2026, Vol. 43文章信息
- 曾碧雨, 黄良江, 罗琪, 等.
- ZENG Biyu, HUANG Liangjiang, LUO Qi, et al.
- 丹参-郁金药对缓解肝癌作用机制研究
- Study on the mechanism of Danshen-Yujin herbal drug pair treating hepatocellular carcinoma
- 天津中医药, 2026, 43(1): 73-89
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(1): 73-89
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.01.13
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文章历史
- 收稿日期: 2025-10-11
引用本文 |
2. 广西中医药大学第一附属医院, 南宁 530023;
3. 广西中医药大学附属瑞康医院, 南宁 530011;
4. 区域重大病种创新产品研发广西高校工程研究中心, 南宁 530011
肝癌是一种严重危害人类健康和生命的常见恶性肿瘤。据统计，全球每年有约85万人死于肝癌，其中中国约占一半[1]。肝癌的临床表现多样，常见的有黄疸、腹水、腹痛、消瘦、发热等，严重影响患者的生活质量和预后[2]。目前，肝癌的治疗主要包括手术切除、放射治疗、化学治疗、靶向治疗等，但是这些方法都存在一定的局限性和副作用，如手术切除只适用于早期肝癌，放射治疗和化学治疗会损伤正常组织，靶向治疗会导致耐药性等[3]。因此，寻找一种安全有效、经济适用的肝癌治疗方法，是当前医学界亟需解决的重大临床难题。
中医药在肝癌的防治方面显示出了独特的优势。中医认为肝癌属于“结病”“癌病”等范畴，是由于正气虚弱，邪气乘虚而蕴结于肝，形成痞块，乃至肝癌[4]。中医药不仅可以缓解肝癌患者的临床症状，提高生活质量，还可以抑制肿瘤的生长和转移，增强机体免疫力，延长生存期[5]。中医药已在世界范围内被广泛接受，对癌症患者具有较好的治疗效果[6]。既往研究表明，传统草药联合化疗或放疗，可以改善治疗效果和生活质量，减少不良反应，延长生存期[7-11]。
网络药理学与中医药的整体观和辨证论治原则相契合，能够有效地解决中医药成分复杂、作用机制不明等问题，通过构建药物-靶点-疾病的网络模型，从整体的角度分析药物的作用机制和药效物质，为新药的发现和研究提供新思路和新方法[12]。药对不仅是中药配伍的基本形式，也是方药之间的桥梁。丹参-郁金是一组常见的中药药对，丹参味苦，性微寒，具有活血通经、解郁除烦的作用；郁金气味苦辛，性寒，又入血气，具有活血化瘀、解郁清心的功效。丹参-郁金具有多种活性成分，具有治疗各种类型肝癌的良好效果和安全性。而网络药理学可以筛选出药物的核心化合物，进而预测药物作用于疾病的靶点、参与的通路，更为具象地展现中药“多成分-多靶点”的作用机制。笔者利用网络药理学及生物信息学技术，通过对丹参-郁金药对核心成分、作用于肝癌的靶点及相关通路的分析，探究其干预治疗肝癌的作用机制，为进一步实验研究及临床应用提供参考。
1 资料与方法 1.1 中药复方作用靶点的筛选以“丹参”“郁金”作为关键词，从中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，网址 https://tcmspw.com/tcmsp.php）中药系统药理数据分析平台搜集了《中华人民共和国药典》中499种中药，含2 984种成分，311个靶标和837个相关疾病中对丹参、郁金的药物作用靶点进行了研究。该数据库采用预测算法获得药物靶点之间的关系，并为每种化合物提供了包括了生物利用度（OB）、成药相似性（DL）等药物药代动力学信息。此外，OMIM数据库、GeneCards数据库用于筛选肝癌的病理靶点。通过Venn图对中药药物靶点以及肝癌病理靶点的进行整合，以确定潜在中药治疗肝癌的作用机制。
1.2 TCGA数据TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）作为目前最大的癌症基因信息数据库，保存包括基因表达数据、拷贝数变异、SNP等数据。下载了肝癌数据的原始的mRNA表达数据。共收集424份样本，其中正常组（50例），肿瘤组（374例），用于后续分析。
1.3 GO和KEGG功能注释使用R包“ClusterProfiler”对基因进行功能注释，以全面探讨这些交集靶点的功能相关性。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）被用来评估相关的功能类别。P值和q值均小于0.05的GO和KEGG富集通路被认为是显著性类别。
1.4 随机生存森林算法随机生存森林（Random Survival Forest）是一种机器学习算法，用于分析生存数据。使用randomForestSRC软件包进行随机生存森林算法对特征基因进行筛选，并对预后相关基因的重要性进行排序（nrep=1 000，这表明蒙特卡罗模拟中的迭代次数为1 000）。确定相对重要性> 0.3的基因作为最终特征基因。
1.5 免疫细胞浸润分析CIBERSORT方法是一种广泛应用于微环境中免疫细胞类型的评价方法。该方法基于支持向量回归原理，对免疫细胞亚型的表达矩阵进行反卷积分析。它包含547个生物标记物，区分了22种人类免疫细胞表型，包括T细胞、B细胞、浆细胞以及髓细胞亚群。本研究使用CIBERSORT算法对患者的数据进行分析，用来推断22种免疫浸润细胞的相对比例，并对基因表达量以及免疫细胞含量进行Spearman相关性分析。
1.6 基因集富集分析（GSEA）通过GSEA进一步分析高低表达组之间的信号通路差异情况。背景基因集是从MsigDB数据库下载的版本7.0注释基因集作为亚型通路的注析基因集，做亚型之间通路的差异表达分析，根据一致性得分对显著富集的基因集（调整P < 0.05）进行排序。GSEA分析常用于疾病分型与生物学意义结合密切的探究。
1.7 基因集差异分析（GSVA）GSVA是评估转录组基因集富集情况的一种非参数无监督方法。GSVA通过对感兴趣的基因集合进行综合打分，将基因水平变化转变为通路水平变化，进而判断样本的生物学功能。本研究将从分子特征数据库（Molecular signatures database）下载基因集合，采用GSVA算法对每个基因集合进行综合打分，评估不同样本潜在的生物学功能变化。
1.8 Nomogram模型构建Nomogram是建立在回归分析的基础上，根据基因的表达量以及临床症状，然后采用带有刻度的线段，按照一定的比例绘制在同一平面上，从而用以表达预测模型中各个变量之间的相互关系。通过构建多因素回归模型，根据模型中各个影响因素对结局变量的贡献程度（回归系数的大小），给每个影响因素的每个取值水平进行赋分，然后再将各个评分相加得到总评分，从而计算出预测值。
2 结果 2.1 药物活性成分和靶向基因的筛选通过网络药理学的方法用于帮助确定丹参郁金对肝癌的作用。本研究首先使用TCMSP数据库基于丹参、郁金这2种中药，以OB≥30%、DL≥0.18作为阈值进行筛选，获取所含药物有效成分以及有效成分所作用的靶点，最终得到对应药物靶点共61个（表 1），并使用Cytoscape通过网络图的形式展示中药成分与靶点的作用关系（图 1）。随后通过GeneCards数据库，提取相关度分数（Relevance score）>15的基因探讨肝癌的相关靶点1 862个，OMIM数据库得到肝癌靶点490个，去重后共2 327个疾病靶点。然后将疾病靶点与前者的61个药物靶点取交集，得31个交集靶点（图 2）。
| 中药 | 专业数据库 | 成分 | OB（%） | DL |
| Salvia miltiorrhiza Bunge | MOL001601 | 1，2，5，6-tetrahydrotanshinone | 38.75 | 0.36 |
| MOL001659 | Poriferasterol | 43.83 | 0.76 | |
| MOL001771 | Poriferast-5-en-3beta-ol | 36.91 | 0.75 | |
| MOL001942 | Isoimperatorin | 45.46 | 0.23 | |
| MOL002222 | Sugiol | 36.11 | 0.28 | |
| MOL002651 | Dehydrotanshinone ⅡA | 43.76 | 0.4 | |
| MOL002776 | Baicalin | 40.12 | 0.75 | |
| MOL000569 | Digallate | 61.85 | 0.26 | |
| MOL000006 | Luteolin | 36.16 | 0.25 | |
| MOL006824 | α-amyrin | 39.51 | 0.76 | |
| MOL007036 | 5，6-dihydroxy-7-isopropyl-1，1-dimethyl-2，3-dihydrophenanthren-4-one | 33.77 | 0.29 | |
| MOL007041 | 2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3，4-dione | 40.86 | 0.23 | |
| MOL007045 | 3α-hydroxytanshinoneⅡA | 44.93 | 0.44 | |
| MOL007048 | （E）-3-[2-（3，4-dihydroxyphenyl）-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid | 48.24 | 0.31 | |
| MOL007049 | 4-methylenemiltirone | 34.35 | 0.23 | |
| MOL007050 | 2-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-5-（3-hydroxypropyl）-7-methoxy-3-benzofurancarboxaldehyde | 62.78 | 0.4 | |
| MOL007051 | 6-o-syringyl-8-o-acetyl shanzhiside methyl ester | 46.69 | 0.71 | |
| MOL007058 | Formyltanshinone | 73.44 | 0.42 | |
| MOL007059 | 3-beta-Hydroxymethyllenetanshiquinone | 32.16 | 0.41 | |
| MOL007061 | Methylenetanshinquinone | 37.07 | 0.36 | |
| MOL007063 | Przewalskin A | 37.11 | 0.65 | |
| MOL007064 | Przewalskin B | 110.3 | 0.44 | |
| MOL007068 | Przewaquinone B | 62.24 | 0.41 | |
| MOL007069 | Przewaquinone C | 55.74 | 0.4 | |
| MOL007070 | （6S，7R）-6，7-dihydroxy-1，6-dimethyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g] benzofuran-10，11-dione | 41.31 | 0.45 | |
| MOL007071 | Przewaquinone F | 40.31 | 0.46 | |
| MOL007077 | Sclareol | 43.67 | 0.21 | |
| MOL007079 | Tanshinaldehyde | 52.47 | 0.45 | |
| MOL007081 | Danshenol B | 57.95 | 0.56 | |
| MOL007082 | Danshenol A | 56.97 | 0.52 | |
| MOL007085 | Salvilenone | 30.38 | 0.38 | |
| MOL007088 | Cryptotanshinone | 52.34 | 0.4 | |
| MOL007093 | Dan-shexinkum D | 38.88 | 0.55 | |
| MOL007094 | Danshenspiroketallactone | 50.43 | 0.31 | |
| MOL007098 | Deoxyneocryptotanshinone | 49.4 | 0.29 | |
| MOL007100 | Dihydrotanshinlactone | 38.68 | 0.32 | |
| MOL007101 | DihydrotanshinoneⅠ | 45.04 | 0.36 | |
| MOL007105 | Epidanshenspiroketallactone | 68.27 | 0.31 | |
| MOL007107 | C09092 | 36.07 | 0.25 | |
| MOL007108 | Isocryptotanshi-none | 54.98 | 0.39 | |
| MOL007111 | Isotanshinone Ⅱ | 49.92 | 0.4 | |
| MOL007115 | Manool | 45.04 | 0.2 | |
| MOL007118 | Microstegiol | 39.61 | 0.28 | |
| MOL007119 | Miltionone Ⅰ | 49.68 | 0.32 | |
| MOL007120 | Miltionone Ⅱ | 71.03 | 0.44 | |
| MOL007121 | Miltipolone | 36.56 | 0.37 | |
| MOL007123 | Miltirone Ⅱ | 44.95 | 0.24 | |
| MOL007124 | Neocryptotanshinone ii | 39.46 | 0.23 | |
| MOL007125 | Neocryptotanshinone | 52.49 | 0.32 | |
| MOL007127 | 1-methyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[5，6-g]benzofuran-6，10，11-trione | 34.72 | 0.37 | |
| MOL007130 | Prolithospermic acid | 64.37 | 0.31 | |
| MOL007132 | （2R）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）-2-（[Z）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）acryloyl]oxy-propionic acid | 109.3 | 0.35 | |
| MOL007140 | （Z）-3-[2-（[E）-2-（3，4-dihydroxyphenyl）vinyl]-3，4-dihydroxy-phenyl] acrylic acid | 88.54 | 0.26 | |
| MOL007141 | Salvianolic acid G | 45.56 | 0.61 | |
| MOL007142 | Salvianolic acid J | 43.38 | 0.72 | |
| MOL007143 | Salvilenone Ⅰ | 32.43 | 0.23 | |
| MOL007145 | Salviolone | 31.72 | 0.24 | |
| MOL007149 | NSC 122421 | 34.49 | 0.28 | |
| MOL007150 | （6S）-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g] Benzofuran-10，11-quinone | 75.39 | 0.46 | |
| MOL007151 | Tanshindiol B | 42.67 | 0.45 | |
| MOL007152 | Przewaquinone E | 42.85 | 0.45 | |
| MOL007154 | Tanshinone iia | 49.89 | 0.4 | |
| MOL007155 | （6S）-6-（hydroxymethyl）-1，6-dimethyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-dione | 65.26 | 0.45 | |
| MOL007156 | Tanshinone Ⅵ | 45.64 | 0.3 | |
| Curcuma aromatica Salisb | MOL000358 | Beta-sitosterol | 36.91 | 0.75 |
| MOL000359 | Sitosterol | 36.91 | 0.75 | |
| MOL004241 | Curcolactone | 51.51 | 0.2 | |
| MOL004244 | （4aR，5R，8R，8aR）-5，8-dihydroxy-3，5，8a-trimethyl-6，7，8，9-tetrahydro-4aH-benzo[f]benzofuran-4-one | 59.52 | 0.2 | |
| MOL004253 | Curcumenolactone C | 39.7 | 0.19 | |
| MOL004260 | （E）-1，7-Diphenyl-3-hydroxy-1-hepten-5-one | 64.66 | 0.18 | |
| MOL004263 | （E）-5-Hydroxy-7-（4-hydroxyphenyl）-1-phenyl-1-heptene | 46.9 | 0.19 | |
| MOL004291 | Oxycurcumenol | 67.06 | 0.18 | |
| MOL004305 | Zedoalactone A | 111.4 | 0.19 | |
| MOL004306 | Zedoalactone B | 103.6 | 0.22 | |
| MOL004309 | Zedoalactone E | 85.16 | 0.19 | |
| MOL004311 | Zedoarolide A | 87.97 | 0.3 | |
| MOL004313 | Zedoarolide B | 135.6 | 0.21 | |
| MOL004316 | 1，7-Diphenyl-3-acetoxy-6（E）-hepten | 48.47 | 0.22 | |
| MOL004328 | Naringenin | 59.29 | 0.21 |
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| 图 1 中药成分与靶点的作用关系 Fig. 1 Action mechanism of traditional Chinese medicine components on targets |
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| 图 2 中药药物靶点以及肝癌病理靶点Venn图 Fig. 2 Venn diagram of action targets of Chinese medicine and pathological targets of hepatocellular carcinoma |
本研究通过探讨疾病靶点与药物靶点网络药理学以及通路关系，进一步探讨丹参郁金影响肝癌的潜在机制。利用R包“clusterprofiler”对31个交集靶点基因进行GO富集和KEGG通路分析。GO富集分析包括3个部分：生物过程（BP），细胞成分（CC）和分子功能（MF）。结果显示，基因主要涉及的通路为小分子代谢过程的调控（regulation of small molecule metabolic process）、对雌二醇的应答（response to estradiol）、DNA结合转录因子活性的调控（regulation of DNA - binding transcription factor activity）等信号通路（图 3）。此外，KEGG富集结果显示，基因主要涉及的通路为FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）等信号通路（图 4）。
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| 图 3 GO富集分析 Fig. 3 GO enrichment analysis |
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| 注：上方的条形图中，每个条形表示垂直轴上的GO和KEGG项。每个项中富集的基因数量在横轴上表示。每个条形的颜色表示每个GO和KEGG项的调整P值。项目的颜色越红，其调整后的P值越小。 图 4 KEGG富集分析 Fig. 4 KEGG enrichment analysis |
为了进一步找出交集靶点基因中的关键基因，对上一步的31个交集基因进行随机生存森林分析，确定了相对重要性>0.3的基因作为最终标记（图 5）。此外，对这4个基因进行生存分析发现CCNB1、VEGFA、MAPK3在生存中的差异具有统计学意义（图 6-9）。这3个基因将作为后续研究的关键基因。
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| 图 5 交集基因随机生存森林分析 Fig. 5 Random survival forest analysis for overlapping genes |
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| 图 6 MAPK3生存分析 Fig. 6 MAPK3 survival analysis |
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| 图 7 VEGFA生存分析 Fig. 7 VEGFA survival analysis |
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| 图 8 CCNB1生存分析 Fig. 8 CCNB1 survival analysis |
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| 图 9 PCNA生存分析 Fig. 9 PCNA survival analysis |
免疫微环境主要由免疫细胞、细胞外基质、多种生长因子、炎症因子及特殊的理化特征等共同组成，显著影响着疾病的诊断和临床治疗敏感性。通过分析在肝癌数据集中关键基因与免疫浸润的关系，进一步探讨关键基因影响肝癌进展的潜在分子机制。免疫细胞含量以及免疫细胞之间的相关性如图所示（图 10-11）。研究结果表明，与正常患者相比，肿瘤组样本的患者调节性T细胞（T cells regulatory，Tregs）、M0型巨噬细胞（Macrophages M0）、静息态树突状细胞（Dendritic cells resting，rDCs）、M2型巨噬细胞（Macrophages M2）显著升高（图 12）。
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| 图 10 免疫细胞含量图 Fig. 10 Immune cell composition plot |
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| 图 11 免疫细胞之间的相关性 Fig. 11 Correlations among immune cells |
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| 图 12 两组样本对比图 Fig. 12 Comparison plot between two sample groups |
此外，进一步探讨关键基因与免疫细胞之间的关系，发现多个关键基因与免疫细胞高度相关，CCNB1与Macrophages M0、Tregs等显著正相关，与Macrophages M2、单核细胞（Monocytes）等显著负相关（图 13）；VEGFA与Macrophages M0、记忆B细胞（B cells memory）等显著正相关，与γδ T细胞（T cells gamma delta）、Macrophages M2等显著负相关（图 14）；MAPK3与Macrophages M0、Tregs等显著正相关，与Macrophages M2、Monocytes等显著负相关（图 15）。从TISIDB数据库中获得这3个关键基因与不同免疫因子之间的相关性，包括免疫调节因子、趋化因子和细胞受体等（图 16）。这些分析揭示了关键基因与免疫细胞浸润水平密切相关，并在免疫微环境中发挥重要作用。
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| 图 13 免疫细胞含量与CCNB1表达的相关分析 Fig. 13 Correlation between cibersort and expression of CCNB1 |
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| 图 14 免疫细胞浸润与VEGFA表达的相关性分析 Fig. 14 Correlation between cibersort and expression of VEGFA |
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| 图 15 免疫细胞含量与MAPK3基因表达的关联分析 Fig. 15 Correlation between cibersort and expression of MAPK3 |
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| 图 16 3个关键基因与不同免疫因子间的相关性 Fig. 16 Correlation analysis of three key genes with multiple immune factors |
通过GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）获得了自噬相关的疾病基因。对其中Relevance score前20个基因的表达水平进行分析，分析疾病基因的组间表达差异，发现AMBRA1、ATG10、ATG12、ATG13等基因的表达在两组患者中都具有显著差异（图 17）。此外，发现3个关键基因的表达水平和多个患病相关基因的表达水平显著相关（图 18），其中CCNB1和ATG4B显著正相关（r=0.632），MAPK3和ATG7显著正相关（r=0.616）。此外，通过miRcode数据库对3个关键基因进行反向预测，得到72个miRNA，共121对mRNA-miRNA关系对，并使用Cytoscape可视化见开放科学（资源服务）标识码。
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| 图 17 两组患者的基因表达分析 Fig. 17 Comparative analysis of gene expression of patients between the two groups |
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| 图 18 关键基因与多个患病相关基因表达水平的相关性分析 Fig. 18 Correlation of pivotal genes with the expression of multiple disease?related genes |
接下来研究3个关键基因富集的具体信号通路，探讨关键基因影响肝癌进展的潜在分子机制，GSEA结果显示，CCNB1富集到的通路有细胞周期（Cell cycle）、DNA复制（DNA replication）、mRNA监视通路（mRNA surveillance pathway）等通路；VEGFA富集到的通路有DNA replication、缝隙连接（Gap junction）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）等通路；MAPK3富集到的通路有Cell cycle、溶酶体（Lysosome）、Notch信号通路（Notch signaling pathway）等通路，关键基因通路富集分析图见开放科学（资源服务）标识码。
2.7 基因集差异分析（GSVA）另外，GSVA结果显示，高表达CCNB1富集E2F靶标、mTORC1信号传导（mTORC1 signaling）、p53 pathway等信号通路（图 19A）；高表达VEGFA富集p53 pathway、mTORC1 signaling、DNA修复（DNA repair）等信号通路（图 19B）；高表达MAPK3富集IL2 STAT5信号传导（IL2 STAT5 SIGNALING）、TGF-β信号传导（TGF-beta signaling）、I3K-AKT-mTOR信号传导（PI3K-AKTmTOR signaling）等信号通路（图 19C）。
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| 图 19 CCNB1、VEGFA和MAPK3的GSVA分析图 Fig. 19 GSVA plot of CCNB1、VEGFA and MAPK3 |
通过关键基因表达量将他们回归分析的结果通过列线图的形式展现，其中回归分析的结果表明在所有样本中，肝癌的不同临床指标的值和CCNB1、VEGFA、MAPK3表达分布在整个打分过程中有着不同程度的贡献（图 20）。同时对1年和3年两个时期的总生存期（OS）情况也进行了预测分析（图 21），结果表明预测到的OS与观察到的OS较为吻合，该Nomogram模型具有较好的预测效能。
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| 图 20 列线图 Fig. 20 Nomogram |
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| 注：图A，列线图的ROC曲线；图B，列线图的校准曲线。 图 21 列线图的ROC曲线和校准曲线 Fig. 21 ROC curve and calibration curve of the nomogram |
中医治疗肝癌的原则是调和阴阳，疏通气机，化瘀散结，清热解毒，扶正祛邪。而且，现代研究表明，情志因素与肝癌发病关系密切，而情志不畅多由于肝气郁结所致，所以郁被认为是引起及加重肝癌的重要因素之一[4]。随着肝癌的患病率、病死率逐年增高[13]，针对“肝癌”的中医药相关研究越来越多。丹参和郁金常以药对形式被广大医家应用于肝癌的治疗当中，其具有抗炎抗氧化等多种药理作用；有证据表明，它们可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导肝癌细胞的凋亡和自噬，调节肝癌细胞的信号通路等[14]。
本研究发现丹参-郁金药对在治疗肝癌中发挥作用的主要成分是黄酮类化合物、二萜类化合物、酚酸类化合物、甾醇类化合物等。其中黄酮类化合物以黄芩苷（Baicalin）、木犀草素（luteolin）为主。Sun等[15]通过细胞实验发现Baicalin可能通过抑制ROCK1/GSK-3β/β-catenin信号传导来减少肝癌的增殖和转移；Lee等[16]发现luteolin诱导的ER应激可能以p53非依赖性的方式发挥抗癌作用。丹参-郁金药对中的二萜类化合物以丹参酮类二萜为主。Qian等[17]证明了丹参酮I（Tanshinone I）联合放疗在治疗肝癌方面表现出更好的治疗潜力。Xu等[18]发现丹酚酸B（Salvianolic acid B）通过调节Hippo/YAP通路和同步促进pSmad3L向pSmad3C表达，在体内外均具有抗肝癌作用。研究发现以β-谷甾醇（β- sitosterol）为主的甾醇类化合物对HepG2和Huh7细胞具有细胞毒性作用，但对正常人原代成纤维细胞没有细胞毒性作用。β-sitosterol能够以剂量依赖的方式抑制HepG2和Huh7细胞的增殖[19]。除此之外，本研究筛选后得到丹参-郁金药对治疗肝癌的靶点共31个，体现了丹参-郁金药对治疗肝癌具有多成分、多靶点协同作用的特点。
机器学习算法可获得更精细的模型，已广泛应用于生物标志物的探索。本研究引入随机生存森林算法[20]，在分析丹参-郁金药对核心成分-关键靶点-目标通路的靶点时，发现VEGFA、CCNB1、MAPK3等发挥重要作用。VEGFA是一种影响肝癌的生长因子，它可以促进血管生成，调节肿瘤血管和免疫细胞，增加肿瘤血管的通透性，从而导致肝癌的发展和转移[21]。有研究表明丹参和郁金中的两种活性成分都可以通过影响VEGFA相关的信号通路，减少肝癌细胞的血管生成能力，从而抑制肿瘤的发展和转移。CCNB1是一种细胞周期调控蛋白，它与CDK1形成复合物，促进有丝分裂的进程，同时在肝癌中的表达水平与肿瘤的分化程度、临床分期、预后和治疗反应有关[22]。研究显示，在体外实验和裸鼠移植模型中，CCNB1可以通过调节p53 pathway，促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制细胞凋亡，诱导多药耐药，促进血管生成和转移[23]。而MAPK3是一种参与细胞生长、分化、凋亡等过程的蛋白激酶，它在肝癌中可能起到促进作用[24]。一些研究发现，MAPK3的高表达与肝癌的低分化、高分期、差预后和低化疗敏感性相关，在体外实验和裸鼠移植模型中，木犀草素均被证明可诱导细胞凋亡并抑制HepG2细胞的增殖，这些类黄酮可能与MAPK3等相互作用，对肝细胞癌的抑制作用可能是通过调节与癌症、PI3K-Akt、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的microRNA和核心靶蛋白的内分泌耐药性等通路相关的核心蛋白来实现，因此，通过抑制MAPK3的表达，可以抑制肝癌细胞的增殖和凋亡，增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性[25]。
GO与KEGG分析结果显示，丹参-郁金药对的靶点基因主要富集在regulation of small molecule metabolic process、response to estradiol、regulation of DNA-binding transcription factor activity等信号通路生物过程及FoxO signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、p53 signaling pathway等信号通路，能够多靶点、多层面参与各种生物进程。FoxO信号通路在肝癌的发生和发展中发挥着重要的作用。一方面，FoxO信号通路可以通过抑制癌细胞增殖、减缓代谢速率和促进凋亡等多种方式，发挥抗肿瘤的作用，研究发现，FoxO1可以通过上调CDKN1A和下调CCND2的表达，抑制肝癌细胞周期的进程。同时，FoxO1还可以通过诱导BCL2L11的表达，激活线粒体介导的凋亡途径，促进肝癌细胞的死亡[26]。另一方面，FoxO信号通路也可以被肝癌细胞利用来逃避免疫监视和治疗药物的作用，例如，FoxO3可以通过下调BCL6的表达，抑制自然杀伤细胞对肝癌细胞的杀伤作用；FoxO4可以通过上调ATG12的表达，增强肝癌细胞的自噬能力，从而抵抗化疗药物诱导的氧化应激和DNA损伤[27]。HIF-1信号通路是一种重要的细胞应对缺氧的机制。HIF-1信号通路与肝癌的发生和发展密切相关。一方面，HIF-1信号通路可以促进肝癌细胞的增殖、侵袭、转移和血管生成等恶性表型。研究发现，HIF-1可以通过上调VEGF、PDGF-B、CXCR4等基因的表达，刺激肿瘤血管生成和远处转移。HIF - 1还可以通过上调GLUT1、LDHA、HK2等基因的表达，调节肝癌细胞的糖代谢和乳酸生成，增强肝癌细胞的生存能力。同时，HIF-1可以通过上调PD-L1、IDO、TGF-β等基因的表达，抑制T细胞和自然杀伤细胞对肝癌细胞的杀伤作用。此外，HIF - 1还可以通过上调MDR1、ABCG2、BCL2等基因的表达，增强肝癌细胞对化疗药物和放射治疗的耐受性[28]。
越来越多的证据表明，免疫机制参与了肝癌的发生及发展过程，本研究通过免疫浸润分析，发现Tregs、Macrophages M0、rDCs、Macrophages M2等免疫系统成分显著升高。Tregs是一种抑制免疫反应的T细胞亚群，在肝癌中可以帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。有研究报道，Tregs在肝癌患者的肿瘤组织中高度富集，并与预后不良相关[29]。M0型巨噬细胞是一种未经激活的巨噬细胞，在肝癌中主要分布在正常肝组织中，可以清除废物和毒素，保护肝脏功能，也可以参与炎症反应，而M2型巨噬细胞是一种经过激活的巨噬细胞，在肝癌中主要分布在肿瘤组织中，可以促进肿瘤生长和血管生成，抑制效应免疫细胞的功能[30]。RDCs是一种未成熟的树突状细胞，在肝癌中主要分布在肿瘤周围的正常肝组织中，可以捕获和呈递抗原，启动T细胞的免疫应答，与良好的预后相关[31]。此外，在进一步探讨关键基因与免疫细胞之间的关系中，发现VEGFA、CCNB1、MAPK3与免疫细胞高度相关，从TISIDB数据库中分析揭示了关键基因与免疫细胞浸润水平密切相关，并在免疫微环境中发挥重要作用，说明免疫细胞浸润作为一个重要因素参与了肝癌的疾病过程。因此，通过干预关键基因在免疫细胞或肿瘤细胞中的表达或活性，来观察它们对肿瘤生长和转移以及免疫反应的影响，可帮助选择合适的患者进行个体化和精准化的治疗。
细胞自噬是一种细胞内降解过程，可以清除受损的细胞器和异常的蛋白质，维持细胞稳态和代谢平衡。在肝癌中，自噬具有双重作用，既可以抑制肿瘤的发生和发展，也可以促进肿瘤的生长和转移[32]。本研究通过对GeneCards数据库自噬相关的疾病基因分析，在其中Relevance score前20个基因的表达水平，发现包括了已经报道的AMBRA1[33]、ATG10[34]、ATG12[35]、ATG13[36]等基因的表达在两组患者中都具有显著差异。这和本研究结果一致。根据富集分析提示，这些基因自噬可能通过调节细胞凋亡和p53 signaling pathway的活性，参与了肝癌的发生发展相关的信号通路。值得注意的是，本研究发现这3个关键基因中CCNB1和ATG4B显著正相关，MAPK3和ATG7显著正相关。CCNB1和ATG4B的表达水平显著正相关可能意味着自噬和细胞周期之间存在着协调的关系。一方面，自噬可以通过降解细胞周期蛋白来影响细胞周期的进程；另一方面，细胞周期也可以通过调节自噬相关基因的转录和翻译来影响自噬的水平。CCNB1和ATG4B可能是这种相互作用的重要节点[37]。MAPK3和ATG7的表达水平显著正相关可能表明MAPK信号通路在调控自噬中发挥了重要的作用。MAPK信号通路可以通过多种机制影响自噬的启动、执行和终止，包括磷酸化或去磷酸化自噬相关蛋白、调节转录因子的活性、诱导基因表达等。MAPK3和ATG7可能是这种信号传导的关键分子[38]。因此，丹参- 郁金药对活性成分通过干预关键基因调节自噬水平和类型可能是一种有效的治疗策略，既可以利用自噬来清除异常或恶性变化的细胞，又可以抑制自噬来增强抗癌药物或免疫疗法的效果。目前，已有一些针对自噬相关基因或通路的药物或化合物在肝癌治疗中显示出一定的效果或潜力，但由于自噬在不同阶段、不同类型、不同细胞中可能发挥不同甚至相反的作用，故需要更多的研究来明确自噬在肝癌治疗中的确切机制、最佳时机、最佳剂量和最佳靶点。
分别对3个关键基因的GSEA通路富集分析及GSVA基因集差异分析中发现，主要富集到的通路有Cell cycle、DNA replication、mRNA surveillance pathway、Gap junction、VEGF signaling pathway、Lysosome、Notch signaling pathway等通路。研究证明，细胞周期和p53 signaling pathway在肝癌的发育中起重要作用[39]。哺乳动物细胞周期由G1到S过渡的调节因子控制，例如p53、视网膜母细胞瘤和cyclin D1。许多报告表明，这些细胞周期相关基因的破坏导致肝癌19-21的进展[40]。DNA replication的准确性对于保持基因组完整性和避免遗传变异至关重要，在肝癌中，许多与DNA复制相关的酶或蛋白发生异常表达或功能改变，导致DNA复制错误或不稳定，从而引起基因突变或染色体畸变。目前，针对DNA复制相关蛋白的干预，已被多项研究证实可以改变肝癌细胞的生物学行为和预后。Gap junction是指相邻细胞之间的一种特殊的细胞连接，能够形成细胞间的直接通道，从而实现细胞间的物质和信息交换。肝癌中，许多与间隙连接相关的蛋白发生异常表达或功能改变，导致间隙连接的功能丧失，从而破坏细胞间的沟通和协调。例如，Cx32表达下调，导致间隙连接功能丧失，破坏细胞间的沟通和协调[41]。综上，这些研究与本研究差异分析结果相互佐证。值得注意的是，在研究中，GSVA结果显示，高表达CCNB1富集E2F靶标、mTORC1 signaling、p53 pathway等信号通路；高表达VEGFA富集p53 pathway、mTORC1 signaling、DNA repair等信号通路；高表达MAPK3富集IL2 STAT5 signaling、转化生长因子-β信号通路（TGF beta signaling）、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白信号通路（PI3K AKT mTOR signaling）等信号通路。
Chai等[42]指出，CCNB1在肝癌中高度表达，并且与肝癌患者的不良预后密切相关，与笔者的结果一致。Gu等[43]表明，CCNB1作为靶向肝癌的疗法被miR-144直接抑制。因此，CCNB1的表达通常用于估计抗癌药物治疗后的预后。基于这些研究，CCNB1、VEGFA和MAPK3可能在肝细胞癌的发生和发展中发挥重要作用，这些基因的高表达与肝癌患者的低生存率密切相关，表明它们的拮抗作用可能会改善肝癌的预后，与本研究差异分析结果相互佐证。
最后，为了实现肝癌的早期诊断与评估预后，本研究采用肝癌的不同临床指标的值和CCNB1、VEGFA、MAPK3表达分布，通过多因素Cox回归分析，构建了肝癌的风险评分系统，并通过ROC曲线和列线图预测模型证实了良好的诊断效能。同时以风险评分为基础，开发了肝癌的临床预测模型诺莫图，并对其进行评价，对1年、3年的生存预后具有较好的预测效能，可进行临床推广。
综上所述，在丹参-郁金药对干预肝癌临床获益的背景下，以网络药理学及生物信息学为手段，多数据库联合评估出丹参-郁金药对的药物靶点交集、富集分析、免疫浸润机制，基因集差异分析结果表明丹参-郁金药对干预肝癌自噬的分子靶点与肝癌发生发展的机制密切相关，具有高效对应药物与疾病，高效筛选靶点及通路的重要意义，为进一步的实验验证提供了理论依据。本研究也有一定局限性，丹参-郁金治疗肝癌的药理机制仅通过挖掘数据进行预测，忽略了各种化合物含量、化合物间相互作用和中药材体内代谢过程的影响，需要通过药理学和临床研究进一步研究和讨论。科研之路没有捷径，高效与全面的结合依然任重而道远。
| [1] |
FERLAY J, SOERJOMATARAM I, DIKSHIT R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. International Journal of Cancer, 2015, 136(5): E359-E386. |
| [2] |
LLOVET J M, ZUCMAN-ROSSI J, PIKARSKY E, et al. Hepatocellular carcinoma[J]. Nature Reviews Disease Primers, 2016, 2: 16018. DOI:10.1038/nrdp.2016.18 |
| [3] |
FORNER A, REIG M, BRUIX J. Hepatocellular carcinoma[J]. The Lancet, 2018, 391(10127): 1301-1314. DOI:10.1016/S0140-6736(18)30010-2 |
| [4] |
WANG X, LI XI, ZHAO Y. Progress in the prevention and treatment of liver cancer with traditional Chinese medicine[J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2019, 34(11): 4899-4903. |
| [5] |
YANG G Y, LI X, LI X L, et al. Traditional Chinese medicine in cancer care: A review of case series published in the Chinese literature[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012, 2012: 751046. |
| [6] |
XIANG Y N, GUO Z M, ZHU P F, et al. Traditional Chinese medicine as a cancer treatment: Modern perspectives of ancient but advanced science[J]. Cancer Medicine, 2019, 8(5): 1958-1975. DOI:10.1002/cam4.2108 |
| [7] |
MAO D, FENG L, HUANG S Q, et al. Meta-analysis of Xihuang pill efficacy when combined with chemotherapy for treatment of breast cancer[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2019, 2019: 3502460. |
| [8] |
WANG Q, JIAO L J, WANG S F, et al. Maintenance chemotherapy with Chinese herb medicine formulas vs. with placebo in patients with advanced non-small cell lung cancer after first-line chemotherapy: A multicenter, randomized, double-blind trial[J]. Frontiers in Pharmacology, 2018, 9: 1233. DOI:10.3389/fphar.2018.01233 |
| [9] |
TANG Y C, ZHANG Y, ZHOU J, et al. Ginsenoside Rg3 targets cancer stem cells and tumor angiogenesis to inhibit colorectal cancer progression in vivo[J]. International Journal of Oncology, 2018, 52(1): 127-138. |
| [10] |
ZHANG Q, CHEN X, LUO Y J, et al. Fuzi enhances anti-tumor efficacy of radiotherapy on lung cancer[J]. Journal of Cancer, 2017, 8(19): 3945-3951. DOI:10.7150/jca.22162 |
| [11] |
LIU X D, TIAN S, LIU M, et al. Wogonin inhibits the proliferation and invasion, and induces the apoptosis of HepG2 and Bel7402 HCC cells through NF -κB/Bcl-2, EGFR and EGFR downstream ERK/AKT signaling[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2016, 38(4): 1250-1256. DOI:10.3892/ijmm.2016.2700 |
| [12] |
SHAO L, ZHANG B. Traditional Chinese medicine network pharmacology: theory, methodology and application[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2013, 11(2): 110-120. DOI:10.1016/S1875-5364(13)60037-0 |
| [13] |
BRAY F, FERLAY J, SOERJOMATARAM I, et al. Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2018, 68(6): 394-424. DOI:10.3322/caac.21492 |
| [14] |
LIAO X, BU Y, JIA Q G. Traditional Chinese medicine as supportive care for the management of liver cancer: Past, present, and future[J]. Genes & Diseases, 2020, 7(3): 370-379. |
| [15] |
SUN J L, YANG X M, SUN H T, et al. Baicalin inhibits hepatocellular carcinoma cell growth and metastasis by suppressing ROCK1 signaling[J]. Phytotherapy Research, 2023, 37(9): 4117-4132. DOI:10.1002/ptr.7873 |
| [16] |
LEE Y J, KWON Y H. Regulation of apoptosis and autophagy by luteolin in human hepatocellular cancer Hep3B cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2019, 517(4): 617-622. DOI:10.1016/j.bbrc.2019.07.073 |
| [17] |
QIAN Z, FENG N N, GENG A K. Tanshinone I suppresses hepatocellular carcinoma cells growth through targeting DNA double-strand break repair[J]. Cancer Biology & Therapy, 2023, 24(1): 2229958. |
| [18] |
XU W J, SHI Z H, YU X M, et al. Salvianolic acid B exerts an antihepatocellular carcinoma effect by regulating the Hippo/YAP pathway and promoting pSmad3L to pSmad3C simultaneously[J]. European Journal of Pharmacology, 2023, 939: 175423. DOI:10.1016/j.ejphar.2022.175423 |
| [19] |
VO T K, TA Q T H, CHU Q T, et al. Anti-hepatocellular-cancer activity exerted by β-sitosterol and β-sitosterol-glucoside from Indigofera zollingeriana miq[J]. Molecules, 2020, 25(13): 3021. DOI:10.3390/molecules25133021 |
| [20] |
FRIEDMAN J, HASTIE T, TIBSHIRANI R. Regularization paths for generalized linear models via coordinate descent[J]. Journal of Statistical Software, 2010, 33(1): 1-22. |
| [21] |
ALLY A, BALASUNDARAM M, CARLSEN R, et al. Comprehensive and integrative genomic characterization of hepatocellular carcinoma[J]. Cell, 2017, 169(7): 1327-1341. DOI:10.1016/j.cell.2017.05.046 |
| [22] |
ZHUANG L P, YANG Z G, MENG Z Q. Upregulation of BUB1B, CCNB1, CDC7, CDC20, and MCM3 in tumor tissues predicted worse overall survival and disease-free survival in hepatocellular carcinoma patients[J]. BioMed Research International, 2018, 2018(1): 7897346. |
| [23] |
RONG M H, LI J D, ZHONG L Y, et al. CCNB1 promotes the development of hepatocellular carcinoma by mediating DNA replication in the cell cycle[J]. Experimental Biology and Medicine, 2022, 247(5): 395-408. DOI:10.1177/15353702211049149 |
| [24] |
LU N, MALEMUD C J. Extracellular signal-regulated kinase: A regulator of cell growth, inflammation, chondrocyte and bone cell receptor-mediated gene expression[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(15): 3792. DOI:10.3390/ijms20153792 |
| [25] |
MO J G, TONG Y P, MA J X, et al. The mechanism of flavonoids from Cyclocarya paliurus on inhibiting liver cancer based on in vitro experiments and network pharmacology[J]. Frontiers in Pharmacology, 2023, 14: 1049953. DOI:10.3389/fphar.2023.1049953 |
| [26] |
JIRAMONGKOL Y, LAM E W. FOXO transcription factor family in cancer and metastasis[J]. Cancer Metastasis Reviews, 2020, 39(3): 681-709. DOI:10.1007/s10555-020-09883-w |
| [27] |
FARHAN M, WANG H T, GAUR U, et al. FOXO signaling pathways as therapeutic targets in cancer[J]. International Journal of Biological Sciences, 2017, 13(7): 815-827. DOI:10.7150/ijbs.20052 |
| [28] |
FRAU M, FEO F, PASCALE R M. Pleiotropic effects of methionine adenosyltransferases deregulation as determinants of liver cancer progression and prognosis[J]. Journal of Hhepatology, 2013, 59(4): 830-841. DOI:10.1016/j.jhep.2013.04.031 |
| [29] |
ZHANG Y, ZOU J, CHEN R. An M0 macrophage-related prognostic model for hepatocellular carcinoma[J]. BMC Cancer, 2022, 22(1): 791. DOI:10.1186/s12885-022-09872-y |
| [30] |
XIE Z Y, LI X, HE Y Z, et al. Immune cell confrontation in the papillary thyroid carcinoma microenvironment[J]. Frontiers in Endocrinology, 2020, 11: 570604. DOI:10.3389/fendo.2020.570604 |
| [31] |
LEE M G, DU H X, WINER D A, et al. Mechanosensing in macrophages and dendritic cells in steady-state and disease[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2022, 10: 1044729. DOI:10.3389/fcell.2022.1044729 |
| [32] |
YAZDANI H O, HUANG H, TSUNG A. Autophagy: Dual response in the development of hepatocellular carcinoma[J]. Cells, 2019, 8(2): 91. DOI:10.3390/cells8020091 |
| [33] |
KOWALIK M A, PERRA A, LEDDA-COLUMBANO G M, et al. Induction of autophagy promotes the growth of early preneoplastic rat liver nodules[J]. Oncotarget, 2016, 7(5): 5788-5799. DOI:10.18632/oncotarget.6810 |
| [34] |
LI F, LI K, LI D, et al. ATG10 overexpression is related to the dismal prognosis and promotes the growth and migration of hepatocellular carcinoma cells via cyclin B1/CDK1 and CDK2[J]. American Journal of Cancer Research, 2023, 13(4): 1188-1208. |
| [35] |
WEI H M, HU J, PU J, et al. Long noncoding RNA HAGLROS promotes cell proliferation, inhibits apoptosis and enhances autophagy via regulating miR-5095/ATG12 axis in hepatocellular carcinoma cells[J]. International Immunopharmacology, 2019, 73: 72-80. DOI:10.1016/j.intimp.2019.04.049 |
| [36] |
NIU Q, ZHAO W, WANG J, et al. LicA induces autophagy through ULK1/Atg13 and ROS pathway in human hepatocellular carcinoma cells[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2018, 41(5): 2601-2608. |
| [37] |
YIN S S, YANG S S, LUO Y M, et al. Cyclin-dependent kinase 1 as a potential target for lycorine against hepatocellular carcinoma[J]. Biochemical Pharmacology, 2021, 193: 114806. DOI:10.1016/j.bcp.2021.114806 |
| [38] |
SHEN S W, WANG R, QIU H, et al. Development of an autophagybased and stemness-correlated prognostic model for hepatocellular carcinoma using bulk and single-cell RNA-sequencing[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2021, 9: 743910. DOI:10.3389/fcell.2021.743910 |
| [39] |
BARTON M C, LOZANO G. p53 activation paradoxically causes liver cancer[J]. Cancer Research, 2022, 82(16): 2824-2825. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-22-2065 |
| [40] |
NG R, SONG G S, ROLL G R, et al. A microRNA-21 surge facilitates rapid cyclin D1 translation and cell cycle progression in mouse liver regeneration[J]. Journal of Clinical Investigation, 2012, 122(3): 1097-1108. DOI:10.1172/JCI46039 |
| [41] |
HERNáNDEZ-GUERRA M, HADJIHAMBI A, JALAN R. Gap junctions in liver disease: Implications for pathogenesis and therapy[J]. Journal of Hepatology, 2019, 70(4): 759-772. DOI:10.1016/j.jhep.2018.12.023 |
| [42] |
CHAI N, XIE H H, YIN J P, et al. FOXM1 promotes proliferation in human hepatocellular carcinoma cells by transcriptional activation of CCNB1[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018, 500(4): 924-929. DOI:10.1016/j.bbrc.2018.04.201 |
| [43] |
GU J S, LIU X R, LI J, et al. microRNA-144 inhibits cell proliferation, migration and invasion in human hepatocellular carcinoma by targeting CCNB1[J]. Cancer Cell International, 2019, 19: 15. DOI:10.1186/s12935-019-0729-x |
2. The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530023, China;
3. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of China Medicine, Nanning 530011, China;
4. Guangxi University Engineering Research Center for Innovative Product Development of Regional Major Diseases, Nanning 530011, China