糖尿病的患病率随年龄增大而增高^[1]。2019年的国际糖尿病联盟数据显示，中国≥65岁的老年糖尿病患者数量约为3 550万，占全球老年糖尿病患者的1/4，居世界之首，且呈上升趋势^[2]。2020年发表的1项大型横断面研究显示，中国大陆人群中，60~69岁年龄段糖尿病的患病率为28.8%，≥70岁年龄段糖尿病患病率为31.8%；与其他年龄段相比，60岁以上人群的糖尿病患病率最高^[3]。肌少症是一种增龄性疾病，中国老年糖尿病患者肌少症患病率为14.8%^[4]。2型糖尿病（T2DM）与肌肉力量和质量的下降有关，加剧与年龄相关的肌少症^[5]。由于骨骼肌是重要的糖代谢器官，合并肌少症的糖尿病患者糖代谢异常更加严重、营养状态更差，也更容易合并骨质疏松和跌倒^[6]，血糖更难控制的同时，日常生活活动能力下降，病死率增加^[7]。综上，老年糖尿病合并肌少症的共病应当重视^[8]。

糖脂代谢异常是衰老糖尿病状态下不可忽视的骨骼肌损伤。高血糖加速了由于葡萄糖毒性、胰岛素抵抗等因素导致的肌肉损失；过度脂肪的积累导致与肌少症相关的肌肉卫星细胞功能障碍、自噬丧失、线粒体功能障碍和炎症^[9-10]，并导致步态受损^[11]。所以，改善糖脂代谢异常是一条可行的衰老糖尿病肌少症的治疗路径。

脂联素是血浆中含量最丰富的脂肪因子之一，其相关通路具有胰岛素增敏、脂肪燃烧和抗炎特性，并对氧化应激有调节作用，通过血糖控制和脂肪酸氧化来帮助调节代谢^[12-13]。骨骼肌既表达脂联素，又对脂联素敏感^[14-15]。除了代谢反应，骨骼肌功能、钙处理、生长和维持、再生能力以及对慢性炎症的易感性，都受到脂联素刺激的强烈影响^[16]。可知骨骼肌脂联素信号通路，调控糖脂代谢的同时，也参与骨骼肌正常形态功能的维持，是潜在的治疗靶点。

参芪复方是谢春光教授多年来的经验方，被应用于糖尿病及其并发症的辅助治疗，疗效显著。既往研究表明参芪复方可维持腓肠肌湿质量^[17]，改善糖尿病大鼠的骨骼肌细胞炎性浸润、萎缩、水肿情况^[17-18]，改善衰老糖尿病大鼠胰岛素抵抗、氧化应激指标、维持腓肠肌横截面积、抑制肌间纤维沉积^[19]，调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路网络促进骨骼肌蛋白质合成代谢^[20]等。但其效用机制尚不明确。本研究着眼于脂联素信号通路，进一步探讨芪复方改善衰老糖尿病大鼠糖脂代谢异常，减缓衰老糖尿病状态下骨骼肌相关病理进程的可能分子机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

4月龄雄性Wistar大鼠10只，体质量400~500 g，17月龄老年雄性Wistar大鼠40只，体质量600~900 g。由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2024-0001。屏障系统内饲养，温度20~26 ℃，相对湿度40%~70%，12 h/12 h昼夜明暗交替。动物实验通过成都医学院伦理审批（伦理编号：2024C010）。

1.2 主要试剂与仪器

参芪复方组成：人参、黄芪、山药、生地黄、山萸肉、天花粉、丹参、制大黄，成人1 d剂量：人参、黄芪均15 g，大黄6 g，其余皆为10 g。制备参芪复方冻干粉，每克冻干粉约含有4.5 g生药。磷酸西格列汀片（捷诺维）：100 mg/片，默沙东公司。链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司。上海酶联生物科技有限公司：大鼠胰岛素（INS）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒，货号：ml302840，规格：96 T；大鼠脂联素（APN）ELISA试剂盒，货号：ml002882，规格：96T。南京建成生物工程研究所：三酰甘油（TG）测定试剂盒，货号：A110-1-1，规格：96 T；总胆固醇（T-CHO）测定试剂盒，货号：A111-1-1，规格：96 T；游离脂肪酸（NEFA）测定试剂盒，货号：A042-2-1，规格：96 T。生工生物工程（上海）股份有限公司：大鼠PGB340Mi01肌动蛋白β（ACTB）、脂联素受体1（AdipoR1）、脂联素受体2（AdipoR2）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、AMP激活蛋白激酶α2（Prkaα2）PCR引物。BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型），货号：P0010，规格：500T，上海碧云天生物技术有限公司。英国abcam公司：β微管蛋白（β - tubulin）抗体[Anti-beta Tubulin antibody（HRP）]，货号：ab21058，规格：100 μL；PPARα抗体，货号：ab227074，规格：100 μL；AdipoR1抗体，货号：ab70362，规格：100 μL。美国Thermo invitrogen公司：AdipoR2抗体，货号：PA5-100376，规格：100 μL；磷酸化腺苷单磷酸活化蛋白激酶（pAMPK）苏氨酸172（Thr 172）多克隆抗体，货号：PA5-37821，规格：100 μL；腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1（AMPKα1），2多克隆抗体，货号：PA5-36045，规格：100 μL。苏木素染液，货号H9627，美国Sigma Aldrich公司。伊红染液，货号YE2080，合肥博美生物科技有限责任公司。

冷冻离心机，型号：H1850R，湘仪离心机仪器有限公司。全波长酶标仪，型号：MULTISKAN GO，美国Thermo Scientific。美国BIO-RAD：Real-Time荧光定量PCR仪，型号：CFX Connect；PCR分析软件，CFX Manager^TM Software3.1；垂直电泳转印系统，型号：MINI-P4/MT-BLOT MOD/PP BAS。组织包埋机，型号：BMJ-A，常州郊区中威电子仪器厂。玻片扫描影像系统，型号SQS-600P，深圳市生强科技有限公司。生物显微镜，型号BA210Digital，麦克奥迪实业集团有限公司。透射电子显微镜，型号：JEM-1400FLASH，日本电子（JEOL）。

1.3 造模分组及给药

4月龄Wistar雄性大鼠10只为空白对照（C）组，17月龄Wistar雄性大鼠10只为衰老模型（SMo）组，另17月龄雄性Wistar大鼠30只待造模，均为SPF级。大鼠适应性喂养1周后，C组及SMo组大鼠仍予普通饲料喂养，另30只待造模大鼠予高脂高糖饲料（含糖23.5%，蛋白质13.4%，脂肪14.3%）喂养，大鼠饮水自由。30 d后30只待造模大鼠一次性腹腔注柠檬酸-柠檬酸钠溶液溶解稀释的STZ 10 mg/kg，C组及SMo组注射等量生理盐水为对照。继续喂养1周后测待造模大鼠鼠尾随机血糖≥ 16.7 mmol/L为衰老糖尿病模型（STMo）大鼠（模型不达标者稳定后再次注射STZ 10 mg/kg）。STMo大鼠随机分为STMo组、中药（SQFF）组和西药（X）组，与前面的C组、SMo组合为5组大鼠。STMo组、SQFF组、X组，予以高脂饲料喂养；C组及SMo组大鼠，予以普通饲料喂养。

给药方法：大鼠的日服剂量按成人（60 kg体质量）药物剂量的6.3倍计算，其中C组、SMo组及STMo组予0.9% 氯化钠溶液5 mL/（kg · d）灌胃，SQFF组予以参芪复方冻干粉2 g/（kg·d）灌胃，X组予以西格列汀混悬液10 mg/（kg·d）灌胃，实验期间无菌操作。大鼠食、饮自由，垫料干燥，昼夜交替照明。每周测大鼠体质量并及时调整灌胃药物剂量，连续干预8周。

1.4 标本采集

大鼠处死前12 h禁食不禁水，测鼠尾空腹血糖后腹腔注射2%戊巴比妥麻醉，置于冰盘四肢固定。腹主动脉采血，3 000 r/min（离心半径8.55 cm）离心10 min，取上清液，-20 ℃保存，备用。腓肠肌自起点（股骨内、外侧髁）至止点（跟骨结节处）完整取下。腓肠肌切成1 cm×1 cm×0.5 cm的小块以10% 的多聚甲醛固定，以备普通光学显微镜检查；切成1 mm³的小块以2.5% 的戊二醛固定，以备电镜检查。余腓肠肌组织分装至微型离心管并标记后投入液氮中，后于-80 ℃低温保存待测。

1.5 检测指标 1.5.1 血液相关指标检测

试纸法测定空腹血糖（FBG），ELISA法测定大鼠INS、APN，微板法测定大鼠TG、T-CHO、NEFA，并计算大鼠胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。

1.5.2 腓肠肌组织病理形态学观察

使用磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和甲醛（AR级）配制的固定液固定，后经脱水、切片，苏木精-伊红（HE）染色光镜下观察腓肠肌组织病理学形态。2.5% 戊二醛预固定，1% 四氧化锇再固定，经脱水、渗透、包埋、超薄切片、染色后，透射电镜下观察腓肠肌细胞器形态学变化。

1.5.3 腓肠肌组织APN通路相关mRNA检测

取腓肠肌组织总RNA，后将RNA逆转录为模板cDNA，用试剂盒进行实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）反应，指标内参基因为ACTB，2^-ΔΔCq法计算相对表达。

1.5.4 腓肠肌组织APN通路相关蛋白测定

蛋白免疫印迹（Western blot）法检测大鼠腓肠肌组织中AdipoR1、AdipoR2、AMPKα、pAMPKα（Thr172）、PPARα的相对表达量。剪取适量-80 ℃冻存组织样本离心取上清提取总蛋白冰浴保存，采用BCA法测定裂解上清液中总蛋白浓度，制备电泳样品及凝胶后电泳转膜，先后加入一抗、二抗孵育清洗，自动化学发光凝胶成像系统采集图片。以β-tubulin为内参计算表达量。

1.6 统计学分析

使用Graphpad prism8软件进行统计学分析。符合正态分布且方差齐，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行数据统计，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用LSD法。不符合方差齐性要求则进行秩和检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果与分析 2.1 参芪复方对衰老糖尿病大鼠糖脂代谢相关指标的影响

如图 1所示，与C组和SMo组相比，STMo组FBG、HOMA - IR、TG、T - CHO、NEFA均增加，仅T-CHO在SMo组与STMo组的组间比较差异无统计学意义。与STMo组比较，SQFF组和X组干预后FBG、HOMA-IR、TG、T-CHO、NEFA均下降，SQFF组HOMA-IR较STMo组比较差异无统计学意义。提示参芪复方和西格列汀均能改善衰老糖尿病状态下的大鼠糖脂代谢异常，而西格列汀对衰老糖尿病大鼠HOMA-IR的改善更优。

2.2 参芪复方对衰老糖尿病大鼠血浆脂联素水平的影响

如图 2所示，SMo组和STMo组血浆APN水平较C组显著下降（P < 0.05），与STMo组相比，SQFF组和X组血浆APN水平显著升高（P < 0.05）。提示参芪复方和西格列汀均能有效改善衰老糖尿病大鼠血浆脂联素水平。

2.3 光镜下参芪复方对衰老糖尿病大鼠腓肠肌病理形态学的影响

光镜下HE染色见C组、SQFF组大鼠腓肠肌组织内肌纤维排列整齐，肌束结构清晰，边界分明，肌纤维形态正常。部分SMo组可见炎性细胞浸润，杆状的中性粒细胞和圆形深染的淋巴细胞。STMo组和部分X组除上述改变外，还见肌纤维不同程度变性坏死，坏死纤维断裂、溶解，胞核固缩碎裂，坏死区域伴有纤维组织增生，以核呈长椭圆的成纤维细胞为主。

综上，腓肠肌损伤程度：STMo组 > X组 > SMo型组 > SQFF组及C组。说明参芪复方和西药对于衰老糖尿病所导致的骨骼肌炎症损伤、肌纤维变性、坏死、断裂、溶解，以及纤维组织的增生都有缓解作用，但中药参芪复方的作用明显优于西药，见图 3。

2.4 电镜下参芪复方对衰老糖尿病大鼠腓肠肌病理形态学的影响

透射电镜观察衰老糖尿病大鼠腓肠肌组织，在微观层面出现了肌纤维结构破坏；线粒体肿胀，嵴大量断裂、溶解，甚至消失，基质丢失，空泡化；线粒体外膜破裂；脂滴及自噬小体等。而用中药和西药干预后各病理表现有所改善。腓肠肌细胞损伤程度：STMo组 > X组 > SQFF组，提示中药对于保护衰老及糖尿病所致的骨骼肌损害有潜在作用，且优于西药，见图 4。

2.5 参芪复方对衰老糖尿病大鼠腓肠肌组织脂联素信号通路相关mRNA及蛋白表达的影响

与C组相比，STMo组的AdipoR1、AdipoR2、AMPK（测定Prkaα2定量）PPARα的mRNA表达均有显著下降（P < 0.05）；在中西药治疗后PPARα、AMPK均明显升高（P < 0.05），AdipoR2仅在SQFF组显著升高降（P < 0.05），见图 5。可见参芪复方可显著增加衰老糖尿病大鼠腓肠肌AdipoR2、AMPK、PPARα的mRNA表达。Western blot检测骨骼肌AdipoR1、AdipoR2、AMPKα、pAMPKα、PPARα蛋白表达显示，与C组相比，STMo组AdipoR1、AdipoR2、AMPKα、pAMPKα、PPARα蛋白表达均显著下降（P < 0.05），经中药及西药干预后，均显著升高（P < 0.05），见图 6，提示参芪复方和西格列汀均能显著增加衰老糖尿病大鼠腓肠肌AdipoR1、AdipoR2、AMPKα、pAMPKα、PPARα的蛋白表达，与qPCR检测结果基本一致。

3 讨论 3.1 参芪复方改善衰老糖尿病大鼠糖脂代谢及骨骼肌损伤的机制

糖尿病属于中医消渴的范畴，而脾虚为消渴病机之本。脾主运化，强调脾输散精微，运化水液的作用。施今墨先生有言：“血糖者，饮食所化之精微也。”葡萄糖作为水谷精微之一，也由脾散精至身体各处器官得以利用。脾虚“脾不散精”或“散精不利”，葡萄糖不能被运化和利用，在血液中的积累，而成糖尿病之高血糖。脾运失常还导致水液停聚而成痰湿积于肌肉筋骨。中医理论认为脾虚生痰与痰湿困脾互为因果，为导致肥胖的关键病因病机^[21]。2022年发布的《肥胖症中医诊疗方案专家共识》^[22]也明确将脾虚湿阻证列为肥胖症的中医辨证之首。脂肪组织即是中医痰饮实邪的一种表现形式。有研究表明运脾和络方可改善T2D骨骼肌的脂肪异位沉积^[23-24]。综上，脾气健运是糖脂正常代谢的根本。

参芪复方以人参和黄芪共为君药，共凑益气健脾之功，复脾运化精微的能力，治疗消渴的同时使肌肉得以荣养而丰满有力。另有山药健脾补虚，安奠中焦，气津同调，且黄芪配山药是施金墨先生所推崇的治疗消渴的黄金药对。全方主以健脾益气，治疗脾虚失运之根本，又兼熟地黄、山茱萸益肾以滋先天，尤适于衰老状态；牡丹皮、大黄排除淤血，清利湿热，与全方补益之力动静结合，补而不滞。参芪复方以健脾益气扶正为主，复中焦运化之职，兼能去除病理产物。脾气健运，散精有常，痰湿得化，则血糖血脂得降，肌肉得养。体现治病必求其本，同时扶正祛邪，标本兼顾，正合治疗消渴合并衰老病理状态下肌肉损伤治疗之正法。

3.2 骨骼肌脂联素信号通路参与糖脂代谢的相关路径

如上文所述，骨骼肌既表达APN，又对APN敏感，而APN参与调节糖脂代谢并能刺激骨骼肌的各项生理功能。APN及其受体AdipoR1和AdipoR2都在骨骼肌表达^[25]。APN与AdipoR1的结合刺激AMPK的磷酸化。骨骼肌AMPK磷酸化和激活素刺激葡萄糖利用和脂肪酸燃烧^[26]。完整的AMPK激活通过其与肝激酶B1（LKB1）和单磷酸腺苷（AMP）结合并发生磷酸化^[27]。在骨骼肌中，AMPK诱导乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的抑制性磷酸化，导致丙二酰辅酶A形成减少、氧化激活、脂肪酸合成抑制^[26]。APN通过与AdipoR1结合导致过氧化物酶体增殖物激活受体γ-辅激活因子1-α（PGC-1α）的激活和表达增加，促进线粒体生物发生、氧化代谢增加和Ⅰ型肌纤维的形成^[28]。脂联素- AdipoR2轴激活PPARα信号通路，该通路调节脂肪酸β-氧化^[23]。APN增加PPARα配体的活性以及PPARα本身的表达，增加脂肪酸燃烧和能量消耗。总而言之，AdipoR1和AdipoR2作为球状和全长APN的受体并介导增加的AMPK、PPARα配体活性、脂肪酸氧化和葡萄糖的吸收。除了代谢和INS增敏作用外，APN还通过参与肌肉分化和组织再生影响肌肉细胞的行为，发挥成肌因子的作用。APN作用于卫星细胞，通过激活丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）信号级联促进卫星细胞活化^[29]。

与肥胖相关的代谢紊乱，如胰岛素抵抗和T2D与APN水平呈负相关^[14-15]。低APN水平还增加糖尿病并发症的进展率^[30]，影响骨骼肌的糖和脂代谢功能及肌肉再生^[31-32]。APN已成为治疗T2D的潜在药物，两周的球状脂联素（gAcrp30）治疗可降低FBG、TG和INS浓度，并逆转全身胰岛素抵抗，其原理可能是改善了INS介导的内源性葡萄糖生成抑制，以及增加了肌肉和脂肪组织中INS刺激的葡萄糖摄取^[33]。

3.3 结果分析

本研究结果示，参芪复方可有效降低衰老糖尿病大鼠的FBG和血脂水平；改善其胰岛素抵抗状态；降低骨骼肌损伤程度，包括肌炎症损伤、肌纤维变性、坏死、断裂、溶解，以及纤维组织的增生；缓解腓肠肌细胞的损伤程度，主要包括肌纤维结构破坏、线粒体肿胀、线粒体嵴及基质异常、线粒体外膜破裂、脂滴及自噬小体等。同时参芪复方增加了血浆APN浓度，并上调衰老糖尿病大鼠腓肠肌AdipoR1、AMPK和PPARα的mRNA水平，及AdipoR1、AdipoR2、AMPK、pAMPK和PPARα的蛋白表达。上述结果表明，参芪复方可以调控衰老糖尿病大鼠的糖脂代谢紊乱，改善衰老糖尿病状态下腓肠肌损伤。其可能是通过增加循环APN水平，增强骨骼肌AdipoR1/AMPK及AdipoR2/PPARα信号通路的表达而实现的。

综合分析参芪复方调控APN信号通路干预糖脂代谢改善骨骼肌损伤的原理可能是：脾主运化，主散精，主肌肉，将饮食物转化为水谷精微的能量物质，布散于四肢以充养肌肉，同时运化痰湿水饮排出体外，使四肢经脉通畅，肌肉不受其壅滞，这与APN信号通路的作用具有一定的相似性。脂联素信号通路在骨骼肌表达，调控包括葡萄糖和脂质的营养代谢，刺激葡萄糖利用和脂肪燃烧转化为能量，防止其过度积累对骨骼肌造成损伤。两者都参与能量的代谢利用，并作用于骨骼肌。可以合理假设，中医学脾的功能与APN信号通路的作用重合，所以参芪复方可以通过健脾益气的方法，调控APN信号通路，改善糖脂代谢的同时，延缓骨骼肌损伤。

3.4 局限性

本研究以自然衰老的大鼠经过高脂高糖喂养结合STZ注射进行衰老糖尿病大鼠的造模。预实验参考相关文献^[34-36]采用30 mg/kg STZ注射，均能达到成模标准，但是存在死亡率高的问题，大鼠在成模后3周陆续死亡。有文献研究显示^[37-38]，高脂高糖喂养结合STZ注射制造2型糖尿病模型，非老年大鼠的最佳剂量为30 mg/kg，考虑到老年大鼠在药物吸收、代谢、分布上的变异性^[39]，以及其衰老状态及虚弱性，正式实验采取10 mg/kg STZ注射，并于模型不达标者稳定后再次注射的方法进行造模，如此虽然兼顾成模率与死亡率，但也可能存在模型稳定性不佳及因注射次数不同的个体差异性问题。衰老糖尿病模型这类特殊的共病动物模型更加合理的造模方式仍需探索。本研究中药参芪复方组选择了针对糖尿病模型大鼠疗效最佳的参芪复方中剂量^{[17-18, 40]}，也由于参芪复方中剂量的年龄广泛适用性，并未对其针对衰老糖尿病模型进行药物剂量调整。在参考了既往研究的基础上^[17-18]，本研究样本量为每组10只大鼠，可能影响统计效力，在未来的研究中可加大样本量，使研究结果更有科学性和说服力。