胡与之相伍，一散一收，一气一血，动静结合，相得益彰，使肝气得疏，阴血又得固守，共奏升阳敛阴、解郁镇痛之功。乌梅味苦、涩，性平，归肝、脾、肺、大肠经，敛肺涩肠，养胃以生津而防肝气横逆。山楂归脾、胃、肝经，消肉积滞、下气。全方共奏健脾和胃，疏肝理气，调畅气机之功，补虚不忘祛邪，达标本兼顾之效。健脾养肝丸在本院门诊及住院部广泛应用于治疗腹泻型肠易激综合征多年，具有坚实的临床应用基础。前期临床使用观察到：健脾养肝丸能有效改善IBS-D大鼠Bristol粪便性状评分，缓解IBS-D临床病人腹痛、胀满等症状，疗效显著。
IBS-D的发生是精神心理状态、性别、遗传、饮食习惯、社会环境等多种病理因素影响的结果，主要涉及胃肠动力异常、内脏高敏感性、肠道感染、脑-肠轴与胃肠激素异常等方面[24]。其中内脏高敏感是IBS-D的核心发病机制，EC是肠上皮中的一种重要的神经内分泌细胞，肠内分泌细胞在脑-肠道轴中的作用仍存在许多未知问题，大脑和肠道之间的双向网络仍然是一个重要的研究焦点。研究表明[25]，神经元纤维和EC之间存在突触关系，EC分泌的产物作用于位于迷走神经传入纤维上的受体并激活它们，激活的迷走神经输入纤维在到达大脑之前与脑干（孤束核和结状神经节）相互作用，从而实现肠道的运动、分泌以及与大脑的双向通信。此外，EC附近血管的存在支持了其分泌产物通过血流运输到作用部位的观点，最后，当细胞分泌产物时，它通常会引起局部或旁分泌功能，对结肠组织产生强效影响[25]。5-HT作为一种与胃肠运动紊乱相关的信号分子[26]，95%分布于胃肠道[20]，其中有90%包装在EC底部和顶部的分泌颗粒中[27]，当肠道受到刺激后，EC便会促进5-HT从其颗粒中释放，它的释放是刺激内脏感觉、肠蠕动和渗透性的重要媒介。且有研究表明，EC的增生及其囊泡中5-HT的高存在参与IBS-D的内脏致敏和痛敏[28]，同时研究发现过量的5-HT分泌会导致腹泻[29]，而色氨酸羟化酶（TPH）是5-HT合成过程中的关键限速酶，5-HT的合成过程都是以TPH依赖的方式进行的，TPH有两种亚型色氨酸羟化酶1（TPH1）和色氨酸羟化酶2（TPH2）[30]，而TPH1作为TPH的主要异构体，主要在肠上皮的肠嗜铬细胞中表达[31]，其可介导EC重摄取色氨酸并将其转化为5-HT的直接前体5-羟色氨酸（5-HTP），进而脱羧生成5-HT[29]。而分布于胃肠道中的TPH1，可直接影响5-HT的代谢功能[32]，可见THP1直接影响到肠道中5-HT的产生，增强THP1表达将会提高肠道中5-HT的水平。所以降低TPH1表达水平对于减少5-HT的合成有重要意义。
此外，EC具有电兴奋性，因为它们具有电压门控钠（Na+）和钙（Ca2+）通道；且它们使用特定的受体和信号网络来识别重要的信号[33]。其中介导内脏高敏感的是瞬时受体电位1（TRPA 1），其在痛觉传导中起关键作用，特别是在冷痛和化学性疼痛中，激活TRPA1受体会导致神经元的去极化，从而引发动作电位，传递疼痛信号[34]。该受体刺激钠和钙通道，涉及到EC通过神经元迷走纤维释放5-HT从而参与内脏高敏感。同时研究发现5-羟色胺转运体（5-HTT）基因敲除的小鼠表现出内脏致敏、胃肠道疾病以及EC和结肠5-HT浓度的相对比例增加[35-36]。此外，EC细胞释放的5-HT还可以调节肠道微生物群物种[28]，而关于肠道微生物群物种如何参与调控内脏高敏感，还有待进一步研究。
同时，本研究发现5-HT的异常分泌导致5-HT信号传递失调是参与IBS-D内脏高敏感发病的关键环节。因此，健脾养肝丸改善IBS-D内脏高敏感与调控EC/5-HT信号传导关系密切。本研究发现IBS-D模型大鼠Bristol粪便性状评分升高，痛觉阈值降低。经健脾养肝丸治疗后，降低了IBS-D大鼠粪便Bristol性状评分、升高了大鼠的内脏疼痛阈值，内脏敏感性显著减弱，提示健脾养肝丸可以有效改善IBS-D大鼠的内脏高敏感。通过追溯其原因发现，健脾养肝丸不仅能降低结肠及血清中5-HT水平，还能减少TPH1在结肠组织中的表达；而且在本研究中还发现，经过健脾养肝丸治疗后，结肠中5-HT的水平相较于血清中5-HT的水平更具显著性，因此5-HT在介导内脏高敏感的途径中更多偏向于通过激活受体实现，少部分通过血流运输实现；同时，通过免疫组化及免疫荧光观察CgA、TPH1的阳染情况，研究发现健脾养肝丸能有效减少CgA及TPH1的表达，且电镜下发现健脾养肝丸可以干预EC的形态、减少EC分泌颗粒的产生，这些证据表明健脾养肝丸改善IBS-D大鼠内脏高敏感的潜在作用可能与减少EC分泌5-HT的产生以及降低TPH1的表达有关。
综上可知，健脾养肝丸可能通过降低TPH1介导EC重摄取色氨酸分解成为5-HTP，进而减少5-HT的生成从而降低内脏高敏感。此外，后续研究还可以选择TRPA1的拮抗剂类药物作为阳性对照，围绕IBS-D内脏高敏感机制更多维度地挖掘中医药可能存在的治疗靶点及机制。
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