2026, Vol. 43文章信息
- 张可欣, 何沛玥, 唐静怡, 等.
- ZHANG Kexin, HE Peiyue, TANG Jingyi, et al.
- 基于KLF4/SMAD通路研究金蝉益肾通络方抑制糖尿病肾病小鼠上皮细胞间质化的机制
- Mechanism of action of Jinchan Yishen Tongluo Formula in inhibiting epithelial mesenchymal transition of epithelial cells in mice with diabetic kidney disease through KLF4/SMAD pathway
- 天津中医药, 2026, 43(1): 104-110
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2026, 43(1): 104-110
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2026.01.16
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文章历史
- 收稿日期: 2025-08-13
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2. 北京中医药大学东直门医院重点实验室, 北京 100007
糖尿病肾病（DKD）是糖尿病的主要微血管并发症之一[1]。大约30% 糖尿病患者的终末肾病是由于DKD所致[2]。DKD不仅严重影响患者的生活质量，也给公共医疗卫生成本造成极大的负担。目前糖尿病肾病的一线治疗主要是通过控制血糖、血压以及使用肾素血管紧张素系统阻断剂延缓肾功能衰竭[3]。然而，即使严格控制血糖和血压，仍有部分患者会进展至终末期肾病[4]。因此，开发新型治疗药物以更有效地延缓糖尿病肾病的进展、改善患者预后显得尤为迫切。
上皮细胞间质化（EMT）是糖尿病肾病疾病进展的重要病理学机制[5]。研究发现，在DKD患者的肾脏组织中肌成纤维细胞分化的标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性表达显著升高[6]。在持续暴露于高葡萄糖（HG）环境，上皮细胞逐渐失去其原有的功能和形态特征，转化为具有间充质表型的细胞，细胞极性丧失、细胞间连接松散、细胞外基质成分过度分泌[7]。上皮细胞间质化破坏肾小球和肾小管的正常结构，导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终引发糖尿病肾病的病理改变，加速肾功能的恶化[8]。
自古以来，中医药在糖尿病并发症的治疗上便展现出明确的疗效[5]。金蝉益肾通络方（JCYSTL）由东直门医院刘玉宁教授十余年临床探索实践，创立益肾通络法并优化出临床用于防治DKD的JCYSTL。方中黄芪、蝉花相伍，益肾气、滋肾阴、荣肾络合而成君药，加玄参滋阴养络清燥热为臣；再佐水蛭通络逐瘀和僵蚕通络化痰，两者均是虫类药，既能攻剔肾络痼结之痰瘀深入隧络，直达病所，又可斡旋肾络阳动之气，莪术和鬼箭羽寒温并用使伏邪易除，络痹易开；最后以川牛膝通络祛瘀，并引诸药归于肾经为使药。全方借蝉花、黄芪和玄参益气养阴荣肾络，以水蛭、僵蚕和牛膝化痰逐瘀通肾络，莪术、鬼箭羽活血行肾络，虚实并治，标本兼顾。在治疗糖尿病并发症过程中，疗效显著[9]。临床研究表明，JCYSTL在治疗DKD时能够显著改善患者的蛋白尿、肾功能等指标，显示出一定的疗效[10]。实验研究表明，JCYSTL可以改善DKD动物模型的肾功能，改善肾组织病理学变化[11]。然而，其对DKD的具体作用机制尚未完全明确。因此，进一步深入探讨其作用机制，以更好地发挥中药在DKD治疗中的优势。
1 材料 1.1 实验试剂厄贝沙坦（B34627）购自上海源叶生物科技有限公司。链脲佐菌素（STZ，S8050）购自索莱宝。血肌酐（Scr，C011-2-1）、血尿素氮（BUN，C013-2-1）、尿蛋白（UPQ，C035-2-1）和BCA试剂盒（A045-4）购自南京建成生物工程研究所。闭锁小带蛋白1（ZO-1，21773-1-AP）、上皮性钙黏附蛋白（E-cad，20874-1-AP）、波形蛋白（VIM，10366-1-AP）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，14395-1-AP）、Kruppel样因子4（KLF4，11880-1-AP）、Sma和Mad相关蛋白7（SMAD7，25840-1-AP）、Sma和Mad相关蛋白3（SMAD3，66516-1-Ig）的一抗采购自武汉三鹰科技有限公司。
1.2 实验药物金蝉益肾通络方由蝉花15 g，生黄芪30 g，玄参15 g，莪术12 g，僵蚕12 g，水蛭5 g，鬼箭羽25 g，川牛膝15 g等组成。以上药品购自北京中医药大学东直门医院国际部，由刘玉宁教授鉴定药材均为正品。实验时，使用纯净水煎煮，-40 ℃保存于东直门医院重点实验室，仅限两周内使用。
1.3 实验动物本研究选用60只SPF级C57BL6J小鼠（20±2）g，每笼5只。在环境温度为（22±2）℃，环境湿度为55%±5% 的清洁级屏障环境中适应性饲养1周后进行实验。实验方案经东直门医院动物伦理委员会批准（No. DZMYY-24-07）。
2 方法 2.1 模型建立1周后，笔者采用此前研究的造模方法[12]，将60只小鼠随机分出10只为空白组（Control），给予普通饲料喂养。其余50只复制DKD模型，给予高脂饲料喂养，持续8周。8周后禁食12 h，喂食高脂饲料的小鼠腹腔注射30 mg/kg的STZ造模，喂食普通饲料的小鼠腹腔注射等量的生理盐水。72 h后尾静脉取血测量小鼠随机血糖，随机血糖大于16.7 mmol/L时，视为2型糖尿病小鼠模型造模成功。在此基础上，继续进行高脂饲料喂养，直至小鼠24 h-尿蛋白（24 h-UPQ）≥20 mg，视为DKD模型造模成功。
将造模成功的DKD模型随机分为5组，每组10只。分别为：模型组（Model）、阳性药厄贝沙坦组（PC）、金蝉益肾通络方低剂量组（JCYSTL-L）、金蝉益肾通络方中剂量组（JCYSTL-M）和金蝉益肾通络方高剂量组（JCYSTL-H）。PC每天灌胃40 mg/kg的厄贝沙坦生理盐水溶液；JCYSTL-L、JCYSTL-M和JCYSTL-H每天分别灌胃8.4 g / kg、16.8 g / kg和33.6 g/kg金蝉益肾通络方水煎液；空白组和模型组每天灌胃与给药等量的生理盐水。连续给药8周。给药期间检测各组小鼠的随机血糖。
2.2 生化指标检测24 h-UPQ、Scr、BUN取材前24h收集小鼠尿液进行离心（3500 rpm，15 min，离心半径：8.6 cm），收集上清液，使用尿蛋白检测试剂盒检测小鼠的24 h-UPQ。麻醉小鼠，眼球取血，4 ℃离心（3 500 rpm，15 min，离心半径：8.6 cm），收集血清，按照各试剂盒说明书进行检测。
2.3 病理学染色将肾组织使用4% 多聚甲醛固定，随后包埋。将包埋好的石蜡组织切4 μm厚的切片。随后进行脱蜡和水化。使用苏木精-伊红染色（HE）和Masson试剂盒染色，并在光学显微镜下选择合适的倍数拍照。
2.4 RT-qPCR检测相关基因水平取等量的肾组织，加入Trizol裂解，并使用RNA提取试剂盒提取总RNA。使用紫外分光光度计检测RNA浓度。使用逆转录试剂盒将提取的RNA进行逆转录合成cDNA。然后使用扩增试剂盒进行实时荧光定量PCR实验，引物序列如表 1所示。通过比较目标基因与内参基因（β-actin）的Ct值，使用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。
| 基因名称 | 引物序列（5 ’→3 ’） |
| Klf4 | 上游：GTGCCCCGACTAACCGTTG |
| 下游：GAGAGGGGACTTGTGACTGC | |
| Smad7 | 上游：GGAACGCAGGAGGAAAGACC |
| 下游：AGACTTCACCCCTCGTGAGA | |
| Smad3 | 上游：CTACTGCCACTTGGAGTCTCG |
| 下游：AACTGCCCCGTCTTCTTGAG | |
| Actb | 上游：CCCCTGAACCCTAAGGCCA |
| 下游：ATGGCTACGTACATGGCTGG |
取等量的肾组织，加入RIPA裂解液和钢珠放入匀浆仪（4 ℃，30 s，5循环）匀浆裂解，释放蛋白。随后，4 ℃，12 000 rpm，离心20 min（离心半径：8.6 cm），收集上清液。BCA法检测蛋白浓度，计算蛋白上样量。随后蛋白样品加入含有SDS的凝胶中进行电泳分离。使用湿转仪将分离的蛋白转到PVDF膜上，使用5% 脱脂奶粉配制成的封闭液封闭2 h。随后用对应的一抗在4 ℃下孵育过夜。用TBST清洗3次，然后用HRP标记的二抗室温孵育2 h，再次洗膜后经ECL化学发光显影，最后使用Image J软件对条带进行量化分析。
2.6 统计学分析实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，使用GraphPad Prism 8软件分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。
3 结果 3.1 金蝉益肾通络方对糖尿病肾病小鼠血糖和肾功能的影响给药期间监测各组小鼠随机血糖变化，结果显示（图 1A），与Control相比，Model小鼠的血糖呈上升趋势，最后1周血糖显著升高。与Model相比，PC、JCYSTL-L、JCYSTL-M和JCYSTL-H小鼠的随机血糖无明显变化。随后，检测各组小鼠的肾功能变化，结果显示（图 1B-D），与Control相比，Model小鼠24 h-UPQ、Scr和血清中BUN水平显著升高。与Model相比，PC、JCYSTL-L、JCYSTL-M和JCYSTL-H小鼠的24 h-UPQ、Scr和血清中BUN水平明显降低。
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| 注：与Control比较，##P < 0.01；与Model比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 1 JCYSTL对DKD小鼠血糖和肾功能的影响 Fig. 1 Effect of JCYSTL on blood glucose and renal function in DKD mice |
HE染色结果显示（图 2A，B），Control小鼠肾小球结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐。与Control小鼠相比，Model小鼠肾小球基底膜增厚，系膜增生，肾小管排列紊乱。Masson染色结果显示（图 2C，D），与Control小鼠相比，Model小鼠胶原纤维沉积，Masson染色量化结果显示，胶原蓝染阳性面积显著增加。使用金蝉益肾通络方干预后，以上病理学改变均明显改善。
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| 注：与Control比较，##P < 0.01；与Model比较，**P < 0.01。 图 2 JCYSTL对DKD小鼠肾组织的HE染色（×400）和Masson染色（×400）的影响 Fig. 2 Effects of JCYSTL on HE staining(×400)and Masson staining(×400)of renal tissues in DKD mice |
上皮细胞间质化（EMT）是糖尿病肾病的重要病理学表现之一[13]。因此，研究检测了JCYSTL对DKD小鼠肾组织EMT相关蛋白的表达。Western blot结果显示（图 3），与Control小鼠相比，Model小鼠肾组织ZO-1、E-cad的表达显著下降，VIM、α - SMA的表达显著上升。与Model相比，PC、JCYSTL-L、JCYSTL-M和JCYSTL-H小鼠肾组织ZO-1、E-cad的表达显著上升，VIM、α-SMA的表达显著下降。
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| 注：与Control比较，#P < 0.05，##P < 0.01；与Model比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 3 JCYSTL对DKD小鼠肾组织EMT的影响 Fig. 3 Effect of JCYSTL on EMT in DKD mouse kidney tissue |
检测了JCYSTL对DKD小鼠肾组织KLF4/SMADs通路相关基因和蛋白。RT-qPCR结果显示（图 4A-C），与Control小鼠相比，Model小鼠肾组织Klf4、Smad7 mRNA水平显著下降，Smad3 mRNA水平显著上升。与Model相比，JCYSTL-H小鼠肾组织Klf4 mRNA、Smad7 mRNA水平显著上升，Smad3 mRNA水平显著下降。Western blot结果显示（图 4D-G），与Control小鼠相比，Model小鼠肾组织KLF4、SMAD7的表达水平显著下降，SMAD3水平显著上升。与Model相比，JCYSTL -H小鼠肾组织KLF4、SMAD7的表达显著上升，SMAD3的表达水平显著下降。
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| 注：与Control比较，##P < 0.01；与Model比较，*P < 0.05，**P < 0.01。 图 4 JCYSTL对DKD小鼠肾组织KLF4/SMADs通路的影响 Fig. 4 Effect of JCYSTL on the KLF4/SMADs pathway in renal tissue of DKD mice |
采用高脂饮食联合STZ注射的方法建立的DKD小鼠模型能够很好地模拟人类DKD的发生机制，被广泛应用于DKD的研究[14]。本研究通过建立DKD小鼠模型，使用JCYSTL进行干预，观察JCYSTL对DKD的疗效。24 h-UTP、SCR和BUN是DKD评估肾功能的损害程度的重要指标。本实验结果显示，JCYSTL可以降低DKD小鼠的随机血糖，降低24 h-UTP、SCR和BUN水平，减轻肾脏病理学改变。提示JCYSTL对DKD小鼠肾功能具有显著的保护作用。
肾纤维化是DKD发展为终末期肾病的主要原因，而EMT是导致肾纤维化的重要病理过程[8, 15]。紧密连接蛋白ZO-1维持肾小管上皮细胞的极性和紧密连接的完整性[16]。研究表明，DKD小鼠肾组织中ZO-1的表达降低[17]。ZO-1的减少是肾小管上皮细胞发生EMT的早期标志之一[17]。E-cad是上皮细胞的标志性蛋白，维持细胞间的黏附和上皮细胞的完整性[18]。在肾脏纤维化中，E-cad的减少，细胞间黏附减弱，细胞极性丧失，从而促进细胞向间充质表型转化[19]。VIM是间充质细胞的标志性蛋白，VIM的表达上调表明肾小管上皮细胞已经发生了EMT，转化为具有间充质特性的细胞[13]，可用于评估EMT的进展程度[13，20]。α-SMA是肌成纤维细胞的标志性蛋白[21]。本研究发现，JCYSTL干预后，ZO-1、E-cad的表达显著上升，VIM、α-SMA的表达显著下降。提示JCYSTL能够有效抑制DKD小鼠肾小管上皮细胞间质化。
KLF4是一种能调控细胞分化、增殖、凋亡、组织再生等生理过程的转录因子[22]。研究表明，KLF4在维持正常的肾功能和生理过程中发挥重要的作用。在DKD小鼠中KLF4显著降低[23]。此外，过表达KLF4能显著降低DKD小鼠尿白蛋白水平，缓解DKD[24]。同时，KLF4能够结合SMAD7启动子区域，激活SMAD7的转录[25]。SMAD7是SMAD蛋白家族中的一员，属于抑制性SMAD蛋白[26]。研究表明，SMAD7具有抗纤维化活性，过表达SMAD7可抑制高糖诱导的肾纤维化[27]。KLF4一方面通过上调SMAD7（SMAD抑制分子）抑制SMAD信号通路[28]。另一方面通过与SMAD2/3竞争结合位点或直接抑制SMAD2/3的活性，阻断SMAD信号通路的传导[29]。本研究结果显示，JCYSTL干预能够上调KLF4的表达，同时抑制SMAD信号通路的激活。这些结果表明，JCYSTL可能通过调节KLF4/SMAD通路发挥其对DKD小鼠肾小管上皮细胞间质化的抑制作用。
综上所述，JCYSTL能够通过调节KLF4/SMAD通路抑制DKD小鼠肾小管上皮细胞间质化，为DKD的治疗提供了新的实验依据和潜在的药物靶点。
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2. Key Laboratory of Beijing University of Chinese Medicine, Dongzhimen Hospital, Beijing 100007, China